のための簡単​​なシート光顕微鏡を設定する<em>トトで</em>イメージングの<em> C.虫</em>開発

1。シート光と検出経路の設定 図1は、光学セットアップの一般的なスキームを提供します。 光学テーブル上の顕微鏡とレーザーを配置し、固定します。 レーザーの488 nmの、561 nmおよび対応するダイクロイックミラーを持つ405 nmのを兼ね備えています。ダイクロイックミラーの後、レーザーが正確に共同揃えなければならない。レーザ波長は、ダイクロイックミラー、及び光学フィルタの選択は、実験で使用される特定の蛍光標識の吸収スペクトルから決定されることに留意されたい。 音響光学チューナブルフィルタ（AOTF）を配置します。 AOTFの周波数とパワーを調整するためにサプライヤが提供するテストシートを使用してください。よく揃うと、レーザパワーの約90％はパワーメータにより測定される最大同調で送信される。 AOTFを不要にする可能性が、いくつかのレーザは、完全にソフトウェアによって制御することができることに留意されたい。 プレイスと修正望遠鏡。望遠鏡は、照明対物レンズの後開口部の直径よりも等しいか大きい幅にビームを拡大つのレンズから構成されていることに留意されたい。最小焦点距離を持つレンズは最初に来るべきです。 場所、近いシリンドリカルレンズの背面開口部に上方向の光路をもたらす潜望鏡を整列させ、固定します。潜望鏡の2ミラーは、その長軸が完全に展開されたビームを反射するために、ミラーの傾きに敷設されているような方法で実装されていることに注意してください。 次の潜望鏡出口にシリンドリカルレンズを配置します。シリンドリカルレンズが一方向にビームを集束し、それによって光シートを形成し、他の方向にコリメート残すことに留意されたい。 照明対物レンズを用いて得られる光シートに再び焦点を合わせる。照明対物レンズの像焦点が検出目的のオブジェクト焦点と一致する必要があることに注意してください。ビームを投影長距離の画面（例えば壁）に。光シートの画面シャープな輪郭に取得するために、照射ビーム軸に沿って照明の目的を移動します。 顕微鏡（キューブ）内に貯留場所にクワッドライン（405/488/561/638）発光フィルタを配置します。 顕微鏡出力ポートでEMCCDカメラを配置します。 顕微鏡ステージに掘削穴にネジで顕微鏡のステージ上の最初の手動の平行移動ステージを固定します。キュベットは、検出対物レンズの下にセンタリングされるように、並進ステージのエッジが、離れて顕微鏡ステージの中心から約2cmに配置しなければならないことに留意されたい。 最初の1に第2の手動移動ステージを固定します。 2ステージの方向は（XとYの変換）に対して垂直でなければならない。 前の2つのステージの上部にZピエゾステージを固定します。電動ステージではなく、圧電ステージの使用できることに注意してください。 キュベットholdeを修正しました。rはステージの上部にある（ 図2参照）。キュベットは、このように互いに垂直である、照明経路及び検出経路の交点に配置される。 2。シート光を確認する蛍光性溶液でガラスキュベットに充填し、二つの光路の交差点に試料ホルダー上に置きます。シート光は、このように表示されている。これは、水平にあり、対称/検出対物レンズに対して中心。 シリンドリカルレンズを取り外し、光シートの厚さを測定するための画像を取得する。光シートの厚さは照明対物レンズ（NA = 0.3で約3〜4程度）の開口数（NA）に依存していることに注意してください。与えられたレンズには、光シートの厚みがスリットで逆アパーチャに入射するビームのサイズを減少させることによって増加させることができることに留意されたい。蛍光ミクロスフェアが斧を測定するために使用できることに注意してください顕微鏡のIALと横の解像度。 実験を開始する前に、シリンドリカルレンズを戻す。 3℃の取り付け虫胚 以下のステップを図3に描かれている。 10×20×1mmのガラススライドの一部をカットするダイヤモンドマーキングペンを使用してください。 水中の5％のバクト寒天を準備し、それを沸騰し、60℃でヒーターブロックでそれを維持するスライドの切断片の片面にポリ-L-リジンの50μl加え、それを乾燥させます。 ベンチで顕微鏡スライドを配置し、それを修正する。 固定スライドとスライドの切断片を並置し、上部の溶融寒天の一滴を追加します。薄い寒天パッドを得るために、別のきれいな顕微鏡スライドを使用した寒天を絞る。 寒天パッドが一番上のスライドを削除する前に乾燥することができます。 約3ミリメートルOの過剰を残すために、固定スライドの側面にある寒天パッドをカットF寒天、ゆっくりと一定のスライドを削除します。 寒天上のポリ-L-リジンの50μLを追加し、完全に乾燥させます。 時計皿にM9培地で妊娠ワームを置く。 胚を解放するために、メスと外陰部のレベルでワームをカット。 両眼の下で、目的の段階で胚を識別し、マイクロキャピラリーピペットを使用してそれらを集める。 スライドの切断片から突出したポリ-L-リジンでコーティングされた寒天の一部に胚を置きます。ただ、次のスライドの国境に胚を置きます。彼らは十分に安定していませんので、寒天の境界に胚を配置しないでください。胚は、ポリ-L-リジン層の上に固執するように優しく、液体を除去します。 素早く乾燥を避けるために、胚を合わせます。 プラスチックシャーレ中のカットのスライドを置き、ゆっくりとスライドをカバーするM9培地を追加します。 卵がまだ寒天上に立ち往生している両眼の下に確認してください。 </李> Cの 4。録音虫の開発試料ホルダーの前の準備（カットスライド、寒天プラス胚）を固定し、キュベット内に配置します。 図4に、自家製のホルダーを説明し、 図5は、観測コンテキストでキュベットの図を示している。 圧電ステージにキュベットを修正します。 明視野照明と胚の位置を特定します。 AOTF、カメラと圧電ステージを制御するホームメイドのソフトウェアを起動します。例えば细としてそのフリーソフトウェア、なお、使用することもできる。 レーザ線と電源（AOTF）を選択します。 シリンドリカルレンズと照明レンズを支持3方向ステージを用いて光シートの位置を調整します。最も明るい信号を得るために、横方向（X）に沿ってステージを移動します。目を取得するために、光シートのZ位置、縦位置（Y）を調整対雑音比E最良の信号。光学シート焦点の位置は、光路長差を補正するために、1つの胚から別に調整する必要があり得ることに留意されたい。 タイムラプス画像を取得するために、2つの画像、並びに、取得する画像の数、レーザパワーとの間の時間を得るため、露光時間を選択する。 2色取得のために、第二のレーザ線を選択します。二つのカラー画像を連続して取得される。 AZスタックを取得するために、また、2つのスライス間の距離、および開始と圧電の位置と終了位置を選択します。