התקן תזרים הלשכה תלת ממדי רומן ללמוד chemokine ביים-extravasation של תאים במחזור בתנאי זרימה פיסיולוגיים
Summary
מכשיר תא הזרימה תלת ממדים הוא רומן<em> במבחנה</em> טכנולוגיה להערכה כמותית וצעד חכם של מפל extravasation של תאים במחזור בתנאים של לחץ גזירה פיסיולוגי. המכשיר לכן ממלא את צורך קריטי במחקרים בסיסיים, פרה, וקליניים של נדידת תאים.
Abstract
Extravasation של מחזורי תאים מהדם ממלא תפקיד מרכזי בתהליכים פיסיולוגיים וpathophysiological רבים, לרבות גרורות ביות וגידול בתאי גזע. מכשיר תא הזרימה תלת ממדים (להלן מכשיר 3D) הוא רומן בטכנולוגית מבחנה המשחזר מאמץ גזירה פיסיולוגי ומאפשר לכל צעד של מפל extravasation התא לכימות. מכשיר 3D מורכב מתא עליון שבו התאים של עניין לזרום תחת מאמץ גזירה, ותא תחתון של בארות סטטי המכילות את chemoattractants של עניין. שני התאים מופרדים באמצעות מוסיף נקבובי מצופים monolayer של תאי האנדותל (EC). ניתן להציב הוספה שנייה אופציונלית עם תאי microenvironmental עניין מייד מתחת לשכבת EC. יחידה מאפשרת חילוף גזי המתח האופטימלי CO 2 להישמר ומספקת נקודת גישה להוסיף או למשוך תאים או תרכובות במהלךניסוי. תאי הבדיקה לזרום בתא עליון בלחץ הגזירה הרצויה (קצב זרימה) הנשלט על ידי משאבת peristaltic. בסופו של הניסוי, התאים במחזור והגרו נאספים לניתוח נוסף. ניתן להשתמש במכשיר 3D לבחון תא ומתגלגל על הידבקות לEC תחת לחץ גזירה, גלגול בתגובה לchemokine הדרגתיים, התנגדות ללחץ גזירה, היווצרות אשכול והישרדות תא. בנוסף, הוספה השנייה אופציונלית מאפשרת את ההשפעות של crosstalk בין האיחוד האירופי ובתאי microenvironmental כדי להיבחן. יישומי translational של מכשיר 3D כוללים בדיקה של תרופות מועמדות שנדידת תאי היעד וחיזוי בהתנהגות vivo של תאים לאחר הזרקה תוך ורידית. לכן, מכשיר 3D הרומן הוא כלי תכליתי וזול כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים המתווכים extravasation הסלולרי.
Introduction
extravasation התא הוא תהליך שבו תאים במחזור הדם ולצאת מהוא רכיב קריטי של תגובות פיסיולוגיות רבות בגוף. התהליך חשוב גם להתחדשות רקמות, כמו למשל, כאשר תאים טיפוליים גויסו מרקמות לתוך כלי הדם (או הזרקה תוך ורידית) נודדים דרך כלי הדם ולצאת ממחזור הדם לאתרים של פציעה או ניוון. Extravasation הוא גם מרכיב קריטי של פתוגנזה של מחלות רבות, כולל דלקת, דחייה של מערכת חיסון, אוטואימוניות, וגרורות גידול.
Extravasation הוא תהליך רב שלבים מורכבים שכרוכים באינטראקציה של מחזורי תאים עם תאי האנדותל (EC) בתנאים של זרימה פיזיולוגית. התהליך מורכב (א) מתגלגל תא, (ב) הידבקות חברה אל פני השטח luminal של EC, ו (ג) על פני גלגול EC. חשוב מכך, כל צעד של מפל extravasation מוסדר על ידי קבוצת משנה של גell מולקולות מינים ספציפי סוג ספציפי ו. עם זאת, המנגנונים המולקולריים המפורטים המסדירים extravasation של תת תא ספציפי אינם מובנה היטב, בעיקר בשל הקושי הטכני של משחזר את התנאים בדם. מכשיר 3D הרומן מתואר כאן נועד להתגבר על האתגרים טכניים אלה ולאפשר ניסויים שיש לבצע שישפרו את ההבנה של הביולוגיה של נדידת תאים שלנו.
המולקולות שמתווכות נדידת תאים הן מטרות טיפוליות חשובות. הבנה מפורטת של האירועים המולקולריים השולטים בהגירה של תאים מסוגים ספציפיים תסייע בזיהוי מטרות חדשות לקידום הטיפולי או העיכוב של extravasation. לדוגמה, התערבויות המשפרות את הנדידה של תאי גזע טיפוליים (בין אם נובעים מרקמות עובר למבוגרים, ילוד או אפילו מ) לכיוון אתרים של פציעה או ניוון תהיה תועלת רבה בהתחדשות רקמות.יש עניין גובר והולך בדור במבחנה של תאי גזע טיפוליים, כוללים תאים שמקורם ממקורות, וpluripotent בתאים לשעבר vivo מניפולציות גזע בוגרים (הרחיב, מניפולציות גנטית, וpretreated עם אנזימים שונים) 1. לפיכך, יש צורך בטכנולוגיות חדישות כדי להעריך את איכותם של תאי גזע לפני שהם משמשים למטרות טיפוליות. בין פרמטרים אחרים, התאים חייבים להיות מסוגלים לצאת ממחזור הדם בצורה יעילה, מפני שטיפולים בהפרעות multifocal עשויים לדרוש עירוי לוריד של תאי הגזע 2. ואכן, אחד האתגרים הנוכחיים בביולוגיה של תאי גזע הוא להתגבר על היעילות הנמוכה ביותר שבה תאי גזע לאתרי הבית של נזק לרקמות 3-6, המדגיש את הצורך להתייחס לפער הזה בהבנה של נדידת תאי גזע שלנו. בניגוד לכך, אסטרטגיות שנדידת תאי בלוק על ידי מיקוד מולקולות ביות ספציפית תהיה שימושית לטיפול במחלות אוטואימוניות וflammatory כמו גם סרטן גרורתי. לפיכך, הבנת המנגנונים המולקולריים המתווכים את יחסי הגומלין בין תאים במחזור ו-EC במהלך נדידת תאים וextravasation היא רלוונטית לרפואת translational וגילוי תרופות, כמו גם למדע בסיסי.
כרגע יש מספר השיטות זמינות כדי ללמוד היבטים של נדידת תאים שונים. עם זאת, יש שיטות אלה ליקויים שניתן להתגבר עם מכשיר 3D החדש.
מודלים של בעלי חיים:
מודלים של בעלי חיים כמו עכברי מדוכאי חיסון ועכברים מניפולציות גנטית, היו כלים שימושיים ללימודי ההגירה של תאים אנושיים in vivo. עם זאת, חסרון משמעותי אחד למודלים אלו הוא שתאים אנושיים אינטראקציה גרועה עם מולקולות הדבקה בהווה על העכבר EC, בין השאר בשל הבדלי רצף מינים ספציפיים במולקולות רבות משטח סלולרי. לפיכך, השימוש במכרסמים ללמודנדידת תאים אנושית היא לא סבירה כדי לשקף אותנטי לאירועים במיטות כלי דם איבר ספציפי לאדם. בנוסף, במודלי vivo אינם מתאימים להקרנת תפוקה גבוהה של מועמדים לסמים. הקונבנציונלי במודלי vivo באמצעות ללמוד תא ביות אינו מבחין בין מדרגות מפל extravasation השונות, ולכן קשה לזהות ולמקד את פרודות ביות רומן. גישת מיקרוסקופיה intravital פותחה כדי לתת מענה לצורך זה וכבר הסביר, עם זאת, טכניקה זו היא בזמן ומאוד עתיר עבודת 7,8.
מבחני גלגול סטטי:
Transwell או הגירת וידן קאמרית מבחני מדד תא על פני קרום ונקבובי נמצאים בשימוש נרחב בלימודי הגירה. יש assay יתרון שניתן להשתמש בו כדי ללמוד לא רק תנועתיות תא ותא במטריצה תאית (ECM) אינטראקציות, אלא גם הגירת chemokine בתיווך של תאיםפני monolayer EC גדלה על הקרומים נקבוביים. למרבה הצער, את הפנוטיפ והתפקוד של EC בתנאים סטטיים שונים באופן משמעותי מאלה שתחת זרימה פיזיולוגית 9,10. לפיכך, באירועים המתרחשים בchemotactic מבחני Transwell לא נאמנה לחקות את יחסי הגומלין בין תאים וEC נודדים תחת מאמץ גזירה. בנוסף, הצעד "מתגלגל" של מפל הביות, מה שמוסיף ממד נוסף של הסלקטיביות לתהליך הכולל, אינו מתרחש במבחני Transwell סטטיים. וכך, בעוד טכנולוגיה זו אינה מאפשרת הערכה כמותית של chemokine נדידת תאים בתיווך מול monolayer EC, הוא מוגבל על ידי חוסר היכולת שלו לספק את מאמץ הגזירה המחקה את זרימת דם בגוף חי.
מבחני תחת לחץ גזירה:
לחץ גזירת ול ידוע לשחק תפקיד חשוב בויסות תפקוד EC 9,10. כוחות גזירה לגרום להפעלה מהירה של מפלי איתות, transcגורמי ription, ועל ביטוי גנים בהפרש EC 11,12. מידע זה הוביל לפיתוח של הדור הבא של מבחני הדבקה – תאי זרימה למינרית מקבילים ונימים – ללמוד מתגלגל והדבקה של תאים לEC בתנאים של מאמץ גזירת 7,13. הגורם המגביל עבור מבחני אלה הוא שהם יכולים למדוד רק מתגלגלים והידבקות, אך אינו מבחין בין תא חסיד שילכו על מנת מתגלגל ותא חסיד כי הוא "נעצר" על monolayer EC ולא מתגלגל. יתר על כן, מבחני הללו אינם יכולים למדוד את ההגירה של תאים כלפי שיפוע chemokine.
מספר דיווחים תארו את יכולתם של תאים חסיד לזחול מתחת monolayer EC גדל על שקופיות זכוכית בתנאים של זרימה 14. המגבלות לטכניקת זחילה זו כוללות: הוא מנתח רק מספר מוגבל של תאים, הוא שאינן כמותי, הוא מנתח את התא זוחל על המטריצה וcelמשטח L אבל לא הגירה לכיוון שיפוע chemotactic, והיא אינו מאפשר לתאי transmigrated להיות מבודדים. וכך, למרות שassay זה יש את היתרון של יישום מאמץ גזירה לmonolayer EC, זה לא יכול לכמת הגירה של תאים כלפי שיפוע chemokine.
טכנולוגיית 3D הרומן המתוארת כאן מתגברת על רבים מהחסרונות הללו על ידי שילוב של כוח גזירה (תא העליון) עם שיפוע chemokine סטטי (בתא תחתון) ומאפשרת הערכה כמותית של כל שלב ושלב של מפל extravasation (איור 1). יכול לשמש גם מכשיר לחקור כיצד crosstalk בין EC וmicroenvironment משפיע על יכולתו של האיחוד האירופי לתמוך extravasation של תאים במחזור. הפרוטוקול הבא מתאר את המתודולוגיה צעד האחרת צעד לשימוש במכשיר תא זרימת 3D.
Protocol
Representative Results
Discussion
מכשיר 3D יכול להיות שימושית עבור טכנולוגית מחקר בתחומים שונים, כולל בתאי גזע ביולוגיה, ביולוגיה של כלי דם, המטולוגיה, אונקולוגיה, אוטואימוניות, ודלקת. מכשיר 3D יהיה שימושי במיוחד עבור חוקרים לומדים תאי hematopoietic, mesenchymal, עצביים, ושני גזע כדי לחקור את המנגנונים מולקולריים המסדירים את כל צעד של מפל extravasation תאי הגזע. חוקרים לומדים נדידת תאים יכולים גם להשתמש בהתקן זה כדי לבחון את המנגנונים השונים של הנדידה-T ו-B לימפוציטים, מונוציטים, נויטרופילים, אאוזינופילים, תאי NK, ותאים נודדים אחרים. בביולוגיה של כלי דם, המכשיר יהיה שימושי להערכת ההשפעה של microenvironment המקומי ביכולת של האיחוד האירופי לתמיכה בגיוס תא ולחקות את מחסום דם המוח במבחנה. לחוקרים שהתמקדו בהיווצרות מחלה, ניתן להשתמש במכשיר כדי ללמוד את הנדידה של תאי T ציטוטוקסיים ללבלב בסוכרת מסוג, מיילהשתלבות של אאוזינופילים לריאות של חולי אסתמה, ההגירה של נויטרופילים, מונוציטים, ולימפוציטים לתוך אתרים של דלקת במגוון של הפרעות, הגיוס של תאים לפצוע אתרי ריפוי, האינטראקציה של תאי T ציטוטוקסיים עם neovasculature, וגיוס של תאי T ציטוטוקסיים לתוך גידולים.
מכשיר 3D הרומן יהיה גם כלי שימושי למדע translational וקליני לפיתוח תרופות והקרנה. כך, למשל, ניתן להשתמש במכשיר כדי לייעל את הכנת השעיות תא טיפולית לעירוי לוריד, כדי לבדוק הגיוס של תאים טיפוליים לרקמות פגועות לעומת רקמות נורמליות, ולבחון את תפקידו של האיבר המסוים או רקמת האנדותל וmicroenvironment בזה תהליך. לפיתוח תרופות, יכול לשמש מכשיר לבדיקת מועמדי תרופה שתאים סרטניים היעד ולחסום כל צעד של מפל extravasation, כדי לבדוק את התאים נודדים כתרופה מספקותרכב Y לאתרי גידול, כדי לבדוק תרופות המווסתות את התפקוד של האנדותל איבר ספציפי לאדם או microenvironment רקמות הספציפיים המקומי, ולבחון את שילובים של תרופות המסדירים את הפעולות של מפל הביות שונות. לבסוף, כאשר הוסב למערכת תפוקה גבוהה, ניתן להשתמש במכשיר לסינון מולקולות קטנות, פפטידים, ונוגדנים שמולקולות מטרת סחר בתיווך תא.
פרטים וטיפים טכניים
רולינג והידבקות תחת זרימתם השלבים הקריטיים במפל extravasation ולתרום באופן משמעותי ליעילות של נדידת תאים בגוף חי. יש לציין, צעדים אלה לא תורמים למבחנים סטטיים במבחנה. עם זאת, מבחני גלגול סטטיים שימושיים כמו פקדים שליליים בניסויים בדיקת ההשפעות של לחץ גזירה על הישרדות תא ותפקודו, ובכלל זה את היכולת של EC כדי לתמוך באינטראקציות זיקה נמוכות (גלגול) והידבקות משרד.
הבחירה של מדיום לניסויים במכשיר 3D היא חשובה. מדיה מכילה גורמי גדילה שונים שעשויים להשפיע על ההישרדות של תאים במחזור, במיוחד בתקופות דגירה ארוכות. בנוסף, הריכוזים של Ca 2 + ו Mg 2 +, מה שעשוי להשפיע על אינטראקציות דבקים בתנאים של זרימה פיזיולוגית, להשתנות במידה ניכרת בתקשורת והתרבות מסחרית. פרטים טכניים נוספים שצריכים להילקח בחשבון בעת תכנון ניסויים עם מכשיר 3D הם דנו בהמשך.
בחירה של monolayer EC
החתימה פני התא של EC מושפעת מפרמטרים שונים, בין המינים ורקמות ממוצא ותנאי תרבית התאים, אשר צריך להילקח בחשבון בתכנון הניסוי. חלק EC הנפוץ כולל ריאות כלי הדם EC-נגזר (LDMVEC), מח עצם שנגזר EC (BMDEC), EC המוח-derived (BDEC), וHUVEC.את המאפיינים של EC גם להשתנות עם המקור שלהם. לדוגמה, BMDEC constitutively המפורש selectins וVCAM-1, אשר אחראי לגלגול והידבקות, ואילו BDEC, LDMVEC, וHUVEC אינם מבטאים מולקולות אלה בתנאים רגילים. לכן, ניתן pretreated מוסיף מצופים BDEC, LDMVEC, וHUVEC עם TNF α (10 ng / ml, 4 שעות) או לגורמים אחרים מחקה את הדלקת ולגרום לביטוי של מולקולות ביות.
בדיקת crosstalk עם microenvironment המקומי
יש עניין הולך וגובר בהבנה כיצד microenvironment המקומי מסדיר את הפונקציות של הקהילה האירופית ומשתתף בextravasation התא. התוצאות שלנו מראות כי החדרת monolayer של תאי סטרומה מתחת monolayer EC מגדילה extravasation של מחזורי תאים באופן משמעותי. ממצא זה מוכיח כי crosstalk בין EC stroma ומשפר את יכולתו של האיחוד האירופי לתמיכה בextravasation של תאים במחזור. Moreover, ההחדרה של תאים מmicroenvironments השונים (כגון: תאי גזע, mesenchymal fibroblasts ריאות, תאים סרטניים, האסטרוציטים) יכולה לעזור לחקות מיטות כלי דם ספציפיות. בפרט, שילוב של EC והאסטרוציטים מוח נגזרות יכול להיות גישה יעילה לחקות את מחסום דם המוח. באופן דומה, תאים המתקבלים ממטופלים, או תאים נורמלים מניפולציות במבחנה, יכולים לעזור לחקות microenvironment חולה ספציפי.
במחקרים שלנו, השתמשנו במוסיף נמוך יותר עם תאי סטרומה גדלו ל 50% מפגש. למרות הצפיפות האופטימלית של תאי microenvironmental על מוסיף תהיה תלויה במטרות של המחקר, ניתן להשפיע בקלות זה ובשליטה.
בחירת שיעור לחץ גזירה
לחץ הגזירה של 0.8 dyn / 2 ס"מ היה בשימוש כאן, כי זה הוכח על ידי פון Andrian et al. להיות בלחץ גזירת microvasculatur מח העצםדואר, שבו תאי אבות היווצרות דם לצאת ממחזור הדם ולהיכנס לרקמות בתנאים רגילים 15 פיסיולוגיים. לעומת זאת, רמות גבוהות יותר של לחץ גזירה הם נצפו בכלי גדול יותר, שבו תא extravasation מוגבל. לפיכך, שיעורי לחץ גזירה גבוהים יכולים לשמש כפקדים נוספים לניסויים הבוחנים extravasation של תאים מסוגים שונים.
ההישרדות של תאים תחת לחץ גזירה תלויה במספר גורמים, כוללים סוג התא ותא טיפולים לשעבר vivo (גונצ'רובה et al., תצפיות שלא פורסמו), ולכן יש להעריך בזהירות במהלך הבדיקה. רגישות תאים לרמות שונות של לחץ גזירה (גזירת התנגדות ללחץ) יכולה להיות מוערכת על ידי תכנות משאבת peristaltic להגדיל את שיעור לחץ הגזירה הדרגתי מ0.8 dyn / 2 עד 6 ס"מ DYN / 2 ס"מ. במהלך בדיקות אלה, ניתן לאסוף תאים מעת לעת מהאולם חילוף הגזים לפקח מוות של תאים באמצעות כאומר כגון הדרת trypan הכחול, Annexin V ומכתים לצרכן, וביטוי אפופטוזיס סמן.
אם ניסויים שנועדו לבחון את ההתנגדות ללחץ גזירה של תאים לשעבר vivo מהונדסים או תאים שמקורם parenchyma, מומלץ שבקרות חיוביות נוספות, כגון תאים נישאים בדם, נכללות בניסויים.
בחירה של הגודל הנקבובית והוספת ציפוי ECM
מוסיף זמינים עם כמה גדלים נקבוביות (3, 5, ו 8 מיקרומטר). הבחירה של גודל נקבובית תהיה תלויה בגודל והמאפיינים של תאי הבדיקה במחזור, שהיא גם במקרה של מבחני Transwell סטטיים. מוסיף עם גודל נקבובית גדול (8 מיקרומטר) מומלצים לבדוק extravasation של תאים גדולים, כגון תאים סרטניים ממקור אפיתל. כדוריות דם לבנות או תאי גזע hematopoietic נבדקים יותר נפוצה עם 5 מוסיף נקבובית מיקרומטר, ומוסיפה 3 נקבובית מיקרומטר שמורות הטוב ביותר לבדיקת extravasation של יםתאי Maller. עם זאת, גודל תא המבחן לבדו אינו הגורם החשוב היחיד, ואנו ממליצים על בדיקה מחדירה עם כמה גדלים נקבוביות.
במחקרים הראשוניים שלנו, בדקנו ECM השונים ביכולתם לתמוך בצמיחה של הנציבות האירופית ובמוסיף לעמוד בלחץ גזירה ל> 4 שעות. ECM נבדק כלל Matrigel, פולי-D-ליזין, פיברונקטין, laminin, סוג אני קולגן, Hydrogel, Meta-קרטין I, II, III, IV, וExtracel. את התוצאות הטובות ביותר לצמיחת EC התקבלו עם Extracel, פיברונקטין וקולגן. עם זאת, בידיים שלנו, בExtracel 0.8 מיקרוגרם / 2 ס"מ מופחת באופן משמעותי הגלגול של תאי בדיקה על פני הקרום. לכן אנו משתמשים כיום פיברונקטין (5 מיקרוגרם / 2 ס"מ) או קולגן (5 מיקרוגרם / 2 ס"מ) לציפוי של מוסיף. עם זאת, הבחירה האופטימלית של ECM יהיה כנראה להיות מושפעת גם הסוג של הקהילה האירופית ואת מאפייני transmigratory של תאי הבדיקה. ניסוי ראשוני צריכה להתבצע כדי לבדוק את integriטיי של monolayer EC גדל על ECM נבחר. כך, למשל, מוסיף מראש מצופי מקום עם monolayers EC בצלחות פטרי מלאה במדיום התרבות, למקם את הכלים שבייקרו ליצור לחץ גזירה (הגדרה נמוכה), ולדגור על 37 מעלות צלזיוס, CO 2 למשך 12 שעות 5%. היושרה של EC לאחר חשיפה ללחץ הגזירה ניתן להעריך באמצעות מכתים סגול גביש.
בחירה של ריכוזי תא בדיקה אופטימליים
היכולת של תאי בדיקה כדי לצאת ממחזור הדם תלויה בהרבה מאפיינים ספציפיים לכל סוג תא. כדי להפיק תוצאות משמעותיות מבחינה סטטיסטית, חייבת להיות מותאמת צפיפות התאים במחזור על מנת להבטיח כי מספר מספיק של תאים נודדים לתוך בארות הבקרה החיוביות. לכן, אנו ממליצים על ביצוע בדיקות ראשוניות עם מגוון של צפיפות תא (לדוגמא 10 3 / מ"ל עד 10 7 / מ"ל) כדי להבין את הקשר בין מספר התאים נטענים למערכת ומספר התאים שעוברים גלגול.
בנוסף, הריכוז האופטימלי במחזור עשוי להיות שונה עבור אותו סוג התא המתקבל ממקורות שונים. לדוגמה, CD34 + תאים הם אוכלוסייה הטרוגנית של תאים המכילה שני תאי גזע hematopoietic ואת אבות שושלת ספציפיים מחויבים. הם יכולים לקבל ממח עצם, התגייס דם היקפי ודם חבל טבור. את CD34 + התאים שמקורם משלושה מקורות אלה הם בעלי יכולות ביות וengrafting שונות 16-18, כך שהתנאים לבדיקת תאים אלה במכשיר 3D אמורים להיות מותאמים לפני מחקר בהיקף מלא.
בחירה של זמן מחזור תא אופטימלי
זמן מחזור האופטימלי צריך להיקבע באופן אמפירי לכל סוג תא. הזמן המינימאלי הנדרש למחזור ניתן להסיק מתוצאות מבחני הגירה סטטיים, אבל זה עשוי להיות extended כאשר התאים נחשפים ללחץ גזירה. מחקרי פיילוט בדיקות פעמים במחזור בין 4 ל 96 שעות מומלצים.
יחידת חילוף הגזים
המטרה העיקרית של יחידת חילוף הגזים היא לשמור על הריכוז האופטימלי של CO 2 במדיום במחזור דרך מכשיר 3D, בדומה להגדרות בחממות תרבית רקמה רגילות. יחידת חילוף הגזים יכולה לשמש גם להוספת תאי בדיקה ותרכובות ולאיסוף בדיקות ודגימות במהלך הבדיקה.
הערכה של מספרים סלולריים בדיקה
ניתן לדגום תאים במחזור בזמנים שונים במהלך הניסוי באמצעות יחידת חילוף הגזים. בסופו של ניסוי, ניתן היו לגבות את התאים שנותרו במחזור הדם מהשקע. כאשר מכשיר 3D הוא מפורק בסופו של הניסוי, ניתן לקצור מהבארות הנמוכות תאי transmigrated ונאספו Fאו ניתוח נוסף. אם תאי הקלט ללא תווית, יכולים להיות מוכתמים תאי transmigrated עם trypan הכחול ותאי חיים / מתים המנויים מיקרוסקופי. לחלופין, את תאי הקלט יכולים להיות מתויגים עם אחד מהצבעים הרבים "התא" הגשש הזמינים להדמית תא חי לפני הטעינה למכשיר 3D, במקרה זה, שנקטף transmigrated תאים צריכים להיות lysed כדי לכמת את הקרינה.
בחירת גודל המדגם האופטימלי
כדי לאפשר ניתוח סטטיסטי, יש לבחור גודל מדגם שיספק כ -80% כוח כדי לזהות את הבדל היפותטית בשינויים הממוצעים באחוזים בין שתי קבוצות כאשר נבדקו ברמה מובהקת של 0.05 באמצעות מבחן t דו צדדי. בהתבסס על הניסיון שלנו עם תאים במח עצם, אנו משתמשים בשלוש בארות בתנאי ניסוי לניסויי מכשיר 3D. עם זאת, גודל המדגם האופטימלי ישתנה בהתאם למטרת הניסוי וצריך להיקבע דוארmpirically. בדיקות מרובות רגרסיה סטטיסטיות, מבחני t דו צדדיים, וניתוח שונות ניתן להשתמש כדי לאמת את הרלוונטיות סטטיסטיות של התוצאות.
בחירה של כמוקינים
ובאשר לכל מבחני הגלגול, הבחירה של chemoattractant תהיה מוכתבת על ידי המאפיינים של תאי הבדיקה ומטרת המחקר. SDF-1 הוא chemoattractant מבוסס היטב על תאי hematopoietic. בידיים שלנו, ריכוז של 50 ng / ml SDF-1 היה אופטימלי כדי לעורר extravasation של תאי אבות היווצרות דם מח עצם הנגזרות. בנוסף, אנו משתמשים C3a וbFGF כchemoattractants לתאי גזע mesenchymal 19. עם זאת, אנו ממליצים titrating כל chemokine והצולב titrating שילובים של כמוקינים לזהות את טווח הריכוז האופטימלי לפני מחקר בקנה מידה מלאה. לסוגי תאים מסוימים, שילוב של גורמי chemotactic עשוי להיות מועיל. אם כמוקינים לתאי בדיקה ספציפיים אינם ידועים או לא זמינים, קוןתקשורת ditioned מימפוציטים מגורה, fibroblasts, ותאים אחרים יכולה לשמש כמקור לchemoattractants.
בחירה של פרמטרי readout
הרבגוניות של מכשיר 3D תרחיב הסוג של גלגול ניסויים שניתן לבצע, ואת ההצלחה של הניסויים תהיה תלויה בשיקול מחושב ועיצוב של פרמטרי readout. ככלל, תאים שנאספו מהתא העליון (מחזור) והתא התחתון (סטטית) צריך להיבדק על כדאיות באותו הזמן כספירת תאים. תאים מסוימים יש סובלנות נמוכה למתח הגזירה הפיזיולוגי שנצפה בmicrovasculature. במקרה זה, את מספר התאים מתים יוגדל בתא העליון. מספר התאים חסיד שנעצרו (או לכוד) על שכבת EC יכול להיות מוערך על ידי immunocytochemistry של סמנים לידי ביטוי במיוחד על ידי תאי הבדיקה. ניתן להשתמש בנוגדנים ספציפיים לCD31 וvWFכדי לזהות EC ולאפשר אפליה בין תאי הבדיקה וEC. בנוסף, על שלמות monolayer EC צריכה להיות במעקב בסוף כל אחת מבדיקות.
את סוגי ניתוחים שבוצעו עם את התאים שנאספו יהיו תלויים במטרות הניסוי החוקר, אבל יכולים לכלול שינויים בניתוח ביטוי גנים על ידי microarrays וqPCR, ביטוי מולקולת פני השטח על ידי ניתוח FACS, הפעלה של מסלולי איתות על ידי FACS וסופג מערבי, וגורם הפרשה על ידי ELISA. מערך עצום של בדיקות פונקציונליות אפשרי בתאים שנאספו במבחנה, כפי שמעיד על ידי העבודה שלנו שבו אנו תרבית תאי מח עצם transmigrated למנות את תאי אבות היווצרות הדם (איור 3). הדגימות שנאספו יכולה גם להיבדק במגוון רחב של מבחני בvivo.
פרמטר חשוב אחד שיכול לעזור לחזות את ההתנהגות של תאי בדיקת in vivo הוא נוטהency של תאים מסוימים כדי ליצור אגרגטים בשיעורים של מתח גזירה שונים. לדוגמה, תאים טיפוליים שעוברים היווצרות המצרפי במכשיר 3D אולי יש נטייה גדולה יותר ליצירת גושים לאחר עירוי לוריד ולגרום לחסימת כלי דם חריפה in vivo (גונצ'רובה et al., תצפיות שלא פורסמו). היווצרות המצרפי יכולה להיות במעקב מיקרוסקופי על ידי דגימת תאי הבדיקה במהלך או לאחר סיומו של ניסוי מכשיר 3D.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לצ'אק סקוט מק 'נייט מויקטור והלשכה מרכזית לסטטיסטיקה המדעית החברה Inc (www.cbsscientific.com) לקבלת סיוע, הנדסה וייצור של חדר 3D, יחידת חילוף גזים, ומוסיף. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומי לבריאות (מענקי R21DK067084 וR43CA141782 לSKK).
Materials
| Reagent/Material | |||
| PVC tubing (bore 1.42, wall 0.8) | Watson-Marlow Limitid | 981.0142.000 | |
| 3D Chamber | C.B.S.Scientific | FC-1000 | |
| Gas exchange unit | C.B.S.Scientific | FCR-1000 | |
| Inserts | C.B.S.Scientific | FCI-1005U | |
| Collagen Bovine,Type I | BD Biosciences | 354231 | |
| Hydrochloric Acid 0.1M | VWR | BDH3200-1 | |
| PBS | Invitrogen | 14190 | |
| HUVEC | Lonza | CC- 2517 | |
| EGM Bullet Kit (cc – 3121 & cc – 4133) | Lonza | CC – 3124 | |
| Trypsin Neutralizing Solution | Lonza | CC-5002 | |
| Trypsin | Lonza | CC-5012 | |
| HEPES | Lonza | CC-5024 | |
| SDF-1 | R7D System | 460-SD | |
| Extracel Trial 2.5 Kit | Glycosam Byosystems | GS211 | |
| Fibronectin, human , nature | BD Biosciences | 356008 | |
| Poly-D-lysine | Millipore | A-003-E | |
| BD Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Human Brain Microvascular Endothelial Cells | ScienCell | 1000 | |
| Endotelial Cell Medium (ECM) for brain cells | ScienCell | 1001 | |
| Trypan Blue | StemCells Tecnologies | 7050 | |
| TNF-alfa, 10 μg | Invitrogen | PHC3015 | |
| VCAM-1, mouse anti-human, CD106-FITC | Southern Bioteck | 9519-02 | |
| Propidium Iodide Staining Solutuion | BD Pharmingen | # 556463 | |
| Frozen Human Cord Blood CD34+ cells | StemCell | CB007F | |
| Frozen Human Cord Blood CD34+ cells | Zenbio | SER – CD34-F | |
| MethoCult GF M3434 | StemCells Tecnologies | GFM3434 | |
| Mouse Methylcellulose complete media | R&D | HSC007 | |
| Anti-Von Willibrand Factor antibody | abcam | C# ab11713 | |
| Petry dish (35 x 10 mm) | VWR | CA25373-041 | |
| 15 ml tubes | VWR Fisher | 21008 – 918 | |
| Tissue culture flasks 75cm2 | VWR | BD353136 | |
| Cristal violet | Sigma | C-3886-25G | |
| Dissecting forceps, curved | VWR | 82027-384 | |
| 1,000 μl Pipette tips | VWR | 83007-380 | |
| 1 – 200 μl Pipette tips | VWR | 37001-530 | |
| Equipment | |||
| Peristaltic pump | Watson-Marlow Limitid | 403U/VM3 |
References
- Daley, G. Q. The promise and perils of stem cell therapeutics. Cell Stem Cell. 10, 740-749 (2012).
- Khaldoyanidi, S. Directing stem cell homing. Cell Stem Cell. 2, 198-200 (2008).
- Laird, D. J., von Andrian, U. H., Wagers, A. J. Stem cell trafficking in tissue development, growth, and disease. Cell. 132, 612-630 (2008).
- Lapidot, T., Kollet, O. The brain-bone-blood triad: traffic lights for stem-cell homing and mobilization. Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. 2010, 1-6 (2010).
- Sackstein, R. Glycoengineering of HCELL, the human bone marrow homing receptor: sweetly programming cell migration. Ann. Biomed. Eng. 40, 766-776 (2012).
- Smart, N., Riley, P. R. The stem cell movement. Circ. Res. 102, 1155-1168 (2008).
- Khaldoyanidi, S. K., et al. MDA-MB-435 human breast carcinoma cell homo- and heterotypic adhesion under flow conditions is mediated in part by Thomsen-Friedenreich antigen-galectin-3 interactions. J. Biol. Chem. 278, 4127-4134 (2003).
- Le Devedec, S. E., et al. Two-Photon Intravital Multicolour Imaging to Study Metastatic Behaviour of Cancer Cells in vivo. Methods Mol. Biol. 769, 331-349 (2011).
- Barakat, A. I. Responsiveness of vascular endothelium to shear stress: potential role of ion channels and cellular cytoskeleton (review). Int. J. Mol. Med. 4, 323-332 (1999).
- Fisher, A. B., Chien, S., Barakat, A. I., Nerem, R. M. Endothelial cellular response to altered shear stress. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 281, L529-L533 (2001).
- Nerem, R. M. Shear force and its effect on cell structure and function. ASGSB Bull. 4, 87-94 (1991).
- Topper, J. N., Gimbrone, M. A. Blood flow and vascular gene expression: fluid shear stress as a modulator of endothelial phenotype. Mol. Med. Today. 5, 40-46 (1999).
- Giavazzi, R., Foppolo, M., Dossi, R., Remuzzi, A. Rolling and adhesion of human tumor cells on vascular endothelium under physiological flow conditions. J. Clin. Invest. 92, 3038-3044 (1993).
- Cinamon, G., et al. Novel chemokine functions in lymphocyte migration through vascular endothelium under shear flow. J. Leukoc. Biol. 69, 860-866 (2001).
- Mazo, I. B., et al. Hematopoietic progenitor cell rolling in bone marrow microvessels: parallel contributions by endothelial selectins and vascular cell adhesion molecule 1. J. Exp. Med. 188, 465-474 (1998).
- Arber, C., et al. Graft source determines human hematopoietic progenitor distribution pattern within the CD34(+) compartment. Bone Marrow Transplant. 46, 650-658 (2012).
- Fuji, S., et al. Peripheral blood as a preferable source of stem cells for salvage transplantation in patients with graft failure after cord blood transplantation: a retrospective analysis of the registry data of the Japanese Society for Hematopoietic Cell Transplantation. Biol. Blood Marrow Transplant. 18, 1407-1414 (2012).
- Haspel, R. L., Miller, K. B. Hematopoietic stem cells: source matters. Curr. Stem Cell Res. Ther. 3, 229-236 (2008).
- Schraufstatter, I. U., Discipio, R. G., Zhao, M., Khaldoyanidi, S. K. C3a and C5a are chemotactic factors for human mesenchymal stem cells, which cause prolonged ERK1/2 phosphorylation. J. Immunol. 182, 3827-3836 (2009).
