رواية ثلاثي الأبعاد التدفق جهاز الدائرة لدراسة Chemokine الموجه التسرب من خلايا اعارة تحت ظروف تدفق الفسيولوجي
Summary
ثلاثي الأبعاد الجهاز غرفة التدفق هي رواية<em> في المختبر</em> التكنولوجيا من أجل التقييم الكمي وخطوة حكيمة من تتالي التسرب من الخلايا المنتشرة تحت ظروف إجهاد القص الفسيولوجية. ولذلك يملأ جهاز حاجة ماسة للدراسات الأساسية، قبل السريرية، والسريرية للهجرة الخلية.
Abstract
التسرب من تعميم الخلايا من مجرى الدم يلعب دورا محوريا في العديد من العمليات الفسيولوجية والمرضية في جسم المريض، بما في ذلك الخلايا الجذعية ورم خبيث صاروخ موجه والورم. ثلاثي الأبعاد تدفق الجهاز غرفة (الآخرة الجهاز 3D) هي رواية في تكنولوجيا المختبر الذي يجسد إجهاد القص الفسيولوجية ويسمح لكل خطوة من سلسلة التسرب الخلية ليكون كميا. يتكون الجهاز 3D من المقصورة العليا في الخلايا التي تهم تعمم تحت إجهاد القص، وحجرة أقل من الآبار التي تحتوي على ثابت chemoattractants من الفائدة. يتم فصل القسمين عن طريق إدراج مسامية مغطاة أحادي الطبقة من الخلايا البطانية (EC). تضاف الاختياري الثاني مع الخلايا microenvironmental من الفائدة يمكن وضعها مباشرة تحت طبقة EC. وحدة تبادل الغازات يسمح للCO 2 الأمثل التوتر إلى الحفاظ عليها وتوفر نقطة وصول لإضافة أو سحب الخلايا أو مركبات خلالالتجربة. الخلايا اختبار تعمم في المقصورة العليا في إجهاد القص المطلوب (معدل التدفق) التي تسيطر عليها مضخة تمعجية. في نهاية التجربة، يتم جمع الخلايا المنتشرة وهاجرت لمزيد من التحليلات. الجهاز 3D يمكن استخدامها لدراسة الخلية المتداول على والتصاق إلى EC تحت إجهاد القص، التهجير ردا على التدرجات chemokine، ومقاومة للإجهاد القص، تشكيل الكتلة، وبقاء الخلية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن إدراج الثاني اختياري يسمح للآثار الحديث المتبادل بين المفوضية الأوروبية والخلايا microenvironmental لفحصها. تطبيقات متعدية للجهاز 3D تشمل اختبار المرشحين المخدرات أن الهجرة الخلية المستهدفة والتنبؤ في السلوك المجراة من الخلايا بعد الحقن في الوريد. وهكذا، فإن جهاز 3D الرواية هو أداة مرنة وغير مكلفة لدراسة الآليات الجزيئية التي تتوسط التسرب الخلوية.
Introduction
التسرب الخلية هي العملية التي من خلالها الخلايا المنتشرة الخروج من مجرى الدم، وهي عنصر حاسم في العديد من الاستجابات الفسيولوجية في الجسم. عملية المهم أيضا لتجديد الأنسجة، وعلى سبيل المثال، عندما الخلايا العلاجية حشد من الأنسجة في الأوعية الدموية (أو حقنها في الوريد) تهاجر من خلال الأوعية الدموية والخروج من الدورة الدموية إلى مواقع الإصابة أو الضمور. التسرب هو أيضا عنصرا حاسما في التسبب في الكثير من الأمراض، بما في ذلك الالتهاب، والرفض المناعي، المناعة الذاتية، والانبثاث ورم.
التسرب هو عملية متعددة الخطوات المعقدة التي تنطوي على التفاعل بين تعميم الخلايا مع الخلايا البطانية (EC) في ظل ظروف تدفق الفسيولوجية. وتضم عملية (أ) المتداول الخلية، (ب) التصاق شركة إلى السطح اللمعية من EC، و (ج) التهجير عبر EC. الأهم من ذلك، يتم تنظيم كل خطوة من سلسلة التسرب من قبل مجموعة فرعية من جالذراع نوع محددة والجزيئات أنواع محددة. ومع ذلك، فإن الآليات الجزيئية المفصلة التي تنظم التسرب من مجموعات فرعية معينة من الخلايا ليست مفهومة جيدا، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى صعوبة التقنية لتلخص الأوضاع في مجرى الدم. الجهاز 3D الرواية الموصوفة هنا يهدف إلى التغلب على هذه التحديات التقنية والسماح التجارب التي يتعين القيام بها من شأنها أن تحسن فهمنا للبيولوجيا الخلية الهجرة.
الجزيئات التي توسط الهجرة الخلية هي الأهداف العلاجية الهامة. وهناك فهم مفصل من الأحداث الجزيئية التي تتحكم في الهجرة من أنواع معينة من الخلايا المساعدة في تحديد أهداف جديدة لتعزيز العلاجية أو تثبيط التسرب. على سبيل المثال، فإن التدخلات التي تعزز هجرة الخلايا الجذعية العلاجية (سواء كانت مستمدة من الكبار، والأطفال حديثي الولادة أو حتى من أنسجة الجنين) نحو مواقع الإصابة أو الضمور يكون من فائدة كبيرة في تجديد الأنسجة.هناك اهتمام متزايد في في المختبر جيل من الخلايا الجذعية العلاجية، بما في ذلك الخلايا المشتقة من مصادر المحفزة، والتلاعب في الجسم الحي الخلايا الجذعية البالغة EX (توسع، التلاعب بها وراثيا، وسابقة التجهيز مع الإنزيمات المختلفة) 1. وبالتالي، هناك حاجة لتقنيات جديدة لتقييم نوعية الخلايا الجذعية قبل استخدامها لأغراض علاجية. بين غيرها من المعالم، ويجب أن تكون الخلايا قادرة على الخروج بكفاءة تداول، لأن العلاجات لاضطرابات متعددة البؤر قد تتطلب الوريد من الخلايا الجذعية 2. في الواقع، واحدة من التحديات الراهنة في بيولوجيا الخلايا الجذعية هو التغلب على كفاءة منخفضة للغاية مع الخلايا الجذعية التي تضم مواقع من تلف الأنسجة 3-6، وتسليط الضوء على الحاجة إلى معالجة هذه الفجوة في فهمنا للهجرة الخلايا الجذعية. في المقابل، الاستراتيجيات التي من شأنها أن الهجرة الخلية كتلة باستهداف جزيئات معينة صاروخ موجه تكون مفيدة لعلاج فيالأمراض الالتهابية والمناعة الذاتية وكذلك السرطان المنتشر. وبالتالي، فهم الآليات الجزيئية التي تتوسط التفاعلات بين الخلايا وتعميم EC أثناء الهجرة الخلية والتسرب هو ذات الصلة إلى الطب بالحركة واكتشاف المخدرات فضلا عن العلوم الأساسية.
هناك حاليا عددا من الطرق المتاحة لدراسة مختلف جوانب الهجرة الخلية. ومع ذلك، هذه الطرق لها أوجه القصور التي يمكن التغلب عليها مع الجهاز 3D جديدة.
النماذج الحيوانية:
وكانت النماذج الحيوانية، مثل الفئران والجرذان المناعة التلاعب وراثيا، أدوات مفيدة لدراسة الهجرة من الخلايا البشرية في الجسم الحي. ومع ذلك، عيب واحد كبير لهذه النماذج هو أن الخلايا البشرية تتفاعل مع جزيئات الالتصاق سيئة موجودة على الماوس EC، ويرجع ذلك جزئيا إلى الاختلافات تسلسل أنواع محددة في كثير من جزيئات سطح الخلية. وهكذا، فإن استخدام هذه القوارض للدراسةمن غير المرجح أن تعكس أصلي الأحداث في سرير الأوعية الدموية الجهاز محددة الإنسان الهجرة الخلية البشرية. وبالإضافة إلى ذلك، في النماذج الحية ليست مناسبة لفحص عالية الإنتاجية من المرشحين المخدرات. التقليدية في النماذج الحية تستخدم لدراسة الخلية صاروخ موجه لا تميز بين مختلف الخطوات من تتالي التسرب، مما يجعل من الصعب تحديد واستهداف جزيئات صاروخ موجه الرواية. وقد تم تطوير هذا النهج intravital المجهري لتلبية هذه الحاجة، وكانت غنية بالمعلومات، ولكن هذا الأسلوب هو الوقت وللغاية كثيفة العمالة 7،8.
ثابت المقايسات التهجير:
وتستخدم على نطاق واسع Transwell أو بويدن غرفة فحوصات قياس الهجرة الخلية عبر غشاء مسامي ودراسات في الهجرة. مقايسة لديه ميزة أنه يمكن استخدامها لدراسة ليس فقط حركية الخلية ومصفوفة خارج الخلية الخلية (ECM) التفاعلات، ولكن أيضا الهجرة chemokine بوساطة الخلاياعبر أحادي الطبقة EC نمت على أغشية مسامية. وللأسف، فإن النمط الظاهري وظيفة EC في ظل ظروف ثابتة تختلف كثيرا عن تلك التي تحت تدفق الفسيولوجية 9،10. وهكذا، فإن الأحداث الكيميائي التي تحدث في المقايسات Transwell لا تحاكي بأمانة التفاعلات بين الخلايا المهاجرة وEC تحت إجهاد القص. وبالإضافة إلى ذلك، لا يتم إجراء الخطوة "المتداول" من تتالي صاروخ موجه، وهو ما يضيف بعدا جديدا من الانتقائية في العملية الشاملة، في المقايسات Transwell ثابت. وهكذا، في حين أن هذه التكنولوجيا لا تسمح التقييم الكمي للهجرة الخلايا chemokine بوساطة عبر أحادي الطبقة EC، محدودة بسبب عدم قدرته على توفير إجهاد القص الذي يحاكي تدفق الدم في الجسم الحي.
المقايسات تحت إجهاد القص:
ومن المعروف إجهاد القص للجدران أن تلعب دورا هاما في تنظيم وظيفة EC 9،10. قوى القص تتسبب في تنشيط السريع من أجهزة الطرد المركزي يشير، transcالعوامل ription، والفرق التعبير الجيني في EC 11،12. أدت هذه المعلومات إلى تطوير الجيل المقبل من فحوصات التصاق – غرف موازية تدفق الصفحي والشعيرات الدموية – لدراسة المتداول والتصاق الخلايا لEC تحت ظروف إجهاد القص 7،13. العامل المحدد لهذه المقايسات هو أنها يمكن أن قياس المتداول والتصاق فقط، ولكن لا تفرق بين الخلايا الملتصقة التي من شأنها أن تذهب إلى transmigrate والخلايا الملتصقة التي يتم "القبض" على أحادي الطبقة EC ولن transmigrate. وعلاوة على ذلك، يمكن لهذه المقايسات لا قياس الهجرة من الخلايا نحو الانحدار chemokine.
وقد وصفت عدة تقارير قدرة الخلايا الملتصقة على الزحف تحت أحادي الطبقة EC نمت على الشرائح الزجاجية تحت ظروف تدفق 14. القيود المفروضة على هذه التقنية الزحف ما يلي: يقوم بتحليل عدد محدود فقط من الخلايا، بل هو غير الكمي، بل يحلل خلية الزحف على مصفوفة وسللا يسمح والخلايا transmigrated أن تكون معزولة؛ سطح L ولكن ليس الهجرة نحو التدرج الكيميائي. وهكذا، على الرغم من أن هذا الاختبار لديه ميزة لتطبيق إجهاد القص لأحادي الطبقة EC، فإنه لا يمكن قياس الهجرة من الخلايا نحو الانحدار chemokine.
تكنولوجيا 3D الرواية الموصوفة هنا يتغلب على العديد من أوجه القصور هذه من خلال الجمع بين قوة القص (المقصورة العليا) مع التدرج chemokine ثابت (أقل مقصورة) ويسمح التقييم الكمي من كل خطوة من سلسلة التسرب (الشكل 1). ويمكن أيضا أن تستخدم الجهاز للتحقيق في كيفية الحديث المتبادل بين المفوضية الأوروبية والمكروية يؤثر على قدرة EC لدعم التسرب من الخلايا المنتشرة. يصف بروتوكول التالي على منهجية خطوة بخطوة لاستخدام جهاز 3D غرفة التدفق.
Protocol
Representative Results
Discussion
الجهاز 3D يمكن أن تكون التكنولوجيا مفيدة للبحوث في مختلف المجالات بما في ذلك علم الأحياء الخلايا الجذعية والبيولوجيا الوعائية، أمراض الدم والأورام، المناعة الذاتية، والالتهابات. وسوف يكون الجهاز 3D مفيدة بشكل خاص للباحثين الذين يدرسون المكونة للدم، الوسيطة، العصبية، وغيرها من الخلايا الجذعية للتحقيق في الآليات الجزيئية التي تنظم كل خطوة من الخلايا الجذعية شلال التسرب. يمكن للباحثين دراسة الهجرة الخلية أيضا استخدام هذا الجهاز لدراسة آليات مختلفة المهاجرة من T-B والخلايا اللمفية، وحيدات، العدلات، الحمضات، الخلايا القاتلة الطبيعية، والخلايا المهاجرة الأخرى. في البيولوجيا الوعائية، وسوف يكون الجهاز مفيدا لتقييم تأثير المكروية المحلية على قدرة EC لدعم التوظيف الخليوي ولتقليد حاجز الدم في الدماغ في المختبر. للباحثين مع التركيز على المرضية المرض، ويمكن استخدام الجهاز لدراسة الهجرة من الخلايا التائية السامة للخلايا في البنكرياس خلال الأول من مرض السكري نوع، وميلغريشن من الحمضات في الرئتين من مرضى الربو، هجرة العدلات، وحيدات، والخلايا الليمفاوية إلى مواقع الالتهاب في مجموعة متنوعة من الاضطرابات، وتجنيد الخلايا إلى الجرح مواقع الشفاء، والتفاعل بين الخلايا التائية السامة للخلايا مع neovasculature، وتجنيد من الخلايا التائية السامة للخلايا في الأورام.
وسوف يكون الجهاز 3D الرواية أيضا أداة مفيدة للعلوم ومتعدية لتطوير العقاقير قبل السريرية والفحص. على سبيل المثال، يمكن استخدام الجهاز لتحسين إعداد تعليق خلية علاجية للإدارة في الوريد، لاختبار تجنيد الخلايا العلاجية للأنسجة المصابين مقابل الأنسجة الطبيعية، ودراسة دور جهاز معين أو البطانة الأنسجة والمكروية في هذا العملية. لتطوير العقاقير، يمكن أن تستخدم الجهاز لاختبار المرشحين المخدرات التي تستهدف الخلايا السرطانية ومنع كل خطوة من سلسلة التسرب، لاختبار الخلايا المهاجرة كدواء تسليمY السيارة إلى مواقع الورم، لاختبار الأدوية التي تنظم وظيفة البطانة الجهاز محددة الإنسان أو المكروية المحلية الأنسجة محددة، واختبار تركيبات من العقاقير التي تنظم مختلف الخطوات من تتالي صاروخ موجه. أخيرا، عند تحويلها إلى نظام الإنتاجية العالية، ويمكن استخدام الجهاز لفحص الجزيئات الصغيرة، والببتيدات، والأجسام المضادة التي تتوسط الجزيئات المستهدفة الاتجار الخلية.
التفاصيل الفنية ونصائح
المتداول والتصاق تحت تدفق هي الخطوات الحاسمة في سلسلة التسرب والمساهمة بشكل كبير في كفاءة الهجرة خلية في الجسم الحي. والجدير بالذكر أن هذه الخطوات لا تساهم في المقايسات ثابت في المختبر. ومع ذلك، المقايسات التهجير ثابتة هي مفيدة وضوابط السلبية في التجارب اختبار آثار إجهاد القص على بقاء الخلية ووظيفتها، بما في ذلك قدرة EC لدعم التفاعلات تقارب منخفضة (المتداول) والتصاق شركة.
اختيار المتوسطة للتجارب في الجهاز 3D هو المهم. تحتوي على وسائل الإعلام عوامل النمو المختلفة التي قد تؤثر على بقاء الخلايا المنتشرة، ولا سيما خلال أوقات حضانة طويلة. وبالإضافة إلى ذلك، تركيزات الكالسيوم 2 + 2 + والمغنيسيوم، والتي قد تؤثر على التفاعلات لاصقة في ظل ظروف تدفق الفسيولوجية، تختلف اختلافا كبيرا في وسائل الإعلام الثقافة التجارية. وتناقش التفاصيل التقنية الأخرى التي ينبغي أخذها في الاعتبار عند التخطيط للتجارب مع الجهاز 3D أدناه.
اختيار أحادي الطبقة EC
ويتأثر التوقيع سطح الخلية من المفوضية الأوروبية من خلال معايير مختلفة، بما في ذلك الأنواع والأنسجة المنشأ والظروف ثقافة الخلية، والتي يجب أن تؤخذ بعين الاعتبار في التصميم التجريبي. بعض EC استخداما تشمل الرئة المستمدة من الاوعية الدموية الدقيقة EC (LDMVEC)، نخاع العظام المستمدة EC (BMDEC)، الدماغ المستمدة EC (BDEC)، وHUVEC.تختلف أيضا خصائص EC مع أصلهم. على سبيل المثال، BMDEC جوهري صريحة selectins وVCAM-1، التي تعتبر مسؤولة عن المتداول والتصاق، في حين BDEC، LDMVEC، وHUVEC لا تعبر عن هذه الجزيئات في ظل ظروف طبيعية. ولذلك، يدرج المغلفة مع BDEC، LDMVEC، وHUVEC يمكن سابقة التجهيز مع TNF α (10 نانوغرام / مل، 4 ساعة) أو عوامل أخرى لتقليد الالتهاب وتحفز التعبير عن جزيئات صاروخ موجه.
اختبار الحديث المتبادل مع المكروية المحلية
هناك اهتمام متزايد في فهم الكيفية التي ينظم المكروية المحلية وظائف EC وتشارك في التسرب الخلية. نتائجنا تظهر أن الإدراج من أحادي الطبقة من الخلايا اللحمية تحت أحادي الطبقة EC يزيد بشكل كبير من التسرب تعميم الخلايا. يوضح هذا الاكتشاف الذي المتبادل بين المفوضية الأوروبية وسدى يعزز قدرة EC لدعم التسرب من الخلايا المنتشرة. Moreoالنسخة، والإدراج من الخلايا من microenvironments مختلفة (مثل الخلايا الجذعية الوسيطة، الخلايا الليفية الرئة، الخلايا السرطانية، الخلايا النجمية) يمكن أن يساعد على تقليد الأسرة الأوعية الدموية محددة. على وجه الخصوص، يمكن لمزيج من EC الدماغ المشتقة من الخلايا النجمية ويكون نهجا مفيدا لتقليد حاجز الدم في الدماغ. وبالمثل، والخلايا التي تم الحصول عليها من المرضى، أو الخلايا الطبيعية التلاعب في المختبر، يمكن أن تساعد في تقليد المكروية المريضة محددة.
في دراساتنا، استخدمنا إدراج أقل مع الخلايا اللحمية نمت إلى 50٪ التقاء. على الرغم من أن كثافة الأمثل للخلايا microenvironmental على إدراج سيعتمد على أهداف الدراسة، وهذا يمكن التلاعب بها بسهولة والسيطرة عليها.
اختيار معدل إجهاد القص
تم استخدام إجهاد القص من 0.8 DYN / سم 2 هنا لأن هذا أثبتت فون أندريان وآخرون. ليكون إجهاد القص في microvasculatur نخاع العظمه، حيث الخلايا الاصلية المكونة للدم الخروج من الدورة الدموية وإدخال الأنسجة تحت ظروف فسيولوجية طبيعية 15. في المقابل، لوحظ ارتفاع مستويات إجهاد القص في السفن الأكبر حجما، حيث يتم التسرب خلية محدودة. وبالتالي، يمكن أن تستخدم ارتفاع معدلات إجهاد القص وضوابط إضافية للتجارب فحص التسرب من أنواع الخلايا المختلفة.
بقاء الخلايا تحت إجهاد القص يعتمد على عدة عوامل، بما في ذلك نوع من الخلايا والعلاج بالخلايا فيفو السابقين (الاجازات وآخرون، والملاحظات غير منشورة)، وينبغي بالتالي تقييمها بعناية أثناء الاختبار. حساسية الخلايا لمستويات مختلفة من إجهاد القص (القص مقاومة الإجهاد) يمكن تقييمها من قبل برمجة المضخة تحوي لزيادة معدل إجهاد القص تدريجيا من 0.8 DYN / سم 2 إلى 6 DYN / سم 2. خلال هذه الاختبارات، والخلايا يمكن جمعها بشكل دوري من غرفة تبادل الغازات لرصد موت الخلايا وذلك باستخداميقول مثل التريبان الأزرق الاستبعاد، annexin V وتلطيخ PI، وموت الخلايا المبرمج التعبير علامة.
إذا تم تصميم التجارب لاختبار مقاومة إجهاد القص من الخلايا المهندسة فيفو السابقين أو الخلايا المشتقة من حمة، فمن المستحسن أن الضوابط الإيجابية إضافية، مثل الخلايا المنقولة عن طريق الدم، يتم تضمينها في التجارب.
اختيار حجم المسام إدراج وطلاء ECM
تتوفر إدراج مع عدة أحجام المسام (3، 5، و 8 ميكرومتر). وسيكون اختيار حجم المسام تعتمد على حجم وخصائص الخلايا اختبار المتداولة، كما هو الحال لفحوصات Transwell ثابت أيضا. ينصح إدراج مع حجم المسام الكبيرة (8 ميكرومتر) لاختبار التسرب من خلايا كبيرة مثل خلايا الورم من أصل الظهارية. ويتم اختبار الكريات البيض أو الخلايا الجذعية المكونة للدم أكثر شيوعا مع 5 إدراج المسام ميكرون، ويتم إدراج أفضل 3 محفوظة المسام ميكرون لاختبار التسرب من لياليالخلايا maller. ومع ذلك، فإن حجم الخلية اختبار وحده ليس هو العامل الوحيد المهم ونحن نوصي باختبار تدرج مع العديد من أحجام المسام.
في دراساتنا الأولية، اختبرنا ECM مختلف لقدرتها على دعم نمو EC على إدراج وعلى تحمل إجهاد القص ل> 4 ساعة. اختبارها تضمنت ECM Matrigel، بولي-D-يسين، فبرونيكتين، laminin، النوع الأول الكولاجين، هيدروجيل، التلوي الكيراتين I، II، III، IV، وExtracel. وتم الحصول على أفضل النتائج للنمو EC مع Extracel، فبرونيكتين، والكولاجين. ومع ذلك، في أيدينا، Extracel في 0.8 ميكروغرام / سم 2 إلى خفض كبير في التهجير من الخلايا اختبار عبر الغشاء. لذلك نحن الآن استخدام فبرونيكتين (5 ميكروغرام / سم 2) أو الكولاجين (5 ميكروغرام / سم 2) لطلاء من إدراج. ومع ذلك، من المحتمل أن يتأثر الخيار الأمثل للECM من قبل كل من نوع EC وخصائص transmigratory من الخلايا الاختبار. يجب أن يتم تنفيذ تجربة أولية لاختبار integriتاي من أحادي الطبقة EC نمت على ECM المحددة. على سبيل المثال، مكان إدراج قبل المغلفة مع الطبقات الوحيدة EC في أطباق بتري مليئة مستنبت، وضع الأطباق على شاكر لخلق إجهاد القص (إعداد منخفض)، واحتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 12 ساعة. سلامة EC بعد التعرض للإجهاد القص يمكن تقييمها باستخدام الكريستال تلطيخ البنفسجي.
اختيار من تركيزات الخلية اختبار الأمثل
قدرة الخلايا اختبار لإنهاء الدورة الدموية يعتمد على العديد من الخصائص الخاصة بكل نوع من الخلايا. لتوليد نتائج ذات دلالة إحصائية، يجب أن يكون الأمثل للكثافة الخلايا المنتشرة لضمان وجود عدد كاف من الخلايا تهاجر إلى آبار مراقبة إيجابية. ولذلك، فإننا نوصي أداء الاختبارات الأولية مع مجموعة من كثافة الخلية (على سبيل المثال 10 3 / مل إلى 10 7 / مل) لفهم العلاقة بين عدد الخلايا التي تم تحميلها في النظام وعدد الخلايا التي تخضع التهجير.
وبالإضافة إلى ذلك، قد يختلف تركيز تعميم الأمثل لنوع الخلية نفسها التي تم الحصول عليها من مصادر مختلفة. على سبيل المثال، CD34 + الخلايا هي خلية السكان غير المتجانسة التي تحتوي على كل من الخلايا الجذعية المكونة للدم والأسلاف نسب محددة ملتزمة. يمكن الحصول عليها من نخاع العظام، حشدت الدم المحيطي، ودم الحبل السري. الخلايا + CD34 المستمدة من هذه المصادر الثلاثة تمتلك قدرات مختلفة صاروخ موجه وengrafting 16-18، لذلك ينبغي أن يكون الأمثل الشروط لاختبار هذه الخلايا في الجهاز 3D قبل دراسة واسعة النطاق.
اختيار الأمثل خلية وقت التداول
ينبغي تحديد وقت التداول الأمثل تجريبيا لكل نوع من الخلايا. الحد الأدنى من الوقت المطلوب للتداول يمكن استقراء من نتائج فحوصات الهجرة ثابتة، ولكن هذا قد يكون أبحاثادائرة التنمية الاقتصادية عندما تتعرض الخلايا لإجهاد القص. ينصح دراسات تجريبية أوقاتا صعبة التداول بين 4 و 96 ساعة.
وحدة تبادل الغازات
والغرض الرئيسي من وحدة تبادل الغازات هو الحفاظ على تركيز الأمثل من CO 2 في المتوسطة من خلال تعميم الجهاز 3D، على غرار الإعدادات في مستوى الحاضنات زراعة الأنسجة. ويمكن أيضا وحدة تبادل الغازات يمكن استخدامها لإضافة الخلايا اختبار والمركبات وتحقيقات لجمع العينات وأثناء الاختبار.
تقييم أرقام خلية اختبار
يمكن أخذ عينات الخلايا المنتشرة في مختلف الأوقات خلال التجربة من خلال وحدة تبادل الغازات. في نهاية التجربة، والخلايا المتبقية في الدورة الدموية يمكن جمعها من مأخذ. عندما يتم تفكيكها الجهاز 3D في نهاية التجربة، يمكن حصاده الخلايا transmigrated من أقل الآبار وجمع جمعةأو مزيد من التحليل. إذا غير المسماة الخلايا المدخلات، ويمكن أن تكون ملطخة الخلايا transmigrated مع التريبان الأزرق والخلايا الحية / الميتة المذكورة مجهريا. بدلا من ذلك، يمكن أن يكون المسمى الخلايا الإدخال مع واحدة من "تعقب خلية" العديد من الأصباغ المتوفرة لتصوير الخلايا الحية قبل تحميلها في الجهاز 3D، في هذه الحالة، transmigrated المقطوع ينبغي هي lysed الخلايا لتحديد الكميات من مضان.
اختيار حجم العينة الأمثل
للسماح التحليل الإحصائي، يجب تحديد حجم العينة من شأنها أن توفر ما يقرب من 80٪ من الطاقة للكشف عن الفرق افتراضية في التغييرات في المئة متوسط بين مجموعتين عند اختباره عند مستوى دلالة (0.05) باستخدام الوجهين اختبار t. وبناء على تجربتنا مع خلايا نخاع العظم، ونحن نستخدم ثلاثة آبار في حالة تجريبية لتجارب جهاز 3D. ومع ذلك، فإن حجم العينة الأمثل تختلف مع الهدف من التجربة وينبغي أن تحدد هmpirically. اختبارات متعددة الانحدار الإحصائية، على الوجهين تي الاختبارات، وتحليل التباين يمكن استخدامها للتحقق من الصلة الإحصائية للنتائج.
اختيار كيموكينات
أما بالنسبة لجميع المقايسات التهجير، واختيار جاذب كيميائي سيتم تمليه خصائص الخلايا الاختبار والهدف من هذه الدراسة. SDF-1 هو جاذب كيميائي راسخة للخلايا المكونة للدم. في أيدينا، وكان تركيز 50 نانوغرام / مل SDF-1 المثلى لتحفيز التسرب من نخاع العظام المستمدة من الخلايا الاصلية المكونة للدم. ونحن أيضا استخدام C3A وbFGF كما chemoattractants للخلايا الجذعية الوسيطة 19. ومع ذلك، فإننا نوصي المعايرة كل chemokine وعبر المعايرة مجموعات من كيموكينات لتحديد مدى تركيز الأمثل قبل دراسة واسعة النطاق. لأنواع الخلايا معينة، قد مجموعة من العوامل الكيميائي يكون مفيدا. إذا كيموكينات للخلايا اختبار محدد غير معروفة أو غير متوفرة، يخدعوسائل الاعلام ditioned من الخلايا الليمفاوية حفز، الخلايا الليفية، وخلايا أخرى يمكن استخدامها كمصدر للchemoattractants.
اختيار المعلمات قراءات
سوف براعة الجهاز 3D توسيع نوع من التجارب التهجير التي يمكن القيام بها، وسوف نجاح التجارب تعتمد على دراسة متأنية وتصميم المعلمات قراءات. وكقاعدة عامة، الخلايا التي تم جمعها من (تعميم) المقصورة العلوية وينبغي اختبار السفلى (ثابت) مقصورة للبقاء في نفس الوقت الذي عد الخلية. بعض الخلايا تمتلك التسامح منخفضة لإجهاد القص الفسيولوجية التي لوحظت في الأوعية الدموية الدقيقة. في هذه الحالة، سيتم زيادة عدد الخلايا الميتة في المقصورة العليا. يمكن تقييم عدد من الخلايا الملتصقة القبض على (أو محاصرين) على طبقة EC بواسطة كيمياء سيتولوجية مناعية من علامات أعرب على وجه التحديد من قبل خلايا الاختبار. الاجسام المضادة المحددة لCD31 وعامل فون ويمكن استخدامللكشف عن المفوضية الأوروبية والسماح للتمييز بين الخلايا اختبار وEC. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي مراقبة سلامة أحادي الطبقة EC في نهاية كل اختبار.
سوف أنواع من التحليلات يؤديها مع الخلايا التي تم جمعها تعتمد على أهداف تجريبية المحققين، ولكن يمكن أن تشمل التغيرات في التعبير الجيني تحليل بواسطة ميكروأرس وQPCR والتعبير جزيء السطحية عن طريق تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية، وتفعيل مسارات الإشارات بواسطة نظام مراقبة الأصول الميدانية والنشاف الغربية، وعامل إفراز بواسطة ELISA. مجموعة هائلة من اختبارات وظيفية ممكنة على الخلايا التي تم جمعها في المختبر، كما يتضح من عملنا الذي نحن مثقف خلايا نخاع العظام transmigrated تعداد الخلايا الاصلية المكونة للدم (الشكل 3). ويمكن أيضا أن يتم اختبار العينات التي تم جمعها في مجموعة متنوعة من فحوصات في الجسم الحي.
واحد العوامل الهامة التي يمكن أن تساعد على التنبؤ بسلوك الخلايا اختبار في الجسم الحي هو تميلency من بعض الخلايا لتشكيل المجاميع تحت معدلات مختلفة من إجهاد القص. على سبيل المثال، قد الخلايا العلاجية التي تخضع لتشكيل الكلي في الجهاز 3D لديهم ميل أكبر لتشكيل كتل بعد الوريد وتسبب انسداد الأوعية الدموية الحاد في الجسم الحي (الاجازات وآخرون، والملاحظات غير منشورة). ويمكن رصد تشكيل الحصى مجهريا بواسطة أخذ عينات من الخلايا اختبار أثناء أو بعد الانتهاء من تجربة الجهاز 3D.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر تشاك سكوت وفيكتور ماكنايت من CBS العلمية الشركة وشركة ( www.cbsscientific.com ) للحصول على المساعدة هندسة وتصنيع الدائرة 3D، وحدة تبادل الغازات، وتدرج. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (منح R21DK067084 وR43CA141782 إلى SKK).
Materials
| Reagent/Material | |||
| PVC tubing (bore 1.42, wall 0.8) | Watson-Marlow Limitid | 981.0142.000 | |
| 3D Chamber | C.B.S.Scientific | FC-1000 | |
| Gas exchange unit | C.B.S.Scientific | FCR-1000 | |
| Inserts | C.B.S.Scientific | FCI-1005U | |
| Collagen Bovine,Type I | BD Biosciences | 354231 | |
| Hydrochloric Acid 0.1M | VWR | BDH3200-1 | |
| PBS | Invitrogen | 14190 | |
| HUVEC | Lonza | CC- 2517 | |
| EGM Bullet Kit (cc – 3121 & cc – 4133) | Lonza | CC – 3124 | |
| Trypsin Neutralizing Solution | Lonza | CC-5002 | |
| Trypsin | Lonza | CC-5012 | |
| HEPES | Lonza | CC-5024 | |
| SDF-1 | R7D System | 460-SD | |
| Extracel Trial 2.5 Kit | Glycosam Byosystems | GS211 | |
| Fibronectin, human , nature | BD Biosciences | 356008 | |
| Poly-D-lysine | Millipore | A-003-E | |
| BD Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Human Brain Microvascular Endothelial Cells | ScienCell | 1000 | |
| Endotelial Cell Medium (ECM) for brain cells | ScienCell | 1001 | |
| Trypan Blue | StemCells Tecnologies | 7050 | |
| TNF-alfa, 10 μg | Invitrogen | PHC3015 | |
| VCAM-1, mouse anti-human, CD106-FITC | Southern Bioteck | 9519-02 | |
| Propidium Iodide Staining Solutuion | BD Pharmingen | # 556463 | |
| Frozen Human Cord Blood CD34+ cells | StemCell | CB007F | |
| Frozen Human Cord Blood CD34+ cells | Zenbio | SER – CD34-F | |
| MethoCult GF M3434 | StemCells Tecnologies | GFM3434 | |
| Mouse Methylcellulose complete media | R&D | HSC007 | |
| Anti-Von Willibrand Factor antibody | abcam | C# ab11713 | |
| Petry dish (35 x 10 mm) | VWR | CA25373-041 | |
| 15 ml tubes | VWR Fisher | 21008 – 918 | |
| Tissue culture flasks 75cm2 | VWR | BD353136 | |
| Cristal violet | Sigma | C-3886-25G | |
| Dissecting forceps, curved | VWR | 82027-384 | |
| 1,000 μl Pipette tips | VWR | 83007-380 | |
| 1 – 200 μl Pipette tips | VWR | 37001-530 | |
| Equipment | |||
| Peristaltic pump | Watson-Marlow Limitid | 403U/VM3 |
References
- Daley, G. Q. The promise and perils of stem cell therapeutics. Cell Stem Cell. 10, 740-749 (2012).
- Khaldoyanidi, S. Directing stem cell homing. Cell Stem Cell. 2, 198-200 (2008).
- Laird, D. J., von Andrian, U. H., Wagers, A. J. Stem cell trafficking in tissue development, growth, and disease. Cell. 132, 612-630 (2008).
- Lapidot, T., Kollet, O. The brain-bone-blood triad: traffic lights for stem-cell homing and mobilization. Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. 2010, 1-6 (2010).
- Sackstein, R. Glycoengineering of HCELL, the human bone marrow homing receptor: sweetly programming cell migration. Ann. Biomed. Eng. 40, 766-776 (2012).
- Smart, N., Riley, P. R. The stem cell movement. Circ. Res. 102, 1155-1168 (2008).
- Khaldoyanidi, S. K., et al. MDA-MB-435 human breast carcinoma cell homo- and heterotypic adhesion under flow conditions is mediated in part by Thomsen-Friedenreich antigen-galectin-3 interactions. J. Biol. Chem. 278, 4127-4134 (2003).
- Le Devedec, S. E., et al. Two-Photon Intravital Multicolour Imaging to Study Metastatic Behaviour of Cancer Cells in vivo. Methods Mol. Biol. 769, 331-349 (2011).
- Barakat, A. I. Responsiveness of vascular endothelium to shear stress: potential role of ion channels and cellular cytoskeleton (review). Int. J. Mol. Med. 4, 323-332 (1999).
- Fisher, A. B., Chien, S., Barakat, A. I., Nerem, R. M. Endothelial cellular response to altered shear stress. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 281, L529-L533 (2001).
- Nerem, R. M. Shear force and its effect on cell structure and function. ASGSB Bull. 4, 87-94 (1991).
- Topper, J. N., Gimbrone, M. A. Blood flow and vascular gene expression: fluid shear stress as a modulator of endothelial phenotype. Mol. Med. Today. 5, 40-46 (1999).
- Giavazzi, R., Foppolo, M., Dossi, R., Remuzzi, A. Rolling and adhesion of human tumor cells on vascular endothelium under physiological flow conditions. J. Clin. Invest. 92, 3038-3044 (1993).
- Cinamon, G., et al. Novel chemokine functions in lymphocyte migration through vascular endothelium under shear flow. J. Leukoc. Biol. 69, 860-866 (2001).
- Mazo, I. B., et al. Hematopoietic progenitor cell rolling in bone marrow microvessels: parallel contributions by endothelial selectins and vascular cell adhesion molecule 1. J. Exp. Med. 188, 465-474 (1998).
- Arber, C., et al. Graft source determines human hematopoietic progenitor distribution pattern within the CD34(+) compartment. Bone Marrow Transplant. 46, 650-658 (2012).
- Fuji, S., et al. Peripheral blood as a preferable source of stem cells for salvage transplantation in patients with graft failure after cord blood transplantation: a retrospective analysis of the registry data of the Japanese Society for Hematopoietic Cell Transplantation. Biol. Blood Marrow Transplant. 18, 1407-1414 (2012).
- Haspel, R. L., Miller, K. B. Hematopoietic stem cells: source matters. Curr. Stem Cell Res. Ther. 3, 229-236 (2008).
- Schraufstatter, I. U., Discipio, R. G., Zhao, M., Khaldoyanidi, S. K. C3a and C5a are chemotactic factors for human mesenchymal stem cells, which cause prolonged ERK1/2 phosphorylation. J. Immunol. 182, 3827-3836 (2009).
