Fizyolojik Akış Koşullarında Sirkülasyon Hücre Kemokin-yönettiği Ekstravazasyon Eğitim Bir Roman Üç boyutlu Akış Odası Cihazı
Summary
Üç boyutlu akış odası cihaz bir roman<em> In vitro</emGerilmenin fizyolojik koşullar altında dolaşan hücre ekstravazasyonu çağlayan nicel ve adım adım değerlendirilmesi için> teknoloji. Cihaz bu nedenle hücre göçü temel, klinik öncesi ve klinik çalışmalar için önemli bir ihtiyaç doldurur.
Abstract
Kan hücreleri, dolaşımdaki ekstravazasyonu kök hücre hedef arama ve tümör metastaz da dahil olmak üzere bir çok fizyolojik ve patofizyolojik işlemlerde, merkezi bir rol oynar. Üç boyutlu akış odası cihazı (bundan sonra 3 boyutlu cihaz) fizyolojik kayma gerilmesi yeniden ve hücre ekstravazasyon kaskad her adımı miktarının belirlenmesine imkân tanır in vitro teknolojisinde bir roman. 3D Cihaz ilgi hücreleri kayma gerilimi altında sirküle edildiği bir üst bölme ve ilgilenilen Kemo-atraktanlar içeren statik gözenekli bir alt bölme oluşur. Iki bölme endotel hücreleri (EC) bir tek tabaka ile kaplanmış gözenekli uçlar ile ayrılır. Ilgi microenvironmental hücreleri ile isteğe bağlı ikinci ekleme EC tabakası altında hemen yerleştirilebilir. Bir gaz değişimi birimi en uygun CO2 gerilim muhafaza sağlar ve sırasında hücreleri veya bileşikler eklemek veya çekilme için bir erişim noktası sağlardeney. Test hücreleri, bir peristaltik pompa ile kontrol istenilen kesme stresi (akış oranı) üst bölmesine dolaşır. Deneyin sonunda, dolaşan ve göç eden hücreler ileri analiz için toplanır. 3D Cihaz kemokin gradyanlar, kayma stresine direnç, kümelenme oluşumu ve hücre yaşamını tepki olarak kesme baskısı altında EC göçü ve yapışması haddeleme hücre incelemek için kullanılabilir. Buna ek olarak, isteğe bağlı ikinci uç EC ve mikroçevredeki hücreleri arasındaki karışma etkisi incelenmiştir sağlar. 3D cihazın translasyonel uygulamaları ilaç adayları test içeren hedef hücre göçü ve damardan bir enjeksiyondan sonra hücrelerin in vivo davranış tahmin. Böylece, yeni 3D cihazın cep ekstravazasyon aracılık moleküler mekanizmaları incelemek için çok yönlü ve ucuz bir araçtır.
Introduction
Hücre ekstravazasyon dolaşan hücreler kan çıkmak ve vücutta birçok fizyolojik tepkiler önemli bir bileşeni olan süreçtir. Süreç örnek olarak, doku rejenerasyonu için de önemlidir, kan damarları (veya intravenöz enjekte) içine dokulardan seferber tedavi hücreler damar yoluyla göç ve yaralanma veya dejenerasyon sitelere dolaşımını çıktığınızda. Ekstravazasyon da inflamasyon, bağışıklık ret, otoimmünite ve tümör metastazı dahil olmak üzere birçok hastalığın, patogenezinde önemli bir bileşenidir.
Ekstravazasyon fizyolojik akış koşulları altında endotel hücreleri ile hücreleri (EC) dolaşımdaki etkileşimi içeren karmaşık bir çok adımlı bir işlemdir. Bu süreç (a) hücre çelik, AT luminal yüzeye (b) firma yapışma ve AB genelinde (c) göçü oluşmaktadır. Önemli olarak, ekstravazasyon kaskad her aşama c bir alt kümesi tarafından düzenlenirell tip-spesifik ve türe özel moleküller. Ancak, belirli bir hücre alt gruplarının damar dışına düzenleyen ayrıntılı moleküler mekanizmalar tam olarak büyük ölçüde kan koşulları yansıtan teknik zorluk, anlaşılamamıştır. Yeni 3D cihaz bu teknik zorlukların üstesinden gelmek ve hücre göç biyoloji anlayışımızı artıracak yapılacak deneyler izin vermek için tasarlanmıştır burada açıklanan.
Hücre göçü aracılık molekülleri önemli tedavi hedeflerdir. Özel hücre tiplerinin göç kontrol moleküler olayların detaylı bir anlaşılması tedavi promosyon veya ekstravazasyon inhibisyonu için yeni hedefler belirlenmesinde yardımcı olacaktır. Örneğin, yaralanma veya dejenerasyon siteleri doğru tedavi kök hücrelerin göç (, yetişkin neonatal hatta fetal dokulardan elde edilen olsun) geliştirmek müdahaleler doku rejenerasyonu büyük yarar olacaktır.Pluripotent kaynaklardan elde edilen hücreler de dahil olmak üzere tedavi kök hücreler, in vitro üretimi ve ex vivo manipüle erişkin kök hücreler (, genişletilmiş genetik manipüle ve çeşitli enzimler ile ön işlem) 1 de artan bir ilgi vardır. Böylece, terapötik amaçlar için kullanılır önce kök hücrelerin kalitesini değerlendirmek için yeni teknolojileri için bir ihtiyaç vardır. Diğer parametreler arasında, hücreler, multifokal bozuklukların tedavisinde kök hücreleri 2 arasında intravenöz gerektirebileceğinden, verimli bir şekilde dolaşım çıkmak mümkün olmalıdır. Gerçekten de, kök hücre biyolojisi mevcut zorluklardan biri son derece düşük verimlilik üstesinden gelmek için hangi doku hasarı 3-6 sitelere kök hücre ev, kök hücre göç anlayışımızda bu boşluğu konuşulması gerektiğini vurgulayarak ile. Bunun aksine, stratejiler spesifik hedef arama molekülleri hedef bloğu tarafından hücre göçü de tedavisinde yararlı olacağıinflamatuar ve oto-immün hastalıklar ve metastatik kanser gibi. Böylece, hücre göçü ve damar dışına boyunca piyasada bulunan hücreler ve AB arasındaki etkileşimleri arabuluculuk moleküler mekanizmaları anlamak öteleme tıp ve ilaç keşfi yanı sıra temel bilim alakalı.
Hücre göçü farklı yönlerini incelemek için kullanılabilir bir dizi yöntem yok. Ancak, bu yöntemler yeni 3D cihazla aşılabilir eksiklikleri var.
Hayvan modelleri:
Bu immün sistemi baskılanmış fareler ve genetik olarak manipüle fare gibi hayvan modelleri, in vivo insan hücrelerinin göç incelemek için yararlı araçlar olmuştur. Ancak, bu modeller bir önemli dezavantajı insan hücrelerinde birçok hücre yüzey molekülleri türe özgü dizisi farklılıklar nedeniyle kısmen, fare EC mevcut adezyon molekülleri ile kötü etkileşim olmasıdır. Böylece kemirgenler kullanımı çalışmainsan hücre göçü otantik insan organ-spesifik vasküler yataklarda olayları yansıtmak pek mümkün değildir. Buna ek olarak, in vivo modellerde ilaç adayları yüksek verimli tarama için uygun değildir. Homing hücre incelemek için kullanarak in vivo modellerde geleneksel zor roman homing molekülleri belirlemek ve hedef yapmak, ekstravazasyon kademeli farklı adımlar arasında ayrımcılık yok. Intravital mikroskopi yaklaşım bu ihtiyacı gidermek için geliştirilmiştir ve bilgilendirici olmuştur, ancak, bu teknik son derece zaman ve 7,8 emek yoğundur.
Statik göçü deneyleri:
Transwell ya da gözenekli bir membran ve çapraz Boyden odasının ölçümlerde, hücre göçü yaygın olarak göç çalışmalarında kullanılmaktadır. Tahlil, hücre aracılı kemokin göç da hücre motilitesi ve hücre-hücre dışı matris (ECM), etkileşimleri sadece incelemek için kullanılabilir ki avantajına sahiptir, fakatgözenekli zarlar yetişen bir AT tek tabaka üzerinde. Ne yazık ki, statik koşullar altında fenotip ve AT fonksiyonu fizyolojik akışı 9,10 altında olanlardan önemli ölçüde farklıdır. Böylece, Transwell deneyleri meydana gelen kemotaktik olayları sadakatle kayma stres altında göç hücreleri ve AB arasındaki etkileşimleri taklit yok. Buna ek olarak, genel sürecine seçicilik ekstra bir boyut katıyor homing çağlayan "haddeleme" adım, statik Transwell deneyleri oluşmaz. Bu teknoloji ile, AT tek tabaka üzerinde çeşitli kemokin aracılı hücre göçü niceliksel değerlendirilmesi izin verir iken Böylece, bu in vivo kan akışını taklit olarak kesme baskısı sağlamak için kendi yetersizlik ile sınırlıdır.
Kayma stres altında Tahliller:
Duvar kayma gerilmesi EC fonksiyonu 9,10 düzenlenmesinde önemli bir rol oynadığı bilinmektedir. Kesme kuvvetlerinin sinyal kaskadlar hızlı aktivasyon, transc nedenription faktörler ve EC 11,12 diferansiyel gen ekspresyonu. Bu bilgiler yapışma deneyleri bir sonraki nesil gelişmesine yol açmıştır – paralel laminer akış odaları ve kılcal – haddeleme çalışma ve kayma gerilmesi 7,13 koşulları altında EC hücrelerinin yapışma için. Bu deneyleri için sınırlayıcı faktör sadece haddeleme ve yapışma ölçebilirsiniz olduğunu, ancak göç etmek için giderdim bir yapışık hücre ve AB tek tabaka üzerinde "tutuklandı" ve transmigrate olmaz bir yapışık hücre arasında ayrım yoktur. Ayrıca, bu testlerin bir kemokin degrade doğru hücrelerinin göçü ölçemezsiniz.
Çeşitli raporlar akış 14. koşullarında cam slaytlar yetişen bir AT tek tabaka altında tarama yapışık hücrelerinin yeteneği tarif var. Bu tarama tekniği şu sınırlamaları içerir: bu hücrelerin sadece sınırlı sayıda analiz, olmayan-nicel değil, matris ve cel üzerinde tarama hücre analizl yüzey değil bir kemotaktik degrade doğru göç, ve transmigrated hücreleri izole izin vermez. Bu tahlil, AT tek tabaka makaslama kuvveti uygulanarak avantajına sahip olmasına rağmen, böylece, bir kemokin gradyan doğru hücre migrasyonu ölçmek olamaz.
Burada açıklanan yeni 3D teknolojisi, statik bir kemokin degrade (alt bölmesi) ile kesme kuvveti (üst bölme) birleştirerek bu eksikliklerin çoğu üstesinden gelir ve ekstravazasyon kaskad (Şekil 1) her aşamasında nicel değerlendirmesi izin verir. Cihaz aynı zamanda AK ve mikro arasındaki karışma dolaşan hücrelerin damar dışına desteklemek için Avrupa Komisyonu yeteneği nasıl etkilediğini araştırmak için kullanılabilir. Aşağıdaki protokol, 3B akış odası cihazı kullanmak için adım adım yöntem açıklanmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
3D Cihaz kök hücre biyolojisi, vasküler biyoloji, hematoloji, onkoloji, otoimmünite ve inflamasyon dahil olmak üzere çeşitli alanlarda araştırma için yararlı bir teknoloji olabilir. 3D cihaz araştırmacılar kök hücre ekstravazasyon çağlayan her adımı düzenleyen moleküler mekanizmalarının araştırılması hematopoetik, mezenkimal, sinir ve diğer kök hücre çalışmaları için özellikle faydalı olacaktır. Hücre göçü okuyan araştırmacılar da T-ve B-lenfositler, monositler, nötrofiller, eozinofiller, NK hücreleri ve diğer göçmen hücrelerin farklı göç mekanizmaları incelemek için bu cihazı kullanabilirsiniz. Vasküler biyoloji, cihaz hücre toplanması desteklemek ve in vitro kan-beyin bariyerini taklit etmek EC yeteneği yerel mikro etkisini değerlendirmek için faydalı olacaktır. Hastalığının patogenezinde odaklanan araştırmacılar için, aygıt tip I diyabet, mil boyunca pankreas içine, sitotoksik T hücrelerinin göç incelemek için kullanılabilirastım hastaları, nötrofil göçü, monositler ve bozukluklar, çeşitli siteler yara iyileşmesi için bir hücre alımı, yeni damar ile sitotoksik T hücrelerinin etkileşimini inflamasyonun sitelerine lenfositlerin akciğerlere eozinofil vasıfları ve işe tümörlerinde, sitotoksik T hücrelerinin.
Yeni 3D Cihaz aynı zamanda öteleme bilim ve klinik öncesi ilaç geliştirme ve tarama için yararlı bir araç olacaktır. Örneğin, aygıt, intravenöz uygulama için terapötik hücre süspansiyonları hazırlanmasında optimize etmek için normal dokulara karşı yaralı doku tedavi edici hücrelerin alım test etmek için, ve özel bir organ veya doku bu endotelyum ve mikro rolünü incelemek için kullanılabilir süreç. Ilaç geliştirme için, aygıt, bu hedef tümör hücrelerinin ilaç adayları test etmek ve ekstravazasyonu kaskad her adımda blok, bir ilaç teslim olarak göç eden hücrelerin test etmek için kullanılabilecektümör sitelere y araç, insan organ-spesifik endotel veya lokal doku özgü mikro fonksiyonu düzenleyen ve homing kaskad farklı adımlar düzenleyen ilaçların kombinasyonları test etmek için ilaçların test etmek için. Son olarak, yüksek verimli bir sisteme dönüştürülen, cihaz hedef moleküllerin hücre trafiğini aracılık bu küçük moleküller, peptitler, antikorlar ve taranması için kullanılabilir.
Teknik detaylar ve ipuçları
Akışı altında Rolling ve yapışma ekstravazasyon kaskad kritik adımlar ve in vivo hücre göçü verimini önemli katkı sağlamaktadır. Özellikle şu adımları in vitro statik deneyleri katkı yoktur. Ancak, statik göçü deneyleri düşük afinite etkileşimleri (haddeleme) ve sağlam yapışma destek EC yeteneği dahil olmak üzere hücre sağkalım ve işlevi, üzerinde kayma stresin etkilerini test deneylerde negatif kontrol olarak yararlıdır.
3D cihaz deneyler için ortamın seçimi önemlidir. Ortam özellikle uzun inkübasyon süreleri esnasında dolaşan hücrelerin canlılığı etkileyebilir farklı büyüme faktörlerinin içerir. Buna ek olarak, Ca 2 + ve Mg konsantrasyonu 2 +, fizyolojik akış koşulları altında yapışma etkileşimlerini etkileyebilecek olan ticari bir kültür ortamı içinde önemli ölçüde farklılık gösterir. 3D cihaz ile deneyler planlarken dikkate alınması gereken diğer teknik detayları aşağıda açıklanmıştır.
AB tek tabaka seçimi
AT'nin hücre yüzeyi imza deney tasarımında dikkate alınmalıdır türleri, kaynak ve hücre kültürü koşullarının dokusu da dahil olmak üzere çeşitli parametreler, etkilenir. Bazı sık kullanılan EC akciğer kaynaklı mikrovasküler EC (LDMVEC), kemik EC (BMDEC), beyin kaynaklı EC (BDEC) iliği kaynaklı ve HUVEC içerir.Avrupa Komisyonu özellikleri de kökenlerine göre değişir. Örneğin, çelik ve yapışma sorumludur BMDEC yapısal olarak ifade selektinler ve VCAM-1, BDEC, LDMVEC ve HUVEC Normal koşullar altında, bu moleküllerin ifade böyle değildir. Bu nedenle, BDEC, LDMVEC ve HUVEC ile kaplanmış uçlar TNF α (10 ng / ml, 4 saat) taklit etmek veya inflamasyon ve yerleşme moleküllerinin ekspresyonunu teşvik etmek için diğer faktörler ile tedavi edilebilir.
Yerel mikro ile karışma Test
Yerel mikro AT fonksiyonlarını düzenler ve hücre ekstravazasyon katılımını anlamada artan bir ilgi vardır. Sonuçlarımız EC tek tabaka altında stromal hücre tek tabaka yerleştirilmesi önemli ölçüde hücreleri dolaşımdaki damar dışına artırdığını göstermektedir. Bu bulgu, EC ve stroma arasında karışma dolaşan hücrelerin damar dışına desteklemek için Avrupa Komisyonu yeteneğini artırır göstermektedir. Moreover, farklı mikroçevrelerde (örneğin mezenkimal kök hücreler, akciğer fibroblast, tümör hücreleri, astrositler) hücreleri ekleme belirli vasküler yatak taklit için yardımcı olabilir. Özellikle, beyin türevli AT ve astrositler bir arada, kan-beyin bariyerini taklit etmek için yararlı bir yaklaşım olabilir. Benzer şekilde, hastalar, ya da in vitro olarak manipüle normal hücrelerden elde edilen hücreler, belirli bir hasta mikro taklit yardımcı olabilir.
Çalışmalarda, biz% 50 izdiham büyüdü stromal hücreleri ile alt ekler kullanılır. Uçlarda mikroçevredeki hücrelerin optimum yoğunluk çalışmanın hedeflerine bağlı olsa da, bu kolayca manipüle ve kontrol edilebilir.
Bir kayma gerilmesi hızı seçerek
Bu Von Andrian ve arkadaşları tarafından gösterilmiştir çünkü 0,8 dyn / cm 2 kayma gerilmesi burada kullanılmıştır. kemik iliği microvasculatur içinde kayma gerilmesi içinhematopoetik progenitör hücrelerin dolaşım çıkmak ve normal fizyolojik koşullar 15 altında dokulara girerler e,. Bunun aksine, kesme stresi yüksek düzeyde hücre ekstravazasyonu sınırlıdır daha büyük kaplar, gözlenir. Bu nedenle, yüksek kesme kuvveti oranları, çeşitli hücre tipleri ekstravazasyonu inceleyen deneyler için ilave kontroller olarak kullanılabilir.
Kayma gerilimi altında hücrelerin hayatta kalma hücre tipi ve ex vivo hücre tedavileri (Goncharova ve ark., Yayınlanmamış gözlem) dahil olmak üzere çeşitli faktörlere bağlıdır ve bu nedenle dikkatli bir şekilde test sırasında değerlendirilmelidir. Kayma stres düzeyleri farklı (kayma gerilmesi direnç) Hücre hassasiyeti 0,8 dyn / cm 2 ile 6 dyn / cm 2 aşamalı kayma gerilmesi oranı artırmak için peristaltik pompa programlanarak değerlendirilebilir. Bu testler sırasında, hücreler olarak kullanarak hücre ölümü izlemek için gaz değişimi odasından periyodik olarak alınabilirBu tripan mavi dışlama, anneksin V ve PI boyama ve apoptoz işaret ifadesi olarak söylüyor.
Deneyler parankimi türetilen ex vivo olarak işlenmiş hücreler veya hücre kayma stres direnci test etmek için tasarlanmıştır, bu, kan yoluyla bulaşan hücreleri gibi ek bir pozitif kontroller, deneyler dahil edilmesi tavsiye edilir.
Uç gözenek büyüklüğü ve ECM kaplamanın seçimi
Ekler çeşitli gözenek boyut (3, 5, ve 8 mikron) mevcuttur. Gözenek boyutunun seçimi, dolaşımdaki testi hücrelerinin boyutu ve özelliklerine bağlı olacaktır, bu da statik transwell tahliller için de geçerlidir. Bir büyük gözenek boyutu (8 mikron) ile ekler gibi epitel kökenli tümör hücreleri gibi büyük hücrelerin damar dışına test etmek için tavsiye edilir. Lökosit veya hematopoetik kök hücrelerin daha yaygın 5 mikron gözenek ekler ile test edilir, ve 3 mikron gözenek ekler iyi s damar dışına test için ayrılmıştırMaller hücreleri. Ancak, tek başına test hücre boyutu tek önemli faktör değildir ve biz birkaç gözenek boyutları ile ekler test tavsiye ederiz.
Bizim ilk çalışmalarda, biz ekler üzerinde AT büyümeyi desteklemek ve> 4 saat kayma gerilmesi dayanma kabiliyetlerini için çeşitli ECM test. ECM Matrigel, poli-D-lizin, fibronektin, laminin, yazın dahil test edilen I kollajen, Hidrojel, Meta-keratin I, II, III, IV, ve Extracel. EM büyümesi için en iyi sonuçlar Extracel, fibronektin ve kollajen ile elde edilmiştir. Ancak, bizim ellerde, 0.8 mg / cm 2 Extracel önemli ölçüde zarından testi hücrelerinin göçü azalır. Bu nedenle şimdi ekler kaplama için fibronektin (5 mg / cm 2) veya kollajen (5 mg / cm 2) kullanın. Bununla birlikte, ECM'nin optimum seçimi muhtemelen AT türüne ve test hücrelerinin transmigratory özellikleri hem de etkilenir. Bir ön deney Integri test etmek için gerekenAB tek tabaka ty seçilen ECM yetişen. Örneğin, kültür ortamı ile doldurulmuş petri levhalar içinde EM mono tabakaları ile yerine önceden kaplanmış uçlar, makaslama kuvveti (düşük ayar) oluşturmak için, bir çalkalayıcı üzerinde yemekleri yerleştirmek, ve 37 ° C'de inkübe edin ve% 5 12 saat boyunca CO2. Kesme stresine maruz kaldıktan sonra EM bütünlüğü kristal mor boyama ile değerlendirilebilir.
Optimal test hücre konsantrasyonları seçimi
Dolaşım çıkmak için Test hücreleri yeteneği, her bir hücre tipine özgü bir çok özelliklerine bağlıdır. Istatistiksel olarak anlamlı sonuçlar üretmek için, dolaşan hücre yoğunluğu hücre yeterli sayıda pozitif kontrol kuyularına geçiş sağlamak için optimize edilmelidir. Bu nedenle, sisteme yüklenen hücre sayısı ve arasındaki ilişkiyi anlamak için hücre yoğunlukları bir dizi (örneğin 10 3 / ml 10 7 / ml) ile ilk testleri tavsiyegöçü geçmesi hücre sayısı.
Buna ek olarak, en iyi dolaşımdaki konsantrasyonunu farklı kaynaklardan elde edilen aynı hücre tipi için farklı olabilir. Örneğin, CD34 + hücreler hematopoetik kök hücre ve kararlı soy özel ataları hem içeren heterojen bir hücre popülasyonu vardır. Bunlar kemik iliğinden elde edilebilir, periferik kan harekete ve göbek kordon kanı. Bu üç kaynaklardan elde edilen CD34 + hücreleri, farklı hedef arama ve yerleştirilmesiyle özellikler 16-18 sahiptirler, bu nedenle cihazın 3B, bu hücreler test etmek için koşullar tam ölçekli bir çalışma öncesi optimize edilmelidir.
Optimum hücre dolaşım süresi seçimi
Optimal dolaşım süresi her bir hücre tipi için ampirik olarak belirlenmelidir. Dolaşım için gereken minimum zaman statik göç deneyleri sonuçlarından çıkarım olabilir, ancak bu exten olabilirHücrelerin kesme stresine tabi tutulduğunda ded. 4 ve 96 saatleri arasında dolaşımı kez test pilot çalışmalar önerilir.
Gaz alış-veriş ünitesinin
Gaz alış-veriş ünitesinin ana amacı, standart bir doku kültürü kuluçka ayarları benzer 3D aygıt içinde dolaşan orta bölgesi CO2 optimum konsantrasyonu elde etmektir. Gaz alış-veriş ünitesinin ayrıca Test hücreleri ve bileşikler ilave edilmesi için ve test sırasında prob ve numune toplamak için kullanılabilir.
Test hücre sayıları Değerlendirilmesi
Sirkülasyon hücreleri gaz değişimi ünitesi ile deney sırasında farklı zamanlarda tadına bakabilirsiniz. Deneyin sonunda, dolaşımda kalan hücreler çıkışında toplanan edilebilir. 3D cihaz deney sonunda demonte edildiğinde, transmigrated hücreleri alt kuyulardan toplandı ve f toplanabilirya da daha fazla analizi. Giriş hücreleri etiketsiz ise, transmigrated hücreleri tripan mavi ve mikroskobik sayılan canlı / ölü hücreleri ile boyanmış olabilir. Alternatif olarak, giriş hücreleri 3D cihazın içine yerleştirmeden önce canlı hücre görüntüleme için çok "hücre izci" bir boya ile işaretlenmiş olabilir, bu durumda, hücreler hasat floresans ölçümü için lize edilmelidir transmigrated.
En uygun örneklem büyüklüğü seçimi
Istatistiksel analiz izin vermek için, bir örneklem büyüklüğü iki taraflı t-testi ile 0.05 anlamlılık düzeyinde test iki grup arasında ortalama yüzde değişiklikler varsayımsal farkı tespit etmek için yaklaşık% 80 güç sağlayacak seçilmelidir. Kemik iliği hücreleri ile deneyimlere dayanarak, biz 3 boyutlu cihaz deneyler için deney durumu başına üç kuyu kullanın. Bununla birlikte, en iyi örnek büyüklüğü, deney amacı ile değişir ve e belirlenmelidirmpirically. Çoklu regresyon istatistiksel testler, iki taraflı t-testi ve varyans analizi sonuçlarının istatistiksel önemi doğrulamak için kullanılabilir.
Kemokinlerin seçimi
Tüm tahliller göçü için olduğu gibi, kemoatraktan seçimi test hücrelerinin özelliklerini ve çalışmanın amacı tarafından dikte edilir. SDF-1 hematopoietik hücreler için iyi bilinen bir kimyasal çekicidir. Bizim ellerde, 50 ng / ml, SDF-1 'lik bir konsantrasyon kemik iliğinden türetilmiş hematopoetik projenitör hücrelerin ekstravazasyon uyarmak için uygun olmuştur. Ayrıca mezenkimal kök hücreler 19 için chemoattractants olarak C3a ve bFGF kullanın. Ancak, tam ölçekli bir çalışma önce en uygun konsantrasyon aralığı tanımlamak için kemokin her kemokin ve çapraz titrasyonu kombinasyonları titre tavsiye ederiz. Belirli hücre tipleri için kemotaktik faktörlerin bir arada yararlı olabilir. Özel test hücreleri için kemokinleri con, bilinmeyen veya mevcut değilseuyarılmış lenfositler, fibroblastlar ve diğer hücrelerden ditioned ortam Kemo-çekiciler arasında bir kaynak olarak kullanılabilir.
Okuma parametrelerin seçimi
3D cihazın çok yönlülük yapılabilir göçü deneyler türünü genişleyecektir ve deneylerin başarısı okuma parametrelerinin düşünceli dikkate ve tasarım bağlıdır. Bir kural olarak, hücrelerin üst (dolaşımdaki) bölmesi toplandı ve alt (statik) bölmesi hücre sayımı ile aynı anda canlılığı için test edilmelidir. Bazı hücreler mikrovasküler gözlenen fizyolojik kayma gerilmesi için düşük toleransı sahip. Bu durumda, ölü hücrelerin sayısı üst bölmesine artırılacaktır. EC katmanda (veya tuzak) tutuklandı yapışık hücre sayısını test hücreleri tarafından özellikle ifade belirteçleri immünsitokimya tarafından değerlendirilebilir. CD31 ve vWF için spesifik antikorları kullanılabilirEC tespit etmek ve test hücreleri ve AB arasında ayrımcılığa izin vermek. Buna ek olarak, EM tek tabaka bütünlüğünü her test sonunda izlenmelidir.
Toplanan hücreler ile yapılan analiz türleri araştırmacılar 'deneysel hedeflerine bağlı olacaktır, ancak mikroarrayler ve qPCR, FACS analizi ile yüzey molekülü ifade FACS ve batı blot sinyal yollarının aktivasyonu, ve faktör gen ifade analiz değişiklikleri içerebilir ELISA ile salgı. Biz transmigrated kemik iliği hücreleri hematopoetik progenitör hücreler (Şekil 3) sıralamak için kültüre hangi kendi çalışma ile kanıtlandığı gibi fonksiyonel testlerin muazzam bir dizi, in vitro toplanan hücreleri üzerinde mümkündür. Toplanan numuneler, aynı zamanda in vivo deneyler, çeşitli test edilebilir.
In vivo test hücrelerin davranışını tahmin etmek için yardımcı olabilir önemli bir parametre eğilimindedirkayma gerilmesi farklı oranlarda altında agrega oluşturmak için bazı hücrelerin ency. Örneğin, 3 boyutlu cihazda toplam oluşumu tabi tedavi hücreleri intravenöz uygulamadan sonra kümeleri oluşturmak ve in vivo (Gonçarov ve ark., Yayınlanmamış gözlemler) akut damar tıkanıklığı neden daha büyük bir eğilim olabilir. Agrega oluşumu 3D cihaz deney tamamlanması sırasında veya sonrasında test hücreleri örnekleyerek mikroskobik olarak takip edilebilir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz CBS Bilimsel Company Inc (Chuck Scott ve Victor McKnight teşekkür www.cbsscientific.com mühendislik yardım ve 3D odası, gaz değişimi ünitesi, ve ekler üretimi için). Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (hibe R21DK067084 ve R43CA141782 için SKK) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Reagent/Material | |||
| PVC tubing (bore 1.42, wall 0.8) | Watson-Marlow Limitid | 981.0142.000 | |
| 3D Chamber | C.B.S.Scientific | FC-1000 | |
| Gas exchange unit | C.B.S.Scientific | FCR-1000 | |
| Inserts | C.B.S.Scientific | FCI-1005U | |
| Collagen Bovine,Type I | BD Biosciences | 354231 | |
| Hydrochloric Acid 0.1M | VWR | BDH3200-1 | |
| PBS | Invitrogen | 14190 | |
| HUVEC | Lonza | CC- 2517 | |
| EGM Bullet Kit (cc – 3121 & cc – 4133) | Lonza | CC – 3124 | |
| Trypsin Neutralizing Solution | Lonza | CC-5002 | |
| Trypsin | Lonza | CC-5012 | |
| HEPES | Lonza | CC-5024 | |
| SDF-1 | R7D System | 460-SD | |
| Extracel Trial 2.5 Kit | Glycosam Byosystems | GS211 | |
| Fibronectin, human , nature | BD Biosciences | 356008 | |
| Poly-D-lysine | Millipore | A-003-E | |
| BD Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Human Brain Microvascular Endothelial Cells | ScienCell | 1000 | |
| Endotelial Cell Medium (ECM) for brain cells | ScienCell | 1001 | |
| Trypan Blue | StemCells Tecnologies | 7050 | |
| TNF-alfa, 10 μg | Invitrogen | PHC3015 | |
| VCAM-1, mouse anti-human, CD106-FITC | Southern Bioteck | 9519-02 | |
| Propidium Iodide Staining Solutuion | BD Pharmingen | # 556463 | |
| Frozen Human Cord Blood CD34+ cells | StemCell | CB007F | |
| Frozen Human Cord Blood CD34+ cells | Zenbio | SER – CD34-F | |
| MethoCult GF M3434 | StemCells Tecnologies | GFM3434 | |
| Mouse Methylcellulose complete media | R&D | HSC007 | |
| Anti-Von Willibrand Factor antibody | abcam | C# ab11713 | |
| Petry dish (35 x 10 mm) | VWR | CA25373-041 | |
| 15 ml tubes | VWR Fisher | 21008 – 918 | |
| Tissue culture flasks 75cm2 | VWR | BD353136 | |
| Cristal violet | Sigma | C-3886-25G | |
| Dissecting forceps, curved | VWR | 82027-384 | |
| 1,000 μl Pipette tips | VWR | 83007-380 | |
| 1 – 200 μl Pipette tips | VWR | 37001-530 | |
| Equipment | |||
| Peristaltic pump | Watson-Marlow Limitid | 403U/VM3 |
References
- Daley, G. Q. The promise and perils of stem cell therapeutics. Cell Stem Cell. 10, 740-749 (2012).
- Khaldoyanidi, S. Directing stem cell homing. Cell Stem Cell. 2, 198-200 (2008).
- Laird, D. J., von Andrian, U. H., Wagers, A. J. Stem cell trafficking in tissue development, growth, and disease. Cell. 132, 612-630 (2008).
- Lapidot, T., Kollet, O. The brain-bone-blood triad: traffic lights for stem-cell homing and mobilization. Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. 2010, 1-6 (2010).
- Sackstein, R. Glycoengineering of HCELL, the human bone marrow homing receptor: sweetly programming cell migration. Ann. Biomed. Eng. 40, 766-776 (2012).
- Smart, N., Riley, P. R. The stem cell movement. Circ. Res. 102, 1155-1168 (2008).
- Khaldoyanidi, S. K., et al. MDA-MB-435 human breast carcinoma cell homo- and heterotypic adhesion under flow conditions is mediated in part by Thomsen-Friedenreich antigen-galectin-3 interactions. J. Biol. Chem. 278, 4127-4134 (2003).
- Le Devedec, S. E., et al. Two-Photon Intravital Multicolour Imaging to Study Metastatic Behaviour of Cancer Cells in vivo. Methods Mol. Biol. 769, 331-349 (2011).
- Barakat, A. I. Responsiveness of vascular endothelium to shear stress: potential role of ion channels and cellular cytoskeleton (review). Int. J. Mol. Med. 4, 323-332 (1999).
- Fisher, A. B., Chien, S., Barakat, A. I., Nerem, R. M. Endothelial cellular response to altered shear stress. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 281, L529-L533 (2001).
- Nerem, R. M. Shear force and its effect on cell structure and function. ASGSB Bull. 4, 87-94 (1991).
- Topper, J. N., Gimbrone, M. A. Blood flow and vascular gene expression: fluid shear stress as a modulator of endothelial phenotype. Mol. Med. Today. 5, 40-46 (1999).
- Giavazzi, R., Foppolo, M., Dossi, R., Remuzzi, A. Rolling and adhesion of human tumor cells on vascular endothelium under physiological flow conditions. J. Clin. Invest. 92, 3038-3044 (1993).
- Cinamon, G., et al. Novel chemokine functions in lymphocyte migration through vascular endothelium under shear flow. J. Leukoc. Biol. 69, 860-866 (2001).
- Mazo, I. B., et al. Hematopoietic progenitor cell rolling in bone marrow microvessels: parallel contributions by endothelial selectins and vascular cell adhesion molecule 1. J. Exp. Med. 188, 465-474 (1998).
- Arber, C., et al. Graft source determines human hematopoietic progenitor distribution pattern within the CD34(+) compartment. Bone Marrow Transplant. 46, 650-658 (2012).
- Fuji, S., et al. Peripheral blood as a preferable source of stem cells for salvage transplantation in patients with graft failure after cord blood transplantation: a retrospective analysis of the registry data of the Japanese Society for Hematopoietic Cell Transplantation. Biol. Blood Marrow Transplant. 18, 1407-1414 (2012).
- Haspel, R. L., Miller, K. B. Hematopoietic stem cells: source matters. Curr. Stem Cell Res. Ther. 3, 229-236 (2008).
- Schraufstatter, I. U., Discipio, R. G., Zhao, M., Khaldoyanidi, S. K. C3a and C5a are chemotactic factors for human mesenchymal stem cells, which cause prolonged ERK1/2 phosphorylation. J. Immunol. 182, 3827-3836 (2009).
