Configurando um Microscópio folha de luz simples para<em> Em Toto</em> Imagem de<em> C. elegans</em> Desenvolvimento

1. Configuração da Folha de Luz eo Caminho de Detecção A Figura 1 apresenta um esquema geral da configuração óptica. Coloque e fixe o microscópio e os lasers na mesa óptica. Combine lasers 488 nm, 561 nm e 405 nm, com os correspondentes espelhos dicróicas. Após os espelhos dicróicos, os lasers têm de ser precisamente co-alinhadas. Note-se que a escolha dos comprimentos de onda de laser, os espelhos dicróicos, filtros ópticos e é determinada a partir dos espectros de absorção dos marcadores fluorescentes específicos utilizados nas experiências. Coloque o filtro sintonizável acústico-ótico (AOTF). Use a folha de teste fornecido pelo fornecedor para ajustar a frequência ea potência do AOTF. Quando bem alinhada, cerca de 90% da energia do laser é transmitido a um máximo de ajuste tal como medido por um powermeter. Note que alguns lasers pode ser totalmente controlado por software, o que poderia tornar o AOTF desnecessário. Coloque e fixeo telescópio. Note-se que o telescópio é composta por duas lentes que ampliam o feixe com uma largura igual ou maior do que o diâmetro da abertura da parte de trás da lente objectiva iluminação. A lente com distância focal menor deve vir em primeiro lugar. Lugar, alinhar e fixar o periscópio trazendo para cima do percurso óptico mais perto da abertura da parte de trás da lente cilíndrica. Note-se que os dois espelhos do periscópio são montados de uma forma que o seu eixo longo está colocando na inclinação do espelho para refletir o feixe totalmente expandida. Coloque a lente cilíndrica próxima da saída de periscópio. Note-se que a lente cilíndrica focaliza o feixe em um sentido e deixa colimada na outra direção, formando assim uma folha de luz. Recentrar a folha de luz resultante usando a lente objetiva iluminação. Note-se que o ponto focal imagem da objectiva de iluminação deve coincidir com o ponto focal do objecto o objectivo de detecção. Projeto do feixeem uma tela (por exemplo, uma parede) em uma longa distância. Mova o objetivo de iluminação ao longo do eixo do feixe de iluminação para obter na tela contornos nítidos da folha de luz. Coloque a linha quad (405/488/561/638) filtro de emissão no lugar reservado no microscópio (cubo). Coloque a câmara EMCCD na porta de saída do microscópio. Fixar o primeiro estágio de translação manual sobre o palco de microscópio por meio de parafusos em furos na platina do microscópio. Note-se que a borda da plataforma de translação tem de ser posicionado a cerca de 2 cm de distância a partir do centro da platina do microscópio, de modo a que a tina é centrado por baixo da lente objectiva de detecção. Fixar o segundo estágio de translação manual sobre o primeiro. As direções das duas etapas tem que ser perpendicular (X e Y traduções). Fixar a fase Z piezoeléctrico no topo das duas fases anteriores. Note-se que uma plataforma motorizada pode ser utilizado em vez do estágio piezeléctrico. Fixe o holde tinar (ver Figura 2), na parte superior das fases. A cuvete irá, assim, ser colocado na intersecção do caminho de iluminação e o caminho de detecção, que são perpendiculares um ao outro. 2. Verificar a folha de luz Encha uma tina de vidro com solução fluorescente, e colocá-lo no porta-amostras no cruzamento dos dois caminhos ópticos. A folha de luz é assim visível. Tem de ser horizontal, e simétrico / centrada em relação à lente objectiva de detecção. Retirar a lente cilíndrica e adquirir uma imagem para medir a espessura da folha de luz. Note-se que a espessura da folha de luz depende da abertura numérica (AN) da iluminação da lente objectiva (cerca de 3-4 mm para NA = 0,3). Note-se que para uma dada lente, a espessura da folha, a luz pode ser aumentada reduzindo o tamanho do feixe de entrar na abertura traseira, com uma fenda. Note-se que as microesferas fluorescentes pode ser utilizado para medir o machadoial e resolução lateral do microscópio. Volte a colocar a lente cilíndrica antes de iniciar o experimento. 3. A montagem de C. elegans Embriões Os passos seguintes são apresentados na Figura 3. Use uma caneta de marcação de diamante para cortar um pedaço de uma lâmina de vidro de 10 x 20 x 1 mm. Prepare 5% bacto-agar na água, fervê-lo e mantê-lo em um bloco de aquecimento a 60 ° C. Adicionar 50 ul de poli-L-lisina sobre um lado da peça de corte da lâmina, deixá-lo secar. Coloque uma lâmina de microscópio no banco e corrigi-lo. Justapor a peça de corte de lâmina com a lâmina fixa e adicionar uma gota de agar derretido no topo. Esprema o agar usando outra lâmina de microscópio limpa para obter um bloco de ágar fina. Permitir que o bloco de ágar para secar antes de retirar o top slide. Cortar a almofada de ágar sobre o lado da lâmina fixa, de modo a deixar um excesso de cerca de 3 mm of agar e remova cuidadosamente a lâmina fixa. Adicionar 50 mL de poli-L-lisina sobre o agar e deixe secar completamente. Coloque vermes grávidas em meio M9 em um vidro de relógio. Cortar os vermes ao nível da vulva com um bisturi para libertar os embriões. Sob um binóculo identificar os embriões na fase de interesse e recolhê-las usando uma pipeta microcapilar. Colocar os embriões na parte do agar revestidos com poli-L-lisina, que se projecta a partir da peça de corte da lâmina. Coloque os embriões apenas junto à fronteira do slide. Não posicione os embriões na fronteira do agar, porque não vai ser estável o suficiente. Remover cuidadosamente o líquido, de modo que os embriões vai ficar sobre a camada de poli-L-lisina. Alinhar rapidamente os embriões para evitar a dessecação. Colocar a lâmina de corte em um prato de plástico Petri e adicione delicadamente meio M9 para cobrir o slide. Verifique sob um binóculo que os ovos ainda estão presos no ágar. </li> 4. Gravação de C. Desenvolvimento elegans Fixar a preparação anterior (corte deslizante, além de embriões de agar) no suporte de amostra e coloca-se numa cuvete. Figura 4 descreve o titular caseiro e A Figura 5 mostra uma vista da tina em contexto de observação. Fixar a cuvete na fase piezoeléctrico. Identificar a posição dos embriões com iluminação de campo brilhante. Inicie o software feito em casa controlando a AOTF, a câmera eo estágio piezoelétrico. Note-se que um software livre, tal como micromanager, também pode ser utilizado. Selecione a linha de laser e de energia (AOTF). Ajustar a posição da folha de luz utilizando a fase três instruções de suporte da lente cilíndrica e a lente de iluminação. Mover o palco ao longo da direcção lateral (X) para obter o sinal mais brilhante. Ajustar então a posição Z da folha de luz, e a posição longitudinal (Y) para obter the melhor relação sinal-ruído. Note-se que a posição do foco folha de luz pode ter de ser ajustada a partir de um embrião de um outro para corrigir as diferenças de comprimento de caminho de luz. Para adquirir imagens de lapso de tempo, selecione o tempo de exposição, o ganho, o tempo entre duas imagens, bem como o número de imagens a serem adquiridas, eo poder do laser. Para 2 aquisição de cores, selecione uma segunda linha de laser. Duas imagens coloridas são adquiridos de forma consecutiva. Para adquirir pilha az, selecione também a distância entre as duas fatias, eo início e fim posições do piezoelétrico.