הגדרת מיקרוסקופ גיליון אור פשוט עבור<em> בטוטו</em> הדמיה של<em> ג elegans</em> פיתוח

1. הגדרת גיליון האור ונתיב איתור איור 1 נותן תכנית כללית של ההתקנה האופטית. מקום ולתקן את המיקרוסקופ והלייזרים על השולחן האופטי. משלב לייזרים 488 ננומטר, 561 ננומטר וננומטר 405 עם מראות dichroic המתאימות. אחרי מראות dichroic, הלייזרים צריכים להיות דווקא לשתף מיושרים. שים לב כי הבחירה של אורכי גל הלייזר, מראות dichroic, ומסננים אופטיים נקבעת מספקטרום הספיגה של תוויות ניאון הספציפיות המשמשות בניסויים. הנח את מסנן אקוסטי האופטי מתכונן (AOTF). השתמש בגיליון הבדיקה המסופק על ידי הספק כדי להתאים את התדירות והעצמה של AOTF. כאשר מיושר היטב, על 90% מכוח הלייזר מועברים בכוונון מרבי, כפי שנמדדו על ידי powermeter. שים לב שחלק הלייזרים ניתן לשלוט באופן מלא על ידי תוכנה, אשר יכול להפוך את AOTF מיותר. מקום ולתקןטלסקופ. שים לב שהטלסקופ מורכב משתי עדשות המרחיבות את הקרן לרוחב שווה או גדול יותר מהקוטר של הצמצם האחורי של העדשה האובייקטיבית התאורה. העדשה עם אורך המוקד הקטן ביותר צריכה לבוא קודם. מקום, ליישר ולתקן את פריסקופ להביא כלפי מעלה הנתיב האופטי קרוב יותר לצמצם האחורי של העדשה הגלילית. שים לב ששתי המראות של פריסקופ הם רכובים באופן שהציר הארוך שלהם מנחית על הנטייה של המראה על מנת לשקף את הקרן הרחיבה באופן מלא. מניחים את העדשה הגלילית בסמוך ליציאת פריסקופ. שים לב שהעדשה הגלילית מתמקדת הקרן בכיוון אחד ומשאירה אותו collimated בכיוון האחר, וכך יוצר גיליון אור. ולמקד את גיליון אור וכתוצאה מכך על ידי שימוש בעדשה אובייקטיבית התאורה. שים לב שנקודת המוקד של התמונה אובייקטיבי התאורה צריכה לחפוף עם מוקד האובייקט של מטרת זיהוי. להקרין את הקרןעל מסך (למשל קיר) במרחקים ארוכים. הזז את מטרת התאורה לאורך ציר אלומת התאורה להשיג בקווי המתאר החדים המסך של גיליון האור. למקם את הקו מרובע (405/488/561/638) פליטה לסנן במקום שמורות במיקרוסקופ (הקובייה). מקם את המצלמה EMCCD בנמל פלט מיקרוסקופ. תקן את שלב התרגום הידני הראשון על הבמה מיקרוסקופ על ידי ברגים בחורים שנקדחו בבמת מיקרוסקופ. שים לב שקצה הבמה התרגום צריך להיות ממוקם בכ -2 ס"מ ממרכז הבמה מיקרוסקופ, כך שקובט מרוכז מתחת לעדשת מטרת זיהוי. תקן את שלב התרגום הידני השני על הראשון. הכיוונים של שני שלבים צריכים להיות בניצב (תרגומי X ו-Y). תקן את השלב פיזואלקטריים Z בחלק העליון של שני השלבים הקודמים. שים לב ששלב ממונע יכול לשמש במקומו של השלב פיזואלקטריים. תקן holde קובטr (ראה איור 2) בחלק העליון של השלבים. קובט יהיה ובכך להיות ממוקם בצומת של דרך ההארה ודרך זיהוי, שהם ניצבים זה לזה. 2. בדיקת גיליון האור מלא קובט זכוכית עם פתרון ניאון, ולמקם אותו על בעל המדגם בצומת של שני נתיבים אופטיים. גיליון האור וכך גלוי לעין. זה חייב להיות אופקי, וסימטרי / מרוכז ביחס לעדשת מטרת זיהוי. הסר את העדשה הגלילית ולרכוש תמונה כדי למדוד את העובי של גיליון האור. שים לב שהעובי של גיליון האור תלוי בצמצם המספרי (NA) של העדשה האובייקטיבית התאורה (כ 3-4 מיקרומטר לNA = 0.3). שים לב שעבור עדשה נתון, העובי של אור גיליון יכול להיות מוגבר על ידי הקטנת הגודל של הקרן נכנסת בגב הצמצם עם שסע. שימו לב שזעיר מניאון יכול לשמש כדי למדוד את הגרזןרזולוציה ial ורוחב של מיקרוסקופ. להחזיר את העדשה הגלילית לפני תחילת הניסוי. 3. ההרכבה של ג elegans עוברים השלבים הבאים הם בתמונה באיור 3. השתמש בעט סימון יהלומים כדי לחתוך חתיכת זכוכית שקופית של מ"מ 10 x 20 x 1. הכן 5% bacto-אגר במים, להרתיח אותו ולתחזק אותו בבלוק דוד ב60 ° C. הוסף 50 μl של פולי-L-ליזין בצד אחד של פיסת השקופית לחתוך, לאפשר לו להתייבש. מקום שקופית מיקרוסקופ על הספסל ולתקן את זה. לשים בסמוך פיסת השקופית לחתוך עם השקופית קבועה ולהוסיף טיפה של אגר נמסו בחלקו העליון. לסחוט את אגר באמצעות אחר שקופית מיקרוסקופ נקייה כדי לקבל משטח אגר דק. לאפשר למשטח אגר להתייבש לפני הסרת השקופית העליונה. חותכים את משטח אגר בצד של השקופית קבועה על מנת להשאיר עודף של כ 3 מ"מ oאגר ו ולהסיר בעדינות את השקופית קבועה. הוסף 50 μL של פולי-L-ליזין על אגר ולתת לו להתייבש לחלוטין. שים תולעים הרה להולדת במדיום M9 בזכוכית שעון. חותכים את התולעים ברמה של הפות עם אזמל כדי לשחרר את העוברים. תחת משקפת לזהות את העוברים בשלב של עניין ולאסוף אותם באמצעות פיפטה microcapillary. מניחים את העוברים על חלק מאגר מצופה פולי-L-ליזין שבולט מחתיכת השקופיות לחתוך. מניחים את העוברים רק בסמוך לגבול של השקופית. אל תציב את העוברים בגבול של אגר, כי הם לא יהיו יציבים מספיק. הסר בעדינות את הנוזל כך שהעוברים ידבקו על שכבת פולי-L-ליזין. במהירות ליישר את העוברים, כדי למנוע התייבשות. מניחים את השקף לחתוך בצלחת פטרי פלסטיק ובעדינות להוסיף בינוני M9 כדי לכסות את השקופיות. בדוק תחת משקפת שהביצים עדיין תקועות על אגר. </li> 4. הקלטה של ג פיתוח elegans תקן את ההכנה הקודמת (שקופיות לחתוך, אגר בתוספת עוברים) בבעל המדגם ולמקם אותו בקובט. איור 4 מתאר את בעל תוצרת בית ואיור 5 מראה נוף של קובט בהקשר תצפית. תקן את קובט על הבמה פיזואלקטריים. לזהות את מיקומו של עובר עם תאורה בשדה בהיר. הפעל את תוכנת תוצרת בית השליטה AOTF, את המצלמה ואת הבמה פיזואלקטריים. שים לב שתוכנה חופשית, כגון micromanager, יכולה לשמש גם. בחר את הקו והכוח (AOTF) הלייזר. להתאים את המיקום של גיליון האור באמצעות שלב 3 כיווני תמיכה העדשה הגלילית ועדשת התאורה. להזיז את הבמה יחד בכיוון לרוחב (X) כדי לקבל את האות הבהירה. התאם אז Z מיקום של גיליון האור, ואת מיקום האורך (Y) כדי להשיג הדואר האות הטוב ביותר יחס רעש. שים לב שהעמדה של מוקד גיליון האור ייתכן שתצטרך להיות מותאמת מעובר אחד למשנו כדי לתקן את ההבדלים באורכים נתיב אור. לרכישת זמן לשגות תמונות, לבחור את זמן החשיפה, להשיג, זמן בין שתי תמונות, כמו גם את מספר התמונות שרכשו, ואת כוח הלייזר. לרכישה 2 צבע, בחר קו לייזר שני. שתי תמונות צבע נרכשות ברציפות. כדי לרכוש מחסנית AZ, בחר גם את המרחק בין שתי פרוסות, והתחלה ואת סוף העמדות של פיזואלקטריים.