A Novel Driedimensionale Flow Kamer Device aan chemokine-gerichte extravasatie van Cellen doorgeven Studie onder Fysiologische stroomtoestanden
Summary
De driedimensionale stroom kamer inrichting een nieuw<em> In vitro</em> Technologie voor de kwantitatieve en stapsgewijze evaluatie van de extravasatie cascade van circulerende cellen onder omstandigheden van fysiologische schuifspanning. Het apparaat vult dan ook een kritieke behoefte aan eenvoudige, preklinische en klinische studies van de cel migratie.
Abstract
Extravasatie van circulerende cellen uit de bloedbaan speelt een centrale rol in vele fysiologische en pathofysiologische processen, waaronder stamcellen homing en tumormetastase. De driedimensionale stroom kamer apparaat (hierna 3D-inrichting) is een nieuwe technologie die in vitro fysiologische schuifspanning nagebootst en kan elke stap van de cel extravasatie cascade te kwantificeren. De 3D-inrichting bestaat uit een bovenste compartiment, waarin de cellen van belang circuleren onder schuifspanning, en een onderste compartiment van statische putten die de chemoattractanten plaats bevatten. De twee compartimenten worden gescheiden door poreuze inzetstukken bedekt met een monolaag van endotheelcellen (EC). Een optionele tweede inzet met microenvironmental cellen van belang kan direct onder het EG-laag worden geplaatst. Een gasuitwisseling unit maakt de optimale CO 2-spanning worden onderhouden en biedt een toegangspunt om cellen of verbindingen tijdens het voegen of in te trekkenexperiment. De testcellen circuleren in het bovenste compartiment op de gewenste schuifspanning (debiet) gecontroleerd door een peristaltische pomp. Aan het einde van het experiment worden de circulerende en gemigreerde cellen verzameld voor verdere analyse. De 3D-apparaat kan worden gebruikt om mobiele rollen op en hechting aan EG onder schuifspanning transmigratie in reactie op chemokine gradiënten, shear stress, clustervorming en celoverleving onderzoeken. Bovendien, de optionele tweede inzetstuk het effect van overspraak tussen EG microenvironmental cellen worden onderzocht. De translationele toepassingen van de 3D-apparaat omvatten het testen van kandidaat-geneesmiddelen die zich richten cel migratie en het voorspellen van de in vivo gedrag van cellen na intraveneuze injectie. Zo kunnen de nieuwe 3D-inrichting een veelzijdig en goedkoop hulpmiddel om de moleculaire mechanismen die cellulaire extravasatie bemiddelen bestuderen.
Introduction
Cel extravasatie is het proces waarbij circulerende cellen sluiten de bloedsomloop en is een essentieel onderdeel van veel fysiologische reacties in het lichaam. De werkwijze is ook belangrijk voor weefselregeneratie, bijvoorbeeld bij therapeutische cellen gemobiliseerd uit weefsels in het bloedvat (of intraveneus geïnjecteerd) migreren door het vaatstelsel en verlaat de circulatie plaatsen van schade of degeneratie. Extravasatie is een essentieel onderdeel van de pathogenese van vele ziekten, waaronder ontsteking, afstoting, autoimmuniteit en tumormetastase.
Extravasatie is een complex meerstapsproces dat de interactie van cellen met circulerende endotheelcellen (EC) onder omstandigheden van fysiologische stroming omvat. De werkwijze omvat (a) cel rollende, (b) stevige adhesie aan het luminale oppervlak van EC, en (c) transmigratie in de hele EG. Belangrijk is dat elke stap van de extravasatie cascade geregeld door een subset van cell type-specifieke en species-specifieke moleculen. Echter, de gedetailleerde moleculaire mechanismen die extravasatie van specifieke cel subsets regulering niet goed begrepen, vooral door de technische problemen bij recapituleert de in de bloedbaan. De nieuwe 3D hier beschreven inrichting is bedoeld om deze technische problemen overwinnen en proeven die uitgevoerd worden dat ons begrip van de biologie van celmigratie zal verbeteren.
De moleculen die cel migratie bemiddelen zijn belangrijke therapeutische doelwitten. Een gedetailleerd inzicht in de moleculaire gebeurtenissen die de migratie van specifieke celtypen te controleren zal helpen bij het identificeren van nieuwe targets voor de therapeutische bevordering of remming van extravasatie. Bijvoorbeeld, interventies die de migratie van therapeutische cellen (of afgeleid van volwassen, neonatale of uit foetaal weefsel) naar gebieden van schade of degeneratie versterken van groot nut in weefselregeneratie.Er is een groeiende belangstelling voor de in vitro productie van therapeutische cellen, waaronder cellen afkomstig van pluripotent bronnen, en ex vivo gemanipuleerde volwassen stamcellen (geëxpandeerd, genetisch gemanipuleerde en voorbehandeld met verschillende enzymen) 1. Er is dus een behoefte aan nieuwe technologieën om de kwaliteit van de stamcellen te evalueren voordat ze worden gebruikt voor therapeutische doeleinden. Onder andere parameters, moeten de cellen in staat zijn het verkeer efficiënt te verlaten, omdat behandelingen multifocale aandoeningen kan intraveneuze toediening van de stamcellen 2 nodig. Inderdaad, een van de huidige uitdagingen in de biologie van de stamcel is de extreem lage efficiëntie te overwinnen waarmee stamcellen huis naar sites van weefselschade 3-6, met de nadruk op de noodzaak om dit hiaat in ons begrip van stamcellen migratie aan te pakken. Daarentegen strategieën blok celmigratie door gericht op specifieke homing molecules zou nuttig zijn voor de behandeling van in zijninflammatoire en auto-immuunziekten en metastatische kanker. Aldus begrip van de moleculaire mechanismen die de interactie tussen circulerende cellen en EC bemiddelen bij celmigratie en extravasatie translationeel geneeskunde en drug discovery alsmede fundamentele wetenschap relevant.
Er zijn momenteel een aantal methoden beschikbaar zijn voor verschillende aspecten van de cel migratie te bestuderen. Deze werkwijzen hebben tekortkomingen kunnen worden overwonnen met de nieuwe 3D-apparaat.
Dierlijke modellen:
Diermodellen, zoals immuungecompromitteerde muizen en genetisch gemanipuleerde muizen zijn nuttige hulpmiddelen zijn om de migratie van menselijke cellen in vivo. Echter, een belangrijk nadeel aan deze modellen is dat de menselijke cellen interageren slecht met adhesie moleculen aanwezig op de muis EG, voor een deel te wijten aan een soort-specifieke sequentie verschillen in veel celoppervlaktemoleculen. Zo is het gebruik van knaagdieren te bestuderenmenselijke cel migratie waarschijnlijk authentieke afspiegeling van de gebeurtenissen in het menselijk orgaan-specifieke vasculaire bedden. Bovendien, in vivo modellen zijn niet geschikt voor high-throughput screening van kandidaat-geneesmiddelen. De conventionele in vivo modellen gebruikt om cel homing studie geen onderscheid tussen de verschillende stappen van de extravasatie cascade, waardoor het moeilijk om nieuwe moleculen te identificeren homing en target. De opklaren aanpak ontwikkeld om deze behoefte en is informatief, maar deze techniek is zeer tijds-en arbeidsintensief 7,8.
Statische transmigratie assays:
Transwell of Boyden-kamer assays maatregel cel migratie via een poreus membraan en worden veel gebruikt in de migratie studies. De assay heeft het voordeel dat het kan worden gebruikt om niet alleen celmotiliteit en cel-extracellulaire matrix (ECM) interacties te bestuderen, maar ook chemokine gemedieerde migratie van cellenover een EC monolaag gekweekt op het poreuze membranen. Helaas, het fenotype van de EG onder statische omstandigheden aanzienlijk verschillen van die onder fysiologische stroom 9,10. Zo weet de chemotactische gebeurtenissen die zich voordoen in Transwell assays niet getrouw na te bootsen de interacties tussen migrerende cellen en EC onder shear stress. Bovendien is de "rollen" stap van de homing cascade, die een extra dimensie van selectiviteit verhoogt het algehele proces niet voorkomen in statische Transwell assays. Dus, terwijl deze technologie wel mogelijk kwantitatieve evaluatie van chemokine-gemedieerde celmigratie in de EC monolaag wordt beperkt door zijn onvermogen om de schuifspanning die de bloedstroom in vivo nabootst.
Assays onder schuifspanning:
Wandschuifspanning is bekend dat een belangrijke rol spelen in het reguleren van EG-functie 9,10. Schuifkrachten induceren een snelle activering van signaal cascades, transcription factoren, en differentiële genexpressie in EC 11,12. Deze informatie heeft geleid tot de ontwikkeling van de volgende generatie van adhesiebepalingen – parallelle laminaire stroming kamers en capillairen – bestuderen rollen en adhesie van cellen aan EG onder omstandigheden van schuifspanning 7,13. De beperkende factor voor deze testen is dat ze kunnen meten alleen rollen en adhesie, maar maken geen onderscheid tussen een aanhanger cel die zou gaan om transmigreren en een hechtende cel die wordt 'opgepakt' op de EG-monolaag en zou niet transmigreren. Bovendien kunnen deze assays meten niet migratie van cellen naar een chemokine gradiënt.
Verschillende rapporten hebben beschreven het vermogen van hechtende cellen te kruipen onder een EG monolaag gegroeid op glasplaatjes onder omstandigheden van stroom 14. De beperkingen van deze techniek kruipen zijn: het analyseert slechts een beperkt aantal cellen, het is niet kwantitatief, analyseert cel kruipen op de matrix en de cell oppervlak, maar niet de migratie naar een chemotactische gradiënt, en het staat niet toe dat de transmigrated cellen worden geïsoleerd. Ofschoon deze test heeft het voordeel van het toepassen afschuifspanning de EC monolaag, kan niet kwantificeren migratie van cellen naar een chemokine gradiënt.
De nieuwe 3D-technologie beschreven overwint veel van de tekortkomingen door het combineren afschuifkracht (bovenste compartiment) met een statische chemokine gradiënt (onderste vak) en maakt kwantitatieve evaluatie van elke stap van de cascade extravasatie (figuur 1). Het apparaat kan ook worden gebruikt om te onderzoeken hoe de overspraak tussen EC en de micro-omgeving van invloed op het vermogen van de EG tot extravasatie van circulerende cellen te ondersteunen. Het volgende protocol beschrijft de stap voor stap methode voor de 3D stromingskamer apparaat.
Protocol
Representative Results
Discussion
De 3D-inrichting kan een nuttige techniek voor onderzoek op diverse gebieden, waaronder stamcel biologie, vasculaire biologie, hematologie, oncologie, auto-immuniteit en ontsteking. De 3D-inrichting zullen bijzonder nuttig voor onderzoekers die hematopoïetische, mesenchymale, neuronale en andere stamcellen om de moleculaire mechanismen reguleren van elke stap van de stamcel extravasatie cascade onderzoeken. Onderzoekers bestuderen cel migratie kan dit apparaat ook gebruiken om de verschillende trekkende mechanismen van T-en B-lymfocyten, monocyten, neutrofielen, eosinofielen, NK-cellen, en andere migrerende cellen te onderzoeken. In vasculaire biologie, de inrichting nuttig is om het effect van de lokale micro-omgeving van het vermogen van EG celrekrutering steunen en de bloed-hersenbarrière in vitro na te bootsen. Voor onderzoekers gericht op ziektepathogenese, kan het apparaat worden gebruikt om de migratie van cytotoxische T-cellen in de alvleesklier bij diabetes type I, de mi bestuderenintegratie van eosinofielen in de longen van astmapatiënten, de migratie van neutrofielen, monocyten en lymfocyten naar plaatsen van ontsteking in een verscheidenheid van aandoeningen, de rekrutering van cellen om genezing plaatsen wond, de interactie van cytotoxische T-cellen met de neovasculatuur en rekrutering van cytotoxische T-cellen in tumoren.
De nieuwe 3D-toestel zal ook een nuttig hulpmiddel voor translationeel wetenschap en de preklinische ontwikkeling van geneesmiddelen en screening zijn. Bijvoorbeeld kan de inrichting worden gebruikt voor het optimaliseren van de bereiding van therapeutische celsuspensies voor intraveneuze toediening, de rekrutering van therapeutische cellen testen om gewond weefsel versus normale weefsels, en de rol van specifieke orgaan of weefsel endotheel micromilieu in deze studie proces. Voor de ontwikkeling van geneesmiddelen, kan het apparaat worden gebruikt om geneesmiddelkandidaten dat doeltumorcellen testen en blokkeert elke stap van de cascade extravasatie te migrerende cellen als een medicijn ontwikkelen testeny voertuig tumorplaatsen, drugs die de functie van menselijke orgaanspecifieke endotheel of de lokale weefsel-specifieke micro reguleren, en combinaties van geneesmiddelen die de verschillende stappen van de homing cascade regelen testen testen. Tenslotte, na omzetting in een high-throughput systeem, de inrichting kan worden gebruikt voor het screenen van kleine moleculen, peptiden en antilichamen die doelmoleculen bemiddelen celtransport.
Technische gegevens en tips
Rollen en adhesie onder stroom de kritische stappen in de extravasatie cascade en aanzienlijk bijdragen aan de efficiëntie van celmigratie in vivo. Name zijn deze stappen niet bij aan statische testen in vitro. Echter, transmigratie statische testen zijn bruikbaar als negatieve controles in experimenten testen van de effecten van schuifspanning op celoverleving en functie, waaronder het vermogen van EG lage affiniteit interacties (rollen) en stevige hechting te ondersteunen.
De keuze van het medium voor experimenten in de 3D inrichting belangrijk. Media bevat verschillende groeifactoren die de overleving van circulerende cellen te beïnvloeden, met name tijdens lange incubatietijd. Bovendien is de concentratie van Ca2 + en Mg2 +, die bindingsinteracties beïnvloeden onder omstandigheden van fysiologische stroming variëren aanzienlijk commercieel kweekmedia. Andere technische details waarmee rekening moet worden gehouden bij de planning van experimenten met het 3D-apparaat worden hieronder besproken.
Selectie van de EG monolaag
Het celoppervlak signatuur van EG wordt beïnvloed door verschillende parameters, waaronder de soort en het weefsel van herkomst en de celcultuur condities, waarbij rekening gehouden bij de proefopzet moet worden genomen. Enkele veel gebruikte EC omvatten long-afgeleide microvasculaire EC (LDMVEC), beenmerg-afgeleide EG (BMDEC), hersenen afgeleide EG (bdec), en HUVEC.De eigenschappen van de EC ook variëren met hun afkomst. Bijvoorbeeld, BMDEC constitutief uitdrukkelijke selectines en VCAM-1, die verantwoordelijk zijn voor het rollen en adhesie, terwijl bdec, LDMVEC, en HUVEC niet deze moleculen uitdrukken onder normale omstandigheden. Daarom kunnen inzetstukken bekleed met bdec, LDMVEC en HUVEC worden voorbehandeld met TNF α (10 ng / ml, 4 uur) of andere factoren te bootsen en ontsteking induceren expressie van homing moleculen.
Testen crosstalk met de lokale micro-omgeving
Er is een groeiende interesse in het begrijpen hoe de lokale micro-omgeving regelt de functies van de EG en participeert in cel extravasatie. Onze resultaten tonen aan dat insertie van een monolaag van bindweefselcellen onder het EC monolaag verhoogt extravasatie van circulerende cellen. Deze bevinding toont aan dat overspraak tussen de EG en stroma vergroot het vermogen van de EG tot extravasatie van circulerende cellen te ondersteunen. Moreover, het inbrengen van cellen van verschillende micro-omgevingen (zoals mesenchymale stamcellen, long fibroblasten, tumorcellen, astrocyten) kunnen helpen te bootsen specifieke vasculaire bedden. In het bijzonder zou een combinatie van hersenen afgeleide EC en astrocyten een nuttige benadering om de bloed-hersenbarrière na te bootsen. Ook cellen verkregen van patiënten, of normale cellen gemanipuleerd in vitro, zou kunnen helpen na te bootsen een specifieke zieke micro-omgeving.
In onze studies hebben we toegepast lager inzetstukken stromale cellen gekweekt tot 50% confluentie. Alhoewel de optimale dichtheid van micromilieu cellen op de inzetstukken zal afhangen van de doelstellingen van de studie, kan deze gemakkelijk worden gemanipuleerd en gecontroleerd.
Het selecteren van een schuifspanning tarief
De schuifspanning van 0,8 dyn / cm 2 werd hier gebruikt omdat is aangetoond door Von Andrian et al.. de schuifspanning in het beenmerg microvasculature, waar hematopoietische stamcellen verlaat de bloedsomloop en voert weefsels onder normale fysiologische omstandigheden 15. Daarentegen zijn hogere schuifspanning waargenomen in grotere vaten, waar mobiele extravasatie beperkt. Daarom, hoge afschuifspanning gehanteerd worden als bijkomende controles voor experimenten onderzoeken extravasatie van verschillende celtypen.
De overleving van cellen onder schuifspanning afhankelijk van verschillende factoren, zoals het type cel en ex vivo celbehandelingen (Goncharova et al.., Ongepubliceerde waarnemingen), en zou dus zorgvuldig worden geëvalueerd tijdens de proef. Cel gevoeligheid voor verschillende niveaus van shear stress (shear stress weerstand) kunnen worden geëvalueerd door het programmeren van de peristaltische pomp aan de schuifspanning tarief stapsgewijs te verhogen van 0,8 dyn / cm 2 tot 6 dyn / cm 2. Tijdens deze tests, kunnen cellen periodiek worden verzameld uit de gasuitwisseling kamer naar celdood gebruik als monitorenzegt zoals trypanblauwexclusie, annexine V en PI kleuring, en apoptose marker expressie.
Als experimenten zijn ontworpen om de schuifspanning weerstand van ex vivo gemodificeerde cellen of cellen afkomstig van parenchym testen wordt aanbevolen dat aanvullende positieve controles zoals bloed overgedragen cellen, zijn in de experimenten.
Selectie van het inzetstuk poriegrootte en ECM coating
Sloten zijn met verschillende poriegrootten (3, 5, en 8 urn). De keuze van de poriëngrootte is afhankelijk van de grootte en eigenschappen van de circulerende testcellen, hetgeen ook het geval is voor statische Transwell assays. Wisselplaten met een grote poriegrootte (8 micrometer) worden aanbevolen om extravasatie van grote cellen, zoals tumorcellen van epitheliale oorsprong te testen. Leukocyten of hematopoietische stamcellen zijn vaker getest met 5 urn poriën inserts en 3 urn poriën inserts best gereserveerd voor het testen van extravasatie sMaller cellen. De testcel grootte alleen is niet de enige belangrijke factor en we onderzoek aanbevelen inzetstukken met verschillende poriegrootte.
In onze eerste studie, testten we diverse ECM op hun vermogen om de groei van de EG-steun op de inserts en shear stress te weerstaan voor> 4 uur. De geteste ECM inbegrepen Matrigel, poly-D-lysine, fibronectine, laminine, collageen type I, Hydrogel, Meta-keratine I, II, III, IV en Extracel. De beste resultaten voor EG groei werden verkregen met Extracel, fibronectine en collageen. Echter, in onze handen, Extracel bij 0,8 ug / cm 2 verminderde de transmigratie van testcellen over het membraan. Daarom gebruiken we nu fibronectine (5 ug / cm 2) en collageen (5 ug / cm 2) voor het bekleden van inserts. Echter zal de optimale keuze van ECM waarschijnlijk zowel door het type EC en Transmigratory eigenschappen van de testcellen. Een eerste experiment moet worden uitgevoerd om de Integri testenty van de EG monolaag gegroeid op geselecteerde ECM. Plaats bijvoorbeeld pre-coated inzetstukken EC monolagen in petrischalen gevuld met kweekmedium, de schaaltjes op een schudder schuifspanning (lage stand) te creëren, en incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 12 uur. De integriteit van de EC na blootstelling aan de schuifspanning kan worden geëvalueerd met kristalviolet kleuring.
Selectie van de optimale test-celconcentraties
Het vermogen van testcellen de circulatie verlaten afhankelijk van veel kenmerken van elke celtype. Om statistisch significante resultaten te genereren, moet de circulerende celdichtheid worden geoptimaliseerd om ervoor te zorgen dat een voldoende aantal cellen migreren naar de positieve controles. Daarom raden wij u aan eerste testen met verschillende celdichtheden (bijv. 10 3 / ml tot 10 7 / ml) de verhouding tussen het aantal cellen geladen in het systeem en begrijpenhet aantal cellen die transmigratie ondergaan.
Daarnaast kan de optimale circulerende concentratie verschillen hetzelfde celtype verkregen uit verschillende bronnen. Bijvoorbeeld, CD34 +-cellen zijn een heterogene celpopulatie die zowel hematopoietische stamcellen en toegewijde lijn-specifieke voorlopers. Ze kan worden verkregen uit het beenmerg, gemobiliseerd perifeer bloed en navelstrengbloed. De CD34 + cellen, afkomstig van deze drie bronnen bezitten verschillende homing en engrafting capaciteiten 16-18, zodat de voorwaarden voor het testen van deze cellen in het 3D-toestel moet worden geoptimaliseerd voor een full-scale onderzoek.
Selectie van de optimale cel circulatie tijd
De optimale circulatietijd moet empirisch worden bepaald voor elk celtype. De minimale tijd die vereist circulation kan worden afgeleid uit de resultaten van statische migratie assays, maar dit kan worden extended wanneer de cellen worden blootgesteld aan schuifspanning. Pilot studies testen circulatietijden tussen 4 en 96 uur worden aanbevolen.
De gasuitwisseling eenheid
Het hoofddoel van de gasuitwisseling eenheid om de optimale concentratie van CO2 in het handhaven medium circuleert door de 3D-inrichting vergelijkbaar met de instellingen in standaard weefselkweek incubator. De gasuitwisseling apparaat kan ook worden gebruikt voor het toevoegen testcellen en verbindingen en verzameling sondes en monsters tijdens de test.
Evaluatie van de test mobiele nummers
Circulerende cellen kunnen op verschillende tijdstippen bemonsterd worden tijdens het experiment via de gasuitwisseling eenheid. Eind van experiment zou de cellen in de bloedsomloop worden verzameld uit de uitlaat. Wanneer het 3D-apparaat gedemonteerd aan het einde van het experiment, kan de transmigrated cellen geoogst uit de onderste putjes verzameld en fof verdere analyse. Als de ingang cellen zijn zonder etiket, kan de transmigrated cellen worden gekleurd met trypaanblauw en levende / dode cellen microscopisch opgesomd. Alternatief kan de ingang cellen gelabeld met een van de vele "cel tracker" kleurstoffen voor live cell imaging voordat bij 3D apparaat, in dit geval, de geoogste transmigrated cellen worden gelyseerd voor kwantificering van fluorescentie.
Selectie van de optimale steekproefgrootte
Om statistische analyse mogelijk moet een steekproef worden geselecteerd die ongeveer 80% vermogen zal de hypothetische verschil in de gemiddelde procentuele veranderingen tussen twee groepen indien getest bij een significantieniveau van 0,05 met een tweezijdige t-test detecteert. Op basis van onze ervaring met beenmergcellen, gebruiken we drie putten per experimentele conditie voor de 3D-apparaat experimenten. Echter zal de optimale steekproefomvang variëren met als doel het experiment worden bepaald empirically. Meervoudige regressie statistische tests, tweezijdige t-tests en variantieanalyse kan worden gebruikt om de statistische betekenis van de resultaten te controleren.
Selectie van chemokinen
Zoals voor alle transmigratie assays, de keuze van chemoattractant worden bepaald door de eigenschappen van de testcellen en de doelstelling van de studie. SDF-1 is een gevestigde chemoattractant voor hematopoïetische cellen. In onze handen, een concentratie van 50 ng / ml SDF-1 is optimaal om extravasatie van beenmerg afgeleide hematopoïetische voorlopercellen stimuleert. We C3a en bFGF ook gebruik als chemoattractanten voor mesenchymale stamcellen 19. Toch raden wij titreren elke chemokine en cross-titratie combinaties van chemokines om de optimale concentratie bereik te identificeren voordat een volledige studie. Voor bepaalde celtypen, kan een combinatie van chemotactische factoren gunstig. Als chemokines voor specifieke test-cellen zijn onbekend of niet beschikbaar is, congeconditioneerde media van gestimuleerde lymfocyten, fibroblasten, en andere cellen kunnen worden gebruikt als een bron van chemoattractants.
Selectie van de uitlezing parameters
De veelzijdigheid van het 3D-apparaat voor het type transmigratie experimenten die kunnen worden uitgevoerd vouwen en het succes van de experimenten zullen afhangen doordachte behandeling en vormgeving van de uitlezing parameters. In de regel cellen vanuit het bovenste (circulerende) compartiment en de onderste (vaste) compartiment moeten worden getest op levensvatbaarheid tegelijkertijd als celtelling. Sommige cellen bezitten lage tolerantie voor de fysiologische shear stress waargenomen in de microvasculatuur. In dit geval zal het aantal dode cellen worden verhoogd in het bovenste compartiment. Het aantal hechtende cellen aangehouden (of gevangen) de EC-laag kan worden geëvalueerd door middel van immunocytochemie van markers specifiek tot expressie van de testcellen. Antilichamen specifiek voor CD31 en vWF kan worden gebruiktEG sporen en tot discriminatie tussen de test cellen en EC toestaan. Bovendien blijft de integriteit van de EC monolaag worden gecontroleerd op het eind van elke test.
De types van analyses uitgevoerd met de verzamelde cellen zal afhangen van de onderzoekers experimentele doelen, maar kan daarbij bestudeerd veranderingen in genexpressie door microarrays en qPCR, oppervlaktemolecuul expressie door FACS-analyse, activatie van signaalwegen door FACS en western blotting en factor secretie door ELISA. Een enorme reeks van functionele testen mogelijk van de verzamelde cellen in vitro, zoals aangetoond door onze eigen werk waarin we de transmigrated gekweekte beenmergcellen de hematopoietische progenitorcellen (figuur 3) sommen. De verzamelde monsters kunnen ook worden getest in verschillende in vivo assays.
Een belangrijke parameter die kan helpen om het gedrag van de testcellen in vivo te voorspellen is de neigingparantie van sommige cellen aan aggregaten vormen onder verschillende tarieven van shear stress. Bijvoorbeeld therapeutische cellen die aggregaatvorming in de 3D inrichting ondergaan een grotere neiging om samen te klonteren na intraveneuze toediening vormen en acute vasculaire obstructie in vivo (Goncharova et al.., Ongepubliceerde waarnemingen) hebben. Aggregaatvorming kan microscopisch worden gevolgd door bemonstering van de testcellen tijdens of na afloop van de 3D-inrichting experiment.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Chuck Scott en Victor McKnight uit de CBS Scientific Company Inc ( www.cbsscientific.com ) voor engineering bijstand en de fabricage van de 3D-ruimte, gasuitwisseling eenheid, en inserts. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (subsidies R21DK067084 en R43CA141782 te SKK).
Materials
| Reagent/Material | |||
| PVC tubing (bore 1.42, wall 0.8) | Watson-Marlow Limitid | 981.0142.000 | |
| 3D Chamber | C.B.S.Scientific | FC-1000 | |
| Gas exchange unit | C.B.S.Scientific | FCR-1000 | |
| Inserts | C.B.S.Scientific | FCI-1005U | |
| Collagen Bovine,Type I | BD Biosciences | 354231 | |
| Hydrochloric Acid 0.1M | VWR | BDH3200-1 | |
| PBS | Invitrogen | 14190 | |
| HUVEC | Lonza | CC- 2517 | |
| EGM Bullet Kit (cc – 3121 & cc – 4133) | Lonza | CC – 3124 | |
| Trypsin Neutralizing Solution | Lonza | CC-5002 | |
| Trypsin | Lonza | CC-5012 | |
| HEPES | Lonza | CC-5024 | |
| SDF-1 | R7D System | 460-SD | |
| Extracel Trial 2.5 Kit | Glycosam Byosystems | GS211 | |
| Fibronectin, human , nature | BD Biosciences | 356008 | |
| Poly-D-lysine | Millipore | A-003-E | |
| BD Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Human Brain Microvascular Endothelial Cells | ScienCell | 1000 | |
| Endotelial Cell Medium (ECM) for brain cells | ScienCell | 1001 | |
| Trypan Blue | StemCells Tecnologies | 7050 | |
| TNF-alfa, 10 μg | Invitrogen | PHC3015 | |
| VCAM-1, mouse anti-human, CD106-FITC | Southern Bioteck | 9519-02 | |
| Propidium Iodide Staining Solutuion | BD Pharmingen | # 556463 | |
| Frozen Human Cord Blood CD34+ cells | StemCell | CB007F | |
| Frozen Human Cord Blood CD34+ cells | Zenbio | SER – CD34-F | |
| MethoCult GF M3434 | StemCells Tecnologies | GFM3434 | |
| Mouse Methylcellulose complete media | R&D | HSC007 | |
| Anti-Von Willibrand Factor antibody | abcam | C# ab11713 | |
| Petry dish (35 x 10 mm) | VWR | CA25373-041 | |
| 15 ml tubes | VWR Fisher | 21008 – 918 | |
| Tissue culture flasks 75cm2 | VWR | BD353136 | |
| Cristal violet | Sigma | C-3886-25G | |
| Dissecting forceps, curved | VWR | 82027-384 | |
| 1,000 μl Pipette tips | VWR | 83007-380 | |
| 1 – 200 μl Pipette tips | VWR | 37001-530 | |
| Equipment | |||
| Peristaltic pump | Watson-Marlow Limitid | 403U/VM3 |
References
- Daley, G. Q. The promise and perils of stem cell therapeutics. Cell Stem Cell. 10, 740-749 (2012).
- Khaldoyanidi, S. Directing stem cell homing. Cell Stem Cell. 2, 198-200 (2008).
- Laird, D. J., von Andrian, U. H., Wagers, A. J. Stem cell trafficking in tissue development, growth, and disease. Cell. 132, 612-630 (2008).
- Lapidot, T., Kollet, O. The brain-bone-blood triad: traffic lights for stem-cell homing and mobilization. Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. 2010, 1-6 (2010).
- Sackstein, R. Glycoengineering of HCELL, the human bone marrow homing receptor: sweetly programming cell migration. Ann. Biomed. Eng. 40, 766-776 (2012).
- Smart, N., Riley, P. R. The stem cell movement. Circ. Res. 102, 1155-1168 (2008).
- Khaldoyanidi, S. K., et al. MDA-MB-435 human breast carcinoma cell homo- and heterotypic adhesion under flow conditions is mediated in part by Thomsen-Friedenreich antigen-galectin-3 interactions. J. Biol. Chem. 278, 4127-4134 (2003).
- Le Devedec, S. E., et al. Two-Photon Intravital Multicolour Imaging to Study Metastatic Behaviour of Cancer Cells in vivo. Methods Mol. Biol. 769, 331-349 (2011).
- Barakat, A. I. Responsiveness of vascular endothelium to shear stress: potential role of ion channels and cellular cytoskeleton (review). Int. J. Mol. Med. 4, 323-332 (1999).
- Fisher, A. B., Chien, S., Barakat, A. I., Nerem, R. M. Endothelial cellular response to altered shear stress. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 281, L529-L533 (2001).
- Nerem, R. M. Shear force and its effect on cell structure and function. ASGSB Bull. 4, 87-94 (1991).
- Topper, J. N., Gimbrone, M. A. Blood flow and vascular gene expression: fluid shear stress as a modulator of endothelial phenotype. Mol. Med. Today. 5, 40-46 (1999).
- Giavazzi, R., Foppolo, M., Dossi, R., Remuzzi, A. Rolling and adhesion of human tumor cells on vascular endothelium under physiological flow conditions. J. Clin. Invest. 92, 3038-3044 (1993).
- Cinamon, G., et al. Novel chemokine functions in lymphocyte migration through vascular endothelium under shear flow. J. Leukoc. Biol. 69, 860-866 (2001).
- Mazo, I. B., et al. Hematopoietic progenitor cell rolling in bone marrow microvessels: parallel contributions by endothelial selectins and vascular cell adhesion molecule 1. J. Exp. Med. 188, 465-474 (1998).
- Arber, C., et al. Graft source determines human hematopoietic progenitor distribution pattern within the CD34(+) compartment. Bone Marrow Transplant. 46, 650-658 (2012).
- Fuji, S., et al. Peripheral blood as a preferable source of stem cells for salvage transplantation in patients with graft failure after cord blood transplantation: a retrospective analysis of the registry data of the Japanese Society for Hematopoietic Cell Transplantation. Biol. Blood Marrow Transplant. 18, 1407-1414 (2012).
- Haspel, R. L., Miller, K. B. Hematopoietic stem cells: source matters. Curr. Stem Cell Res. Ther. 3, 229-236 (2008).
- Schraufstatter, I. U., Discipio, R. G., Zhao, M., Khaldoyanidi, S. K. C3a and C5a are chemotactic factors for human mesenchymal stem cells, which cause prolonged ERK1/2 phosphorylation. J. Immunol. 182, 3827-3836 (2009).
