A Novel Dreidimensionale-Flow-Kammer-Geräte zu Chemokine gerichtet Extravasation von zirkulierenden Zellen unter physiologischen Bedingungen zu studieren Durchfluss
Summary
Die dreidimensionale Strömungskammer Vorrichtung ist eine neuartige<em> In vitro</em> Technologie für die quantitative und stufenweise Auswertung der Extravasation Kaskade von zirkulierenden Zellen unter Bedingungen physiologischer Scherspannung. Das Gerät füllt daher eine kritische Notwendigkeit für grundlegende, präklinischen und klinischen Studien der Zellwanderung.
Abstract
Extravasation von zirkulierenden Zellen aus dem Blut spielt eine zentrale Rolle in vielen physiologischen und pathophysiologischen Prozessen, einschließlich Stammzellen Homing und Metastasierung. Die dreidimensionale Fließkammer Gerät (im Folgenden die 3D-Gerät) ist eine neuartige Technologie, die in vitro physiologischer Scherspannung erschafft und ermöglicht jedem Schritt der Zelle Extravasation Kaskade quantifiziert werden. Die 3D-Gerät besteht aus einem oberen Abteil, in dem die interessierenden Zellen zirkulieren unter Scherbelastung und einer unteren Kammer des statischen Vertiefungen, die Lockstoffe von Interesse enthalten. Die beiden Kammern sind durch poröse Einsätze mit einer Monoschicht aus Endothelzellen (EC) beschichtet getrennt. Ein optionaler zweiter Einsatz mit microenvironmental Zellen von Interesse kann sofort unter der EC-Schicht platziert werden. Ein Gasaustausch Gerät ermöglicht die optimale CO 2 Spannung gehalten werden und bietet einen Zugangspunkt hinzuzufügen oder zu entziehen Zellen oder Verbindungen, die während derExperiment. Die Testzellen zirkulieren in der oberen Kammer an der gewünschten Scherbeanspruchung (Volumenstrom) durch eine peristaltische Pumpe gesteuert. Am Ende des Versuches werden die zirkulierende und migriert Zellen für weitere Analysen gesammelt. Die 3D-Gerät kann verwendet werden, um Zellrollen auf und Haftung der EG unter Scherbeanspruchung, Seelenwanderung in Reaktion auf Chemokin-Gradienten, Beständigkeit gegen Scherspannung, Cluster-Bildung und das Überleben der Zelle zu untersuchen. Darüber hinaus ermöglicht das optionale zweite Einsatz die Auswirkungen von Übersprechen zwischen EG und microenvironmental Zellen untersucht werden. Die translationale Anwendungen der 3D-Gerät gehören Testen von Wirkstoffkandidaten, die auf die Zellwanderung und die Vorhersage der In-vivo-Verhalten von Zellen nach intravenöser Injektion. Somit ist die neue 3D-Gerät ein vielseitiges und preiswertes Tool, um die molekularen Mechanismen, die zellulären Extravasation vermitteln studieren.
Introduction
Handy Extravasation ist der Prozess, durch den zirkulierenden Zellen verlassen die Blutbahn und ist eine wichtige Komponente für viele physiologische Reaktionen im Körper. Das Verfahren ist auch für die Geweberegeneration wichtig, da zum Beispiel, wenn therapeutische Zellen aus dem Gewebe in die Blutgefäße (oder intravenös injiziert) mobilisiert durch das Gefäßsystem wandern und verlassen die Zirkulation zu Websites von Verletzungen oder Degeneration. Extravasation ist auch ein wichtiger Bestandteil der Pathogenese vieler Krankheiten, einschließlich Entzündung, Immunabwehr, Autoimmunität und der Metastasierung.
Extravasation ist ein komplexes mehrstufiges Verfahren, die die Interaktion von zirkulierenden Zellen, die mit Endothelzellen (EC) unter Bedingungen physiologische Strömung umfasst. Das Verfahren umfasst (a) Zelle Walzen, (b) eine feste Haftung an der luminalen Oberfläche der EG, und (c) Seelenwanderung in der EG. Wichtig ist, dass jeder Schritt des Extravasation Kaskade von einer Teilmenge von c geregeltell typspezifischen und Spezies-spezifischen Molekülen. Allerdings sind die genauen molekularen Mechanismen, die Extravasation von spezifischen Zellpopulationen regulieren nicht gut verstanden, vor allem wegen der technischen Schwierigkeit, rekapituliert die Bedingungen in den Blutkreislauf. Die neuartige 3D hier beschriebene Gerät wurde entwickelt, um diese technischen Herausforderungen überwunden werden können und Experimente durchgeführt werden, die unser Verständnis der Biologie der Zelle Migration zu verbessern.
Die Moleküle, die Zellwanderung zu vermitteln sind wichtige therapeutische Ziele. Ein detailliertes Verständnis der molekularen Ereignisse, die die Migration von spezifischen Zelltypen steuern wird bei der Identifizierung neuer Targets für die therapeutische Förderung oder Hemmung der Extravasation unterstützen. Zum Beispiel würde Eingriffe, die die Wanderung von therapeutischen Stammzellen (ob von Erwachsenen, Neugeborenen oder auch aus fetalem Gewebe abgeleitet) in Richtung Stelle einer Verletzung oder Degeneration Verbesserung von großem Nutzen bei der Geweberegeneration werden.Es besteht ein wachsendes Interesse in der in-vitro-Herstellung von therapeutischen Stammzellen, einschließlich Zellen aus pluripotenten Quellen abgeleitet und in ex vivo manipuliert adulten Stammzellen (erweitert, genetisch manipuliert und mit verschiedenen Enzymen vorbehandelt) 1. Es besteht daher ein Bedarf an neuen Technologien, um die Qualität der Stammzellen zu bewerten, bevor sie für therapeutische Zwecke verwendet werden. Unter anderen Parametern, müssen die Zellen in der Lage, effizient verlassen den Kreislauf, weil Behandlungen für multifokale Störungen können die intravenöse Verabreichung der Stammzellen 2 erfordern. Tatsächlich ist eine der aktuellen Herausforderungen in der Stammzellbiologie, die extrem niedrige Effizienz zu überwinden, mit denen Stammzellen beherbergt Websites von Gewebeschäden 3-6, Hervorhebung der Notwendigkeit, diese Lücke in unserem Verständnis von Stammzellen Migration anzugehen. Im Gegensatz dazu, dass Strategien Block Zellmigration durch Referenzieren auf bestimmte Moleküle wäre nützlich für die Behandlung von inentzündlichen und Autoimmunerkrankungen sowie metastasiertem Krebs. So, das Verständnis der molekularen Mechanismen, die die Wechselwirkungen zwischen zirkulierenden Zellen und EG während der Zell-Migration und Extravasation vermitteln ist relevant für translationale Medizin und Wirkstoffforschung sowie der Grundlagenforschung.
Derzeit gibt es eine Reihe von Methoden zur Verfügung, um verschiedene Aspekte der Zellwanderung studieren. Allerdings haben diese Methoden Nachteile, die mit der neuen 3D-Gerät überwunden werden können.
Tiermodelle:
Tiermodelle, wie immungeschwächten Mäusen und genetisch manipulierte Mäuse, wurden nützliche Werkzeuge, um die Migration von menschlichen Zellen in vivo zu untersuchen. Jedoch ist ein erheblicher Nachteil für diese Modelle, daß menschliche Zellen schlecht Interaktion mit Adhäsionsmolekülen vorliegenden on mouse EC, teilweise aufgrund artspezifischen Sequenz Unterschiede in viele Moleküle der Zelloberfläche. Somit ist die Verwendung von Nagetieren studierenmenschlichen Zelle Migration unwahrscheinlich ist authentisch spiegeln die Ereignisse in der menschlichen Organ-spezifische Gefäßbetten. Darüber hinaus in vivo Modelle sind nicht geeignet für das Hochdurchsatz-Screening von Wirkstoffkandidaten. Die herkömmliche in vivo Modelle mit zu Zelle Homing studieren nicht zwischen den verschiedenen Stufen des Extravasation Kaskade unterscheiden, so dass es schwer zu identifizieren und gezielt neue Moleküle Homing. Die Intravitalmikroskopie Ansatz wurde entwickelt, um diesem Bedarf zu begegnen und wurde informativ, jedoch ist diese Technik sehr zeit-und arbeitsintensiv 7,8.
Statische Seelenwanderung Assays:
Transwell oder Boyden-Kammer-Assays Maßnahme Zellwanderung in einer porösen Membran und sind weit verbreitet in der Migrationsforschung verwendet. Der Test hat den Vorteil, dass es verwendet werden kann, um nicht nur Zellmigration und Zell-extrazelluläre Matrix (ECM)-Interaktionen zu untersuchen, sondern auch Chemokin-vermittelte Migration von Zellenin einer EG-Monoschicht auf der porösen Membranen entwickelt. Leider unterscheiden sich der Phänotyp und Funktion der EG unter statischen Bedingungen erheblich von denen unter physiologischen fließen 9,10. So müssen die chemotaktische Ereignisse, die in Transwell-Assays nicht auftreten getreu nachahmen, die Wechselwirkungen zwischen wandernden Zellen und EG unter Scherbeanspruchung. Darüber hinaus bedeutet die "rollenden" Schritt des Homing-Kaskade, die eine zusätzliche Dimension der Selektivität ergänzt die allgemeine Prozess, nicht in statischen Transwell-Assays auftreten. Während also diese Technologie nicht zulässt quantitative Auswertung von Chemokin-vermittelten Zell-Migration in der EG Monoschicht wird durch seine Unfähigkeit, die Scherspannung, die den Blutfluss in vivo nachahmt bereitzustellen begrenzt.
Assays unter Schubspannung:
Wandschubspannung ist bekannt, dass eine wichtige Rolle bei der Regulierung der EG-Funktion 9,10 spielen. Scherkräfte induzieren schnelle Aktivierung von Signalkaskaden, umschriftription Faktoren und differentiellen Genexpression in EG 11,12. Diese Information führte zu der Entwicklung der nächsten Generation von Adhäsionsassays – parallel laminare Strömung Kammern und Kapillaren – zu studieren und rollenden Adhäsion von Zellen an EG unter den Bedingungen der Schubspannung 7,13. Der limitierende Faktor für diese Tests ist, dass sie messen nur Rollen und Haftung, aber nicht zwischen einem haftenden Zelle, die fortfahren würde, transmigrate und einem Anhänger, die Zelle "verhaftet" auf dem EG Monoschicht und würde nicht transmigrate unterscheiden. Darüber hinaus können diese Tests nicht messen Migration von Zellen zu einer Chemokingradienten.
Mehrere Berichte haben die Fähigkeit von anhaftenden Zellen zu unter einer EG Monoschicht auf Glasplättchen unter den Bedingungen der Strömung 14 gewachsen kriechen beschrieben. Die Grenzen dieser kriechen Technik sind: sie analysiert nur eine begrenzte Anzahl von Zellen, es ist nicht quantitativ, sondern analysiert Zelle kriechen auf der Matrix und CELl Oberfläche, aber nicht die Migration in Richtung eines chemotaktischen Gradienten, und es nicht zulassen, die transmigrierten Zellen isoliert werden. Obwohl dieser Test hat den Vorteil der Anwendung von Scherspannung auf den EG-Monoschicht, kann es nicht zu quantifizieren Migration von Zellen zu einer Chemokingradienten.
Die neuartige 3D-Technologie hier beschriebenen überwindet viele dieser Mängel durch die Kombination von Querkraft (oberes Fach) mit einer statischen Chemokingradienten (untere Kammer) und erlaubt quantitative Auswertung von jedem Schritt der Extravasation Kaskade (Abbildung 1). Das Gerät kann auch verwendet werden, um zu untersuchen, wie Übersprechen zwischen der EG und der Mikroumgebung der Fähigkeit der EG Extravasation von zirkulierenden Zellen unterstützt beeinflusst werden. Das folgende Protokoll beschreibt den Schritt-für-Schritt-Methode für die Verwendung der 3D Fließkammer Gerät.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die 3D-Gerät kann eine nützliche Technik für die Forschung in verschiedenen Bereichen wie Stammzellbiologie, vaskuläre Biologie, Hämatologie, Onkologie, Autoimmunerkrankungen und Entzündungen sein. Die 3D-Gerät ist besonders nützlich für die Forscher studieren hämatopoetische, mesenchymale, neuronalen und andere Stammzellen, um die molekularen Mechanismen, die die einzelnen Schritte der Stammzelle Extravasation Kaskade zu untersuchen. Forscher, die Zellwanderung kann auch mit diesem Gerät die unterschiedlichen Mechanismen der wandernden T-und B-Lymphozyten, Monozyten, Neutrophilen, Eosinophilen, NK-Zellen und anderen wandernden Zellen zu untersuchen. In Gefäßbiologie, wird das Gerät nützlich sein für die Beurteilung der Wirkung der lokalen Mikroumgebung auf die Fähigkeit der EG Zellrekrutierung zu unterstützen und die Blut-Hirn-Schranke in vitro nachzuahmen. Für Forscher mit Schwerpunkt auf Krankheitsentstehung, kann das Gerät verwendet werden, um die Migration von zytotoxischen T-Zellen in der Bauchspeicheldrüse bei Typ-I-Diabetes, die mi studierengration von Eosinophilen in die Lunge von Asthma-Patienten, die Migration von Neutrophilen, Monozyten und Lymphozyten in entzündeten Stellen in einer Vielzahl von Erkrankungen, die Rekrutierung von Zellen zur Heilung Websites gewickelt, die Interaktion von zytotoxischen T-Zellen mit dem Neovaskulatur und Rekrutierung von zytotoxischen T-Zellen in Tumoren.
Die neuartige 3D-Gerät wird auch ein nützliches Werkzeug für die translationale Wissenschaft und für die präklinische Entwicklung von Arzneimitteln und Screening. Zum Beispiel kann das Gerät verwendet, um die Herstellung von therapeutischen Zellsuspensionen für die intravenöse Verabreichung zu optimieren, um die Einstellung von therapeutischen Zellen an verletztes Gewebe im Vergleich zu normalem Gewebe zu testen, und die Rolle der spezifischen Organ oder Gewebe Endothel und Mikroumgebung in diese zu untersuchen Prozess. Für Entwicklung von Medikamenten, könnte das Gerät verwendet, um Wirkstoffkandidaten zu testen, die auf Tumorzellen und blockiert jeden Schritt der Extravasation Kaskade, die Migration Zellen als ein Medikament liefern testeny Fahrzeug Tumorstellen, um Medikamente, die die Funktion der menschlichen Organ-spezifische Endothel oder der lokalen Gewebe-spezifischen Mikroumgebung zu regulieren und Kombinationen von Medikamenten, die verschiedenen Schritte des Homing-Kaskade regulieren testen testen. Schließlich, wenn es in einem High-Throughput-System überführt, kann die Vorrichtung für das Screening kleiner Moleküle, Peptide und Antikörper, die Target-Moleküle vermittelt Zelltransportsignal verwendet werden.
Technische Details und Tipps
Rollen und die Adhäsion unter Fluss sind die entscheidenden Schritte in der Extravasation Kaskade und tragen wesentlich zur Effizienz der Zellwanderung in vivo. Bemerkenswert ist, diese Schritte nicht auf statische Tests in vitro beitragen. Allerdings sind statische Transmigration Assays, als negative Kontrollen in Experimenten Testen der Auswirkungen von Scherspannung auf das Überleben der Zelle und die Funktion, einschließlich der Fähigkeit von EG niedrig Affinitätswechselwirkungen (Rollen) und eine gute Haftung zu unterstützen.
Die Wahl des Mediums für Experimente in der 3D-Gerät ist wichtig. Medien enthalten verschiedene Wachstumsfaktoren, die das Überleben der zirkulierenden Zellen beeinflussen, vor allem während der langen Inkubationszeit kann. Darüber hinaus sind die Konzentrationen von Ca 2 + und Mg 2 +, kann die adhäsive Wechselwirkungen unter den Bedingungen der physiologischen Strömung beeinflussen, variieren beträchtlich in kommerziellen Kulturmedien. Weitere technische Details, die berücksichtigt werden bei der Planung von Experimenten mit dem 3D-Gerät soll im Folgenden erörtert werden.
Auswahl des EG Monoschicht
Die Zelloberfläche Unterschrift des EG wird durch verschiedene Parameter, einschließlich der Arten und Gewebe des Ursprungs und die Bedingungen der Zellkultur, die Berücksichtigung in der experimentellen Design berücksichtigt werden sollten beeinflusst. Einige häufig verwendete EC zählen unter anderem Lungen-abgeleitet mikrovaskulären EC (LDMVEC), Knochenmark-abgeleitete EC (BMDEC), brain-derived EC (BDEC) und HUVEC.Die Eigenschaften von EC variieren auch mit ihrer Herkunft. Zum Beispiel BMDEC konstitutiv Selektine und VCAM-1, die für die Rollen und Haftung sind, während BDEC, LDMVEC und HUVEC nicht äußern diese Moleküle unter normalen Bedingungen. Daher kann Einsätze mit BDEC, LDMVEC und HUVEC beschichtet mit TNF α (10 ng / ml, 4 h) oder andere Faktoren zu imitieren Entzündung und induzieren die Expression von Homing-Moleküle vorbehandelt werden.
Testen Übersprechen mit der lokalen Mikroumgebung
Es gibt ein wachsendes Interesse an Verständnis, wie die lokale Mikroumgebung die Funktionen der EG regelt und beteiligt sich in Zelle Extravasation. Unsere Ergebnisse zeigen, daß das Einsetzen einer Monoschicht von Stromazellen unter dem EC Monoschicht erhöht Extravasation von zirkulierenden Zellen. Dieser Befund zeigt, dass Übersprechen zwischen EG und Stroma die Fähigkeit der Gemeinschaft zur Extravasation von zirkulierenden Zellen unterstützen verbessert. Moreover, könnte das Einführen von Zellen von verschiedenen Mikroumgebung (zB mesenchymale Stammzellen, Fibroblasten, Tumorzellen, Astrozyten) helfen, spezifische Gefäßbetten imitieren. Insbesondere könnte eine Kombination von brain-derived EG und Astrozyten einen sinnvollen Ansatz, um die Blut-Hirn-Schranke zu imitieren sein. Ebenso Zellen von Patienten oder normalen Zellen in vitro manipuliert erhalten, könnte dazu beitragen, eine bestimmte Mimik erkrankten Mikroumgebung.
In unseren Studien haben wir niedrigere Einsätze mit Stromazellen gewachsen zu 50% Konfluenz. Obwohl die optimale Dichte microenvironmental Zellen der Einsätze von den Zielen der Studie abhängen wird, kann dieser leicht verändert und gesteuert werden.
Auswählen einer Schubspannung Rate
Die Scherspannung von 0,8 dyn / cm 2 wurde hier, weil dies von Von Andrian et al nachgewiesen werden. die Schubspannung sein im Knochenmark microvasculature, wo hämatopoetischen Vorläuferzellen verlassen die Durchblutung an und geben Geweben unter normalen physiologischen Bedingungen 15. Im Gegensatz dazu sind höhere Schubspannung in größeren Gefäßen, wo Zelle Extravasation begrenzt beobachtet. Daher könnte eine hohe Schubspannung Preise als zusätzliche Kontrollen für Experimente untersuchen Extravasation von verschiedenen Zelltypen verwendet werden.
Das Überleben von Zellen unter Schubspannung hängt von mehreren Faktoren ab, einschließlich der Zelltyp und ex vivo-Therapien (Gontscharowa et al., Unveröffentlichte Beobachtungen), und sollte daher sorgfältig während des Tests ausgewertet werden. Handy Empfindlichkeit zu unterschiedlichen Schubspannung (Scherspannung Widerstand) konnte durch die Programmierung der peristaltischen Pumpe, um die Scherspannung Rate schrittweise zu erhöhen von 0,8 dyn / cm 2 bis 6 dyn / cm 2 ausgewertet werden. Während dieser Tests können Zellen periodisch von der Gasaustauschkammer gesammelt werden, um Zelltod mit überwachen,sagt wie Trypanblauausschluß, Annexin V und PI-Färbung und Apoptose Marker Ausdruck.
Wenn Experimente sind entworfen, um die Scherbeanspruchung Widerstand der ex vivo veränderten Zellen oder Zellen aus Parenchym abgeleitet testen, empfiehlt es sich, weitere positive Kontrollen, wie Blut übertragbaren Zellen, die in den Experimenten enthalten sind.
Auswahl des Einsatzes Porengröße und ECM Beschichtung
Einsätze sind mit mehreren Porengrößen (3, 5 und 8 um) zur Verfügung. Die Wahl der Porengröße hängt von der Größe und Eigenschaften der zirkulierenden Zellen Test abhängen, ist das auch der Fall für statische Transwell-Assays. Einsätze mit einer großen Porengröße (8 um) werden empfohlen, um Extravasation von großen Zellen wie Tumorzellen epithelialen Ursprungs testen. Leukozyten oder hämatopoetische Stammzellen sind häufiger mit 5 um Pore Einsätzen getestet und 3 um Pore Einsätze sind am besten für die Prüfung Extravasation von s vorbehaltenKleine Zellen. Allerdings ist die Messzelle Größe allein nicht der einzige wichtige Faktor, und wir empfehlen Testen Einsätze mit mehreren Porengrößen.
In unseren ersten Studien testeten wir verschiedene ECM für ihre Fähigkeit, das Wachstum von EC an den Einsätzen zu unterstützen und Schubspannung für> 4 h standhalten. Das ECM getesteten Matrigel, Poly-D-Lysin, Fibronectin, Laminin, Typ I Kollagen, Hydrogel, Meta-Keratin I, II, III, IV, und extrazellulären. Die besten Ergebnisse für die EG-Wachstum wurden mit extrazellulären, Fibronektin und Kollagen erhalten. Doch in unseren Händen, extrazellulären bei 0,8 g / cm 2 deutlich reduziert die Seelenwanderung von Test-Zellen durch die Membran. Daher verwenden wir jetzt Fibronektin (5 ug / cm 2) oder Kollagen (5 ug / cm 2) für die Beschichtung von Einsätzen. Allerdings wird die optimale Wahl von ECM wahrscheinlich sowohl von der Art der EG und den Transmigratory Eigenschaften der Test-Zellen beeinflusst werden. Ein Vorversuch durchgeführt werden, um die Integri testenty des EG-Monoschicht auf ausgewählte ECM gewachsen. Zum Beispiel, statt pre-beschichteten Wendeschneidplatten mit EC Monoschichten in Petrischalen mit Kulturmedium gefüllt, legen Sie die Gerichte auf einem Schüttler bis Schubspannung (niedrige Einstellung) zu erstellen, und Inkubation bei 37 ° C und 5% CO 2 für 12 Stunden. Die Integrität der EG nach der Einwirkung der Scherbeanspruchung unter Verwendung Kristallviolettfärbung werden.
Auswahl der optimalen Test Zellkonzentrationen
Die Fähigkeit von Zellen, um den Test zu beenden Zirkulation hängt von vielen Besonderheiten der einzelnen Zelltyp. Um signifikante Ergebnisse zu erzeugen, muss die umlaufende Zelldichte optimiert, um sicherzustellen, dass eine ausreichende Anzahl von Zellen in den positiven Kontrollvertiefungen zu migrieren. Daher empfehlen wir Vorversuche mit einer Reihe von Zelldichten (zB 10 3 / ml bis 10 7 / ml), die Beziehung zwischen der Anzahl der Zellen in das System geladen und verstehendie Zahl der Zellen, die Transmigration unterziehen.
Darüber hinaus kann das optimale zirkulierende Konzentration im gleichen Zelltyp von verschiedenen Quellen unterscheiden. Zum Beispiel sind CD34 +-Zellen eine heterogene Zellpopulation, die sowohl hämatopoetischen Stammzellen und engagiert linienspezifischen Vorläuferzellen. Sie aus dem Knochenmark erzielt werden kann, mobilisierte periphere Blut und Nabelschnurblut. Die CD34 +-Zellen aus diesen drei Quellen besitzen unterschiedliche Fähigkeiten Homing und engrafting 16-18, so dass die Bedingungen für die Prüfung dieser Zellen in der 3D-Gerät sollte vor einem Full-Scale-Studie optimiert werden.
Auswahl optimaler Zellzirkulation Zeit
Die optimale Zirkulationszeit sollte empirisch für jeden Zelltyp bestimmen. Die minimale Zeit für die Zirkulation erforderlich konnte aus den Ergebnissen der statischen Zellmigrationsassays extrapoliert werden, aber dies kann exten werdended, wenn die Zellen einer Scherbeanspruchung unterworfen werden. Pilotstudien testen Umlaufzeiten zwischen 4 und 96 Stunden empfohlen.
Der Gasaustausch Einheit
Der Hauptzweck des Gaswechsel-Einheit ist, um die optimale Konzentration des CO 2 in dem Medium, welches durch den 3D-Vorrichtung, ähnlich wie bei den Standard-Einstellungen in Gewebekultur Inkubatoren halten. Der Gasaustausch Gerät kann auch zum Hinzufügen von Test-Zellen und Verbindungen und für das Sammeln von Sonden und Proben während des Tests verwendet werden.
Auswertung der Versuchsergebnisse Zellzahlen
Zirkulierenden Zellen können zu unterschiedlichen Zeiten während des Experiments durch den Gasaustausch Einheit abgetastet werden. Am Ende des Experiments, könnten die verbleibenden Zellen im Kreislauf vom Auslass gesammelt werden. Wenn das 3D-Vorrichtung am Ende des Experiments wird zerlegt, kann die transmigrierten Zellen aus den unteren Vertiefungen geerntet und gesammelt foder weiteren Analyse. Wenn die Eingangs-Zellen unmarkiert sind, können die transmigrierten Zellen mit Trypanblau und Live / Dead-Zellen mikroskopisch aufgezählt gefärbt werden. Alternativ könnten die Eingangs-Zellen, die mit einem der vielen "Zelle tracker" Farbstoffe für Live Cell Imaging vor dem Einlegen in das 3D-Gerät gekennzeichnet sein, in diesem Fall, transmigrierten Die geernteten Zellen zur Quantifizierung der Fluoreszenz sollte lysiert werden.
Auswahl des optimalen Stichprobengröße
Um statistische Analyse zu ermöglichen, muss eine Stichprobe gewählt werden, dass ca. 80% Strom zu versorgen, um die hypothetischen Unterschied in den mittleren prozentualen Veränderungen zwischen beiden Gruppen, wenn sie bei einem Signifikanzniveau von 0,05 getestet mit einem zweiseitigen t-Test zu ermitteln. Basierend auf unserer Erfahrung mit Knochenmarkzellen, verwenden wir drei Wells pro experimentelle Bedingung für den 3D-Gerät Experimente. Allerdings wird die optimale Stichprobengröße mit dem Ziel des Experiments variieren und sollte bestimmt werden empirically. Multiple Regression statistische Tests, zweiseitigen t-Tests und Analysen der Varianz können statistische Relevanz der Ergebnisse zu überprüfen.
Auswahl von Chemokinen
Wie bei allen Seelenwanderung Assays wird die Wahl von Lockstoff durch die Eigenschaften der Test-Zellen und das Ziel der Studie diktiert werden. SDF-1 ist ein gut etabliertes Lockstoff für hämatopoetische Zellen. In unseren Händen, war eine Konzentration von 50 ng / ml SDF-1 optimal Extravasation von Knochenmark gewonnenen hämatopoetischen Vorläuferzellen stimulieren. Wir verwenden auch C3a und bFGF als Lockstoffe für mesenchymale Stammzellen 19. Wir empfehlen jedoch, Titration jeweils Chemokin-und Cross-Titration Kombinationen von Chemokinen, die optimale Konzentrationsbereich vor einer Full-Scale-Studie identifizieren. Für bestimmte Zelltypen, kann eine Kombination von chemotaktischen Faktoren vorteilhaft sein. Wenn Chemokine für spezifische Prüf-Zellen sind unbekannt oder nicht verfügbar ist, conkonditionierten Medien von stimulierten Lymphozyten, Fibroblasten und anderen Zellen als Quelle für chemische Lockstoffe verwendet werden.
Auswahl der ausgelesenen Parameter
Die Vielseitigkeit des 3D-Gerät erweitert die Art der Seelenwanderung Experimenten, die durchgeführt werden können, und der Erfolg der Experimente wird auf nachdenkliche Erörterung und Gestaltung der Anzeige-Parameter abhängen. In der Regel Zellen aus dem oberen (Umluft) Kammer und die untere (statisch) Fach sollte für die Lebensfähigkeit gleichzeitig als Zellzählung getestet werden. Einige Zellen besitzen eine geringe Toleranz gegenüber dem physiologischen Schubspannung in der Mikrovaskulatur beobachtet. In diesem Fall wird die Anzahl der toten Zellen in der oberen Kammer erhöht werden. Die Zahl der anhaftenden Zellen verhaftet (oder gefangen) auf der EC-Schicht kann durch Immunzytochemie von Markern speziell von den Test-Zellen exprimiert ausgewertet werden. Antikörper, die für CD31 und vWF verwendet werdenEG zu erkennen und Diskriminierung zwischen den Test-und EC-Zellen zu ermöglichen. Darüber hinaus sollte die Integrität des EG Monoschicht am Ende jedes Tests überwacht werden.
Die Arten von Analysen mit den gesammelten Zellen durchgeführt wird auf der Ermittler experimentelle Ziele ab, konnte aber die Analyse von Veränderungen in der Genexpression von Mikroarrays und qPCR, Oberflächenmolekül Expression durch FACS-Analyse, die Aktivierung von Signalwegen durch FACS und Western Blot und Faktor enthalten Sekretion mittels ELISA. Eine riesige Auswahl an funktionalen Tests sind auf den gesammelten Zellen in vitro möglich, da durch unsere eigene Arbeit, in denen wir die kultiviert transmigrierten Knochenmarkzellen, die hämatopoetischen Vorläuferzellen (Abbildung 3) aufzuzählen belegt. Die gesammelten Proben können auch in einer Vielzahl von in-vivo-Tests überprüft werden.
Ein wichtiger Parameter, die helfen, das Verhalten der Testzellen in vivo vorherzusagen ist neigenrenz von einigen Zellen zu Aggregaten unter verschiedenen Scherraten Stress bilden. Zum Beispiel könnte therapeutische Zellen, die Aggregatbildung in der 3D-Gerät zu unterziehen haben eine größere Neigung zur Klumpenbildung nach intravenöser Verabreichung zu bilden und zu akuten Gefäßverschluss in vivo (Gontscharowa et al., Unveröffentlichte Beobachtungen). Aggregatbildung konnte mikroskopisch durch Abtasten der Testzellen während oder nach Beendigung des 3D-Gerät Experiments überwacht werden.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Chuck Scott McKnight und Victor von der CBS Scientific Company Inc. ( www.cbsscientific.com ) für technische Unterstützung und die Herstellung des 3D-Kammer, Gasaustausch Einheit und fügt. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (Zuschüsse R21DK067084 und R43CA141782 zu SKK) unterstützt.
Materials
| Reagent/Material | |||
| PVC tubing (bore 1.42, wall 0.8) | Watson-Marlow Limitid | 981.0142.000 | |
| 3D Chamber | C.B.S.Scientific | FC-1000 | |
| Gas exchange unit | C.B.S.Scientific | FCR-1000 | |
| Inserts | C.B.S.Scientific | FCI-1005U | |
| Collagen Bovine,Type I | BD Biosciences | 354231 | |
| Hydrochloric Acid 0.1M | VWR | BDH3200-1 | |
| PBS | Invitrogen | 14190 | |
| HUVEC | Lonza | CC- 2517 | |
| EGM Bullet Kit (cc – 3121 & cc – 4133) | Lonza | CC – 3124 | |
| Trypsin Neutralizing Solution | Lonza | CC-5002 | |
| Trypsin | Lonza | CC-5012 | |
| HEPES | Lonza | CC-5024 | |
| SDF-1 | R7D System | 460-SD | |
| Extracel Trial 2.5 Kit | Glycosam Byosystems | GS211 | |
| Fibronectin, human , nature | BD Biosciences | 356008 | |
| Poly-D-lysine | Millipore | A-003-E | |
| BD Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Human Brain Microvascular Endothelial Cells | ScienCell | 1000 | |
| Endotelial Cell Medium (ECM) for brain cells | ScienCell | 1001 | |
| Trypan Blue | StemCells Tecnologies | 7050 | |
| TNF-alfa, 10 μg | Invitrogen | PHC3015 | |
| VCAM-1, mouse anti-human, CD106-FITC | Southern Bioteck | 9519-02 | |
| Propidium Iodide Staining Solutuion | BD Pharmingen | # 556463 | |
| Frozen Human Cord Blood CD34+ cells | StemCell | CB007F | |
| Frozen Human Cord Blood CD34+ cells | Zenbio | SER – CD34-F | |
| MethoCult GF M3434 | StemCells Tecnologies | GFM3434 | |
| Mouse Methylcellulose complete media | R&D | HSC007 | |
| Anti-Von Willibrand Factor antibody | abcam | C# ab11713 | |
| Petry dish (35 x 10 mm) | VWR | CA25373-041 | |
| 15 ml tubes | VWR Fisher | 21008 – 918 | |
| Tissue culture flasks 75cm2 | VWR | BD353136 | |
| Cristal violet | Sigma | C-3886-25G | |
| Dissecting forceps, curved | VWR | 82027-384 | |
| 1,000 μl Pipette tips | VWR | 83007-380 | |
| 1 – 200 μl Pipette tips | VWR | 37001-530 | |
| Equipment | |||
| Peristaltic pump | Watson-Marlow Limitid | 403U/VM3 |
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