Настройка простого Light Лист микроскоп для<em> В Тото</em> Визуализация<em> С. Элеганс</em> Разработка
Summary
Этот протокол описывает установку светового листа микроскопом и его реализацию для в естественных изображений C. Элеганс эмбрионов.
Abstract
Быстрые и низкие фототоксические методы визуализации являются предпосылкой для изучения развития организмов в целом. Свет лист на основе микроскопии снижает фото-отбеливание и фототоксические эффекты по сравнению с конфокальной микроскопии, обеспечивая при этом 3D изображения с субклеточной резолюции. Здесь мы представляем установку светового листа на основе микроскопа, который состоит из прямой микроскоп и небольшим набором оптико-механических элементов для генерации светового листа. Протокол описывает, как построить, совместите микроскоп и характеризуют света лист. Кроме того, подробно описывается, как реализовать метод для в целом визуализации С. Элеганс эмбрионов с использованием простого наблюдения камеры. Метод позволяет захват 3D две цветов покадровой фильмов по несколько часов развития. Это должно облегчить отслеживание формы клеток, клеточных делений и меченных белков в течение длительных периодов времени.
Introduction
Формирование и формирование организма включает в себя клеточные движения, изменения формы клеток, деление клеток и дифференцировку клеток. Понимание прогрессирование и координации этих процессов требуют быстрых инструментов образа с трех измерениях возможностей и субклеточном резолюции. Среди методов с этими в естественных условиях возможности визуализации, свет лист освещение микроскопия также называют одного / селективный самолет освещение микроскопия имеет уникальное преимущество получения низких-фототоксичной эффекты и низким фотообесцвечивания 1,2.
В листового освещения микроскопии, образец освещается со стороны световым листа, который выполняет оптического секционирования. Путь освещение и путь обнаружения перпендикулярны друг друга, и свет лист выровнен совпадает с объектной фокальной плоскости объектива обнаружения. Образец помещают на пересечении двух путей,й можно перемещать вдоль оси обнаружения, чтобы 3D визуализации. Только плоскость интерес горит и все точки этой плоскости обнаруживаются в то же время. Это значительно увеличивает скорость сбора и снижает фотообесцвечивания а также фототоксичность по сравнению с конфокальной микроскопии 3.
Практически, лист освещение микроскопии проста в настройке и выравнивания: для двумерной визуализации, сканирования не нужно ни для части обнаружения, ни для освещения части; как метод широким полем с возможностью секционирования, трехмерных изображений может быть получено одним движением оси стадии держа образец.
Здесь мы представляем создание простого света листового микроскопа и его реализации для в целом визуализации С. Элеганс эмбрионов. С. Элеганс эмбрионов хорошо подходят, чтобы жить в естественных условиях ИмаПеренять из-за их прозрачности, инвариант происхождение и стереотипные ячейку позиционирует 4,5. Разработанный свет установка лист на основе стандартного вертикального микроскопа для обнаружения. Протокол, представленные ниже подробно описывается, как построить и выровнять модуль / путь, испытание возбуждения и характеризуют света лист и установите образец для 3D визуализации. Он также приводит примеры покадровой фильмов, приобретенных с установкой на различных штаммов, выражающих флуоресцентных маркеров.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описывает простую настройку света листового микроскопии для в естественных изображений C. Элеганс эмбрионов. Оптические элементы, необходимые для создания и выравнивания светового лист, в том числе лазеров, расширителя пучка, коллимации и фокусирующих линз, может быть легко установлен на оптической скамье. В сочетании с прямой микроскоп для пути обнаружения и камерой, это обеспечивает простое решение для установки света лист микроскопа.
Эта геометрия делает среду образец просто. Живой образец помещают в стеклянную кювету, которая проводится, расположенным и переехал небольшим набором механических частей. Как лист освещение микроскопия широкий методика поле с возможностью секционирования, только один ось моторизованный движение, необходимое для 3D изображений. Это ограничивает требование синхронизации к одному сканирующего элемента и способствует разработке программного обеспечения. По сравнению с ISPIM 6 прямохождение геометрическимры позволяет использовать высокое NA объектива для обнаружения. По сравнению с SPIM установок с объективов в горизонтальной плоскости монтаж образца и изображений из серии эмбрионов легче. В целом, реализация этой техники прост и может быть достигнуто с небольшим опытом работы в оптике. Это более дешевая альтернатива конфокальной микроскопов с преимуществами более высокой скорости и уменьшения фототоксичности но недостатком более низким разрешением осевой.
Мы также разработали простой и воспроизводимый способ монтирования C. эмбрионы Элеганс для естественных изображений с использованием этой системы. Процедура монтажа быстро (15 мин) и подходит для повседневной экспериментов. Для С. томография Элеганс, преимущества этой простой установки как минимум два-складки: (я) в области обработки изображений Тото можно без вращения и, следовательно, 3D-реконструкция проста; (II) образец монтаж легко и множественные эмбрионы могут быть последовательно отображенына том же слайде. Мы показали примеры покадровой фильмов с достаточной временным разрешением для наблюдения деления клеток и изменения формы клеток. Власть света листового микроскопии для изучения C. разработка Элеганс также был недавно показано другими 6, 7, 8. Таким образом, этот метод будет очень полезно для изучения морфогенеза и паттерна С. Элеганс эмбрионов.
Может эта система также может быть использован для анализа развития других модельных организмов? Важно признать, что реализация листового освещения микроскопии для малого и прозрачной организма, таких как C. Элеганс является менее строгим, чем для более крупных организмов, таких как эмбрионов дрозофилы. в целом визуализации дрозофилы обычно требуется вращение и с несколькими представлениями реконструкции 9, 10. Возбуждение с двух сторон с коллинеарных объективных возбуждения линз также может снижение теневые эффекты, вызванные ослабляетсяион света 11. Тем не менее, установка, представленные здесь, все еще приспособлены к одной стороне изображение эмбрионов Drosophila, с низкой отбеливания и низкой photoxicity. Эта установка также может быть полезно изображения малого и прозрачных эмбрионах, таких как асцидий или рыбок данио.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим всех членов Lenne и Бертран лаборатории, в частности Оливье Блан для разработки программного обеспечения и Жереми Capoulade для обсуждения. Мы также благодарим изображений объекта PICsL-IBDM, в частности Клод Моретти и Brice Detailleur за технической поддержкой.
Эта работа была поддержана ATIP грантов от CNRS (до П.-ФЗ и VB), Labex ИНФОРМ грант (П.-ФЗ и VB) и гранта от Sanofi-Aventis (в VB). Мы признаем, Франция-Bioimaging инфраструктуры, поддерживаемый Национальным агентством де-ла-Recherche (ANR-10-INSB-04-01, называют «Investissements d'Avenir").
Materials
| SPIM | |||
| Detection | |||
| upright microscope | ZEISS | Axiophot 1 | |
| 100xW objective (NA 1.1, W.D. 2.5mm) | NIKON | ||
| EMCCD back illuminated | ANDOR | DU-885K-CS0-#VP | |
| Illumination | |||
| LASER 488nm / 60mW | TOPTICA | iBeam smart | |
| LASER 405nm / 120mW | TOPTICA | iBeam smart | |
| LASER 561nm / 500mW | COBOLT | JIVE 500 | for time lapse imaging, 50 or 100mW is enough |
| filter Quad line laser rejectionband ZET 405/488/561/638 | AHF | F57-405 | |
| Dichroic 405 | AHF | F38-405 | |
| Dichroic 488 | SEMROCK | Di01-R488 | |
| AOTF | AA | AOTFnC-400.650-TN | |
| mirror | |||
| lens 50mm | THORLABS | telescope 5X | |
| lens 200mm | THORLABS | telescope 5X | |
| periscope | THORLABS | RS99/M | |
| cylindrical lens f=100mm | THORLABS | ACY254-100-A | |
| 10X NA 0,3 | NIKON | ||
| xyz stage | NEWPORT | ||
| Sample | |||
| Bacto Agar | Bectkton Dickinson | 214010 | 5% in water |
| Poly-L-Lysine solution | Sigma | P8920 | |
| Capillaries GC100F-10, 1.0mm oD, 0,58mm ID, 100 mm L | Havard Appartus | 30-0019 | |
| Aspiration tube (mouth pipette) | Dutsher | 55005 | |
| M9 medium: | |||
| KH2PO4 (3g/L) | Any supplier | ||
| Na2HPO4 (6g/L) | Any supplier | ||
| NaCL (5g/L) | Any supplier | ||
| MgSO4 (1mM final) | Any supplier | ||
| cuvette holder | HOME MADE | made by Brice Detailleur | |
| sample holder | HOME MADE | made by Claude Moretti | |
| x stage | NEWPORT | ||
| coverslip 50x20x1mm | MARIENFELD | cut then in 10x20x1mm | |
| piezo electric stage with amplifier/controller | PI | P-622.ZCD / E-625.CR | |
| cuvette 40mmx40mmx10mm | HELLMA | 704.002-OG.40 mm- 10mm high | |
| Diamond Point Glass Marking Pencil | VWR | ||
| Software | |||
| C++ (Qt) home made software | developed by Olivier Blanc and Claire Chardès, available on request. Alternative solutions: micromanager or labview |
References
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305, 1007-1009 (2004).
- Huisken, J., Stainier, D. Y. Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology. Development. 136, 1963-1975 (2009).
- Reynaud, E. G., Krzic, U., Greger, K., Stelzer, E. H. Light sheet-based fluorescence microscopy: more dimensions, more photons, and less photodamage. HFSP J. 2, 266-275 (2008).
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Dev Biol. 100, 64-119 (1983).
- Hardin, J. Imaging embryonic morphogenesis in C. elegans. Methods Cell Biol. 106, 377-412 (2011).
- Wu, Y., et al. Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 17708-17713 (2011).
- Giurumescu, C. A., Kang, S., Planchon, T. A., Betzig, E., Bloomekatz, J., Yelon, D., Cosman, P., Chisholm, A. D. Quantitative semi-automated analysis of morphogenesis with single-cell resolution in complex embryos. Development. 139, 4271-4279 (2012).
- Gao, L., Shao, L., Higgins, C. D., Poulton, J. S., Peifer, M., Davidson, M. W., Wu, X. F. Noninvasive Imaging beyond the Diffraction Limit of 3D Dynamics in Thickly Fluorescent Specimens. Cell. 151, 1370-1385 (2012).
- Krzic, U., Gunther, S., Saunders, T. E., Streichan, S. J., Hufnagel, L. Multiview light-sheet microscope for rapid in toto imaging. Nat Methods. 9, 730-733 (2012).
- Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy. Nat Methods. 9, 755-763 (2012).
- Huisken, J., Stainier, D. Y. Even fluorescence excitation by multidirectional selective plane illumination microscopy (mSPIM). Opt Lett. 32, 2608-2610 (2007).
