A Novel tridimensionale del flusso Camera dispositivo per studiare Chemokine-diretto stravaso di cellule circolanti in condizioni di flusso fisiologici
Summary
Il dispositivo camera di flusso tridimensionale è un romanzo<em> In vitro</em> Tecnologia per la valutazione quantitativa e graduale della cascata stravaso di cellule circolanti in condizioni di fisiologica tensione tangenziale. Il dispositivo colma dunque una necessità critica per gli studi di base, preclinica e clinica di migrazione cellulare.
Abstract
Stravaso di cellule dal sangue circolante gioca un ruolo centrale in molti processi fisiologici e fisiopatologici, incluse cellule staminali homing metastasi e tumore. Il dispositivo camera di flusso tridimensionale (di seguito il dispositivo 3D) è un romanzo in vitro tecnologia che ricrea shear stress fisiologico e permette ad ogni passo del stravaso cascata cella da quantificare. Il dispositivo 3D costituito da un vano superiore, in cui le cellule di interesse circolano sotto sollecitazione di taglio, ed uno scomparto inferiore di pozzi statici che contengono le chemoattractants di interesse. I due compartimenti sono separati da inserti porosi rivestiti con un monostrato di cellule endoteliali (EC). Un secondo inserto opzionale con celle microambientali di interesse può essere posizionato immediatamente sotto lo strato CE. Una unità di scambio di gas consente l'ottimale tensionamento 2 CO a essere mantenuta e fornisce un punto di accesso per aggiungere o ritirare cellule o composti durante laesperimento. Le celle di test circolare nel vano superiore alla tensione di taglio desiderata (portata) controllato da una pompa peristaltica. Alla fine dell'esperimento, le cellule circolanti e migrate sono raccolti per ulteriori analisi. Il dispositivo 3D può essere usato per esaminare cella rotola su e adesione al CE sotto sollecitazione di taglio, trasmigrazione in risposta a gradienti chemochine, resistenza alle sollecitazioni di taglio, la formazione di cluster e la sopravvivenza delle cellule. Inoltre, il secondo inserto opzionale consente effetti di diafonia tra EC e cellule microambientali da esaminare. Le applicazioni traslazionali del dispositivo 3D comprendono la sperimentazione di farmaci candidati che la migrazione delle cellule bersaglio e prevedere il comportamento in vivo delle cellule dopo l'iniezione endovenosa. Così, il dispositivo 3D romanzo è uno strumento versatile e poco costoso per studiare i meccanismi molecolari che mediano stravaso cellulare.
Introduction
Cella stravaso è il processo mediante il quale le cellule circolanti escono sangue ed è un componente critico di molte risposte fisiologiche nel corpo. Il processo è anche importante per la rigenerazione tissutale, come per esempio, quando le cellule terapeutiche mobilizzate dai tessuti nei vasi sanguigni (o iniettati endovena) migrano attraverso il sistema vascolare ed escono dalla circolazione di siti di lesione o degenerazione. Lo stravaso è inoltre una componente fondamentale della patogenesi di molte malattie, tra cui l'infiammazione, il rigetto immunitario, autoimmunità, e le metastasi del tumore.
Stravaso è un processo multi-step complesso che coinvolge l'interazione delle cellule con cellule endoteliali (EC) circolante in condizioni di flusso fisiologico. Il procedimento comprende (a) laminazione cella, (b) ferma adesione alla superficie luminale CE, e (c) attraverso la trasmigrazione CE. Importante, ogni passo della cascata stravaso è regolata da un sottoinsieme di cell tipo-specifici e molecole di specie-specifici. Tuttavia, i meccanismi molecolari dettagliate che regolano stravaso di sottoinsiemi cellulari specifici non sono ben compresi, in gran parte a causa della difficoltà tecnica di ricapitolare le condizioni nel sangue. Il dispositivo 3D romanzo qui descritto è stato progettato per superare queste sfide tecniche e permettere esperimenti da eseguire che miglioreranno la nostra comprensione della biologia della migrazione cellulare.
Le molecole che mediano la migrazione delle cellule sono importanti bersagli terapeutici. Una comprensione dettagliata degli eventi molecolari che controllano la migrazione di specifici tipi cellulari, aiuterà ad identificare nuovi bersagli terapeutici per la promozione o l'inibizione di stravaso. Per esempio, interventi che migliorano la migrazione delle cellule staminali terapeutiche (sia derivato da adulti, neonatale o anche da tessuti fetali) verso siti di lesione o degenerazione sarebbe di grande utilità nella rigenerazione tissutale.Vi è un crescente interesse per la generazione in vitro di cellule staminali terapeutiche, comprese le cellule derivate da fonti pluripotenti, e in vivo manipolate cellule staminali adulte (ex ampliato, geneticamente manipolati, e pretrattati con vari enzimi) 1. Quindi, vi è la necessità di nuove tecnologie per valutare la qualità delle cellule staminali prima di essere utilizzate per scopi terapeutici. Tra gli altri parametri, le cellule devono essere in grado di uscire in modo efficiente la circolazione, perché i trattamenti per i disturbi multifocali possono richiedere la somministrazione endovenosa di cellule staminali 2. In effetti, una delle attuali sfide nel campo della biologia delle cellule staminali è quello di superare la bassissima efficienza con cui le cellule staminali a casa per i siti di danno tissutale 3-6, mettendo in evidenza la necessità di affrontare questa lacuna nella nostra comprensione della migrazione delle cellule staminali. In contrasto, le strategie che bloccano la migrazione cellulare di mira molecole specifiche homing sarebbe utile per il trattamento di inmalattie infiammatorie e autoimmuni così come il cancro metastatico. Così, la comprensione dei meccanismi molecolari che mediano le interazioni tra cellule circolanti e la CE durante la migrazione cellulare e stravaso è rilevante per la medicina traslazionale e la scoperta di farmaci, nonché alla scienza di base.
Attualmente ci sono un certo numero di metodi disponibili per studiare i diversi aspetti della migrazione cellulare. Tuttavia, questi metodi presentano lacune che possono essere superati con il nuovo dispositivo 3D.
Modelli animali:
I modelli animali, come topi immunocompromessi e topi manipolati geneticamente, sono stati strumenti utili per studiare la migrazione delle cellule umane in vivo. Tuttavia, uno svantaggio significativo di questi modelli è che le cellule umane interagiscono scarsamente con molecole di adesione presenti sul mouse CE, in parte a causa della specie-specifiche differenze di sequenza in molte molecole di superficie cellulare. Così, l'uso di roditori per studiaremigrazione delle cellule umane è improbabile per riflettere autenticamente gli eventi in organo-specifiche letti vascolari umane. Inoltre, in modelli in vivo non sono adatti per screening ad alto rendimento di farmaci candidati. Il tradizionale modelli in vivo che utilizzano per lo studio delle cellule homing non contengano discriminazioni tra le diverse fasi della cascata stravaso, il che rende difficile identificare e selezionare nuove molecole di homing. L'approccio microscopia intravitale stato sviluppato per affrontare questa necessità e è stato informativo, tuttavia, questa tecnica è estremamente lungo e laborioso 7,8.
Statici saggi di trasmigrazione:
Transwell o camera di Boyden saggi misura migrazione cellulare attraverso una membrana porosa e sono ampiamente usati in studi di migrazione. Il saggio ha il vantaggio che può essere usato per studiare non solo la motilità cellulare e matrice (ECM) interazioni cellula-extracellulari, ma anche la migrazione chemochina-mediata delle celluleattraverso un monostrato CE coltivati sulle membrane porose. Sfortunatamente, il fenotipo e la funzione delle CE in condizioni statiche differiscono notevolmente da quelle sotto flusso fisiologico 9,10. Così, gli eventi chemiotattici che si verificano in saggi Transwell non imitano fedelmente le interazioni tra le cellule che migrano e CE sotto sforzo di taglio. Inoltre, il passo "rolling" della cascata homing, che aggiunge un'ulteriore dimensione di selettività al processo generale, non si verifica in saggi Transwell statiche. Così, mentre questa tecnologia non consentire la valutazione quantitativa della migrazione cellulare chemochina-mediata attraverso il monostrato CE, essa è limitata dalla sua incapacità di fornire la tensione di taglio che imita il flusso di sangue in vivo.
Saggi sotto sforzo di taglio:
Muro di shear stress è noto a svolgere un ruolo importante nella regolazione della funzione EC 9,10. Forze di taglio inducono rapida attivazione di cascate di segnalazione, transcfattori rizione, e l'espressione genica differenziale in CE 11,12. Questa informazione ha portato allo sviluppo della prossima generazione di saggi di adesione – parallele camere di flusso laminare e capillari – studiare rotolamento e adesione delle cellule ai CE in condizioni di sforzo di taglio 7,13. Il fattore limitante per queste analisi è che si può misurare solo al rotolamento e aderenza, ma non fanno distinzione tra una cellula aderente che avrebbe continuato a trasmigrare e una cella aderente che viene "arrestato" sul monostrato CE e non sarebbe trasmigrare. Inoltre, questi test non possono misurare la migrazione delle cellule verso un gradiente di chemochine.
Diversi studi hanno descritto la capacità di cellule aderenti a strisciare sotto un monostrato CE coltivate su vetrini in condizioni di flusso 14. Le limitazioni a questa tecnica di scansione comprendono: analizza solo un numero limitato di cellule, è non-quantitativa; analizza cella strisciando sulla matrice e celsuperficie l ma non la migrazione verso un gradiente chemiotattico, e non permette alle cellule trasmigrato da isolare. Così, anche se questo dosaggio ha il vantaggio di applicare sollecitazioni di taglio per il monostrato CE, non può quantificare migrazione delle cellule verso un gradiente di chemochine.
La nuova tecnologia 3D descritto qui supera molte di queste lacune combinando forza di taglio (vano superiore) con un gradiente chemochina statico (compartimento inferiore) e permette la valutazione quantitativa di ciascun passo della cascata stravaso (Figura 1). Il dispositivo può anche essere utilizzato per studiare come diafonia tra CE e il microambiente influenza la capacità di CE di sostenere stravaso di cellule circolanti. Il seguente protocollo descrive la metodologia passo-passo per l'utilizzo del dispositivo camera di flusso 3D.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il dispositivo 3D può essere una tecnologia utile per la ricerca in vari campi tra cui la biologia delle cellule staminali, biologia vascolare, ematologia, oncologia, autoimmunità e infiammazione. Il dispositivo 3D sarà particolarmente utile per i ricercatori, lo studio, le cellule staminali neurali e mesenchimali emopoietiche altro per studiare i meccanismi molecolari che regolano ogni fase della cellule staminali stravaso cascata. I ricercatori che studiano la migrazione delle cellule possono anche utilizzare questo dispositivo per esaminare i diversi meccanismi migratori dei T e B linfociti, monociti, neutrofili, eosinofili, cellule NK, e altre cellule migratorie. In biologia vascolare, il dispositivo sarà utile per valutare l'effetto del microambiente locale sulla capacità di CE di sostenere il reclutamento di cellule e per imitare la barriera ematoencefalica in vitro. Per i ricercatori concentrandosi su patogenesi della malattia, il dispositivo può essere usato per studiare la migrazione delle cellule T citotossiche nel pancreas durante diabete di tipo I, la migrazione di eosinofili nei polmoni di pazienti asmatici, la migrazione dei neutrofili, monociti e linfociti nei siti di infiammazione in una serie di disturbi, il reclutamento di cellule a ferire i siti di guarigione, l'interazione delle cellule T citotossiche con la neovascolarizzazione, e il reclutamento di cellule T citotossiche nei tumori.
Il dispositivo 3D romanzo sarà anche un utile strumento per la scienza traslazionale e per lo sviluppo di farmaci preclinico e di screening. Ad esempio, il dispositivo può essere utilizzato per ottimizzare la preparazione di sospensioni di cellule terapeutiche somministrate per via endovenosa, per testare il reclutamento di cellule terapeutiche per tessuti danneggiati contro tessuti normali, e per esaminare il ruolo dell'organo specifico o endotelio microambiente tissutale e in questo processo. Per lo sviluppo di farmaci, il dispositivo potrebbe essere utilizzato per testare farmaci candidati che le cellule tumorali bersaglio e bloccare ogni passo della cascata stravaso, per testare cellule migranti come farmaco consegnarey veicolo a siti tumorali, per testare farmaci che regolano la funzione dell'endotelio organo-specifiche umano o il microambiente tessuto-specifici locale, e per testare combinazioni di farmaci che regolano diverse fasi della cascata homing. Infine, quando convertito in un sistema ad alta produttività, il dispositivo può essere utilizzato per lo screening di piccole molecole, peptidi e anticorpi che molecole bersaglio mediatrici traffico cellulare.
Dettagli tecnici e suggerimenti
Rotolamento e aderenza in condizioni di flusso sono i passaggi critici nella cascata stravaso e contribuiscono in modo significativo alla efficienza della migrazione delle cellule in vivo. Particolare, questi passaggi non contribuiscono a test statici in vitro. Tuttavia, i saggi di trasmigrazione statici sono utili come controlli negativi in esperimenti di verificare gli effetti delle sollecitazioni di taglio sulla sopravvivenza delle cellule e la funzione, tra cui la possibilità di CE per supportare interazioni bassa affinità (rolling) e ferma adesione.
La scelta del mezzo di esperimenti nel dispositivo 3D è importante. Supporti contengono diversi fattori di crescita che possono influenzare la sopravvivenza delle cellule circolanti, in particolare durante i tempi di incubazione lunghi. Inoltre, le concentrazioni di Ca 2 + e Mg 2 +, che possono influenzare le interazioni adesive in condizioni di flusso fisiologico, variare notevolmente in terreni di coltura commerciali. Altri dettagli tecnici che dovrebbero essere presi in considerazione al momento di pianificare esperimenti con il dispositivo 3D sono discussi di seguito.
Selezione del monostrato CE
La firma superficie cellulare di CE è influenzato da diversi parametri, tra cui le specie e tessuti di origine e le condizioni di coltura cellulare, che dovrebbero essere presi in considerazione nel disegno sperimentale. Alcuni comunemente utilizzati CE includono polmone-derivato microvascolare CE (LDMVEC), derivate dal midollo osseo CE (BMDEC), derivato dal cervello CE (BDEC) e HUVEC.Le proprietà del CE variano anche per la loro origine. Ad esempio, BMDEC costitutivamente espresso selectine e VCAM-1, che sono responsabili di rotolamento e aderenza, mentre BDEC, LDMVEC e HUVEC non esprimono queste molecole in condizioni normali. Pertanto, inserti rivestiti con BDEC, LDMVEC, e HUVEC possono essere pretrattate con TNF α (10 ng / ml, 4 ore) e altri fattori per imitare infiammazione e indurre l'espressione di molecole homing.
Test crosstalk con il microambiente locale
Vi è un crescente interesse per comprendere come il microambiente locale, regola le funzioni del CE e partecipa a stravaso delle cellule. I nostri risultati dimostrano che l'inserimento di un monostrato di cellule stromali sotto il monostrato CE aumenta significativamente stravaso di cellule circolanti. Questo risultato dimostra che la diafonia tra CE e stroma migliora la capacità della CE a sostegno stravaso di cellule circolanti. Moreover, l'inserimento di cellule provenienti da diversi microambienti (ad esempio cellule mesenchimali staminali, fibroblasti polmonari, cellule tumorali, astrociti) potrebbe contribuire a imitare specifiche letti vascolari. In particolare, una combinazione di cervello-derivato CE e astrociti potrebbe essere un utile approccio per imitare la barriera emato-encefalica. Allo stesso modo, le cellule ottenute da pazienti, o cellule normali manipolate in vitro, potrebbero contribuire a simulare uno specifico microambiente malato.
Nei nostri studi, abbiamo usato inserti inferiori con cellule stromali cresciute al 50% di confluenza. Sebbene la densità ottimale delle cellule microambientali sulle inserti dipenderà dagli obiettivi dello studio, questo può essere facilmente manipolato e controllato.
Selezione di un tasso di sforzo di taglio
La sollecitazione di taglio di 0,8 dine / cm 2 è stato usato qui perché questo è stato dimostrato da Von Andrian et al. essere lo sforzo di taglio nel midollo osseo microvasculature, dove le cellule progenitrici ematopoietiche escono dalla circolazione e tessuti entrano in normali condizioni fisiologiche 15. In contrasto, livelli elevati di sforzo di taglio si osservano in vasi più grandi, dove stravaso cella è limitato. Pertanto, elevati tassi di sollecitazione di taglio potrebbero essere usati come controlli aggiuntivi per esperimenti esaminano stravaso di vari tipi di cellule.
La sopravvivenza delle cellule sotto sollecitazione di taglio dipende da diversi fattori, tra cui il tipo di cellula e trattamenti con le cellule ex vivo (Goncharova et al., Dati non pubblicati), e dovrebbe quindi essere attentamente valutato nel corso della prova. Sensibilità cellulare ai diversi livelli di sforzo di taglio (shear resistenza allo stress) potrebbe essere valutata programmando la pompa peristaltica per aumentare il tasso di sollecitazione di taglio incrementalmente da 0,8 dyn / cm 2 al 6 dyn / cm 2. Durante questi test, le cellule possono essere raccolte periodicamente dalla camera scambio di gas per monitorare morte cellulare utilizzando comedice come blu tripano esclusione, annessina V e PI colorazione, e di espressione marcatore apoptosi.
Se gli esperimenti sono progettati per testare la resistenza sforzo di taglio di cellule ingegnerizzate ex vivo o cellule derivate da parenchima, si raccomanda che ulteriori controlli positivi, come le cellule ematica, sono inclusi negli esperimenti.
Selezione della dimensione dei pori e rivestimento dell'inserto ECM
Gli inserti sono disponibili con diverse dimensioni dei pori (3, 5, e 8 micron). La scelta della dimensione dei pori dipenderà dalla dimensione e le proprietà delle celle di prova circolanti, che è anche il caso per saggi Transwell statiche. Inserti con una grande dimensione dei pori (8 micron) sono raccomandati per testare stravaso di cellule di grandi dimensioni come le cellule tumorali di origine epiteliale. Leucociti o cellule staminali ematopoietiche sono più comunemente testati con 5 inserti poro micron, e 3 inserti pori micron sono più riservati per testare stravaso di scellule maller. Tuttavia, le dimensioni della cella di test da solo non è l'unico fattore importante e si consiglia di testare inserti con diverse dimensioni dei pori.
Nei nostri studi iniziali, abbiamo testato vari ECM per la loro capacità di sostenere la crescita della CE sugli inserti e di resistere a sollecitazioni di taglio per> 4 ore. L'ECM provato include Matrigel, poli-D-lisina, fibronectina, laminina, collagene di tipo I, Idrogel, Meta-cheratina I, II, III, IV, e Extracel. I migliori risultati di crescita CE sono stati ottenuti con Extracel, fibronectina e collagene. Tuttavia, nelle nostre mani, Extracel a 0,8 g / cm 2 ha ridotto significativamente la trasmigrazione delle celle di prova attraverso la membrana. Pertanto ora usiamo fibronectina (5 pg / cm 2) o collagene (5 pg / cm 2) per il rivestimento di inserti. Tuttavia, la scelta ottimale di ECM sarà probabilmente influenzata sia dal tipo di CE e le proprietà trasmigratori delle cellule da testare. Un esperimento preliminare deve essere eseguita per testare il integritty del monostrato CE coltivate su ECM selezionato. Ad esempio, posizionare inserti pre-rivestite con monostrati CE in piastre di Petri riempite con terreno di coltura, Porre le capsule su un agitatore per creare sollecitazioni di taglio (minima), e incubare a 37 ° C e 5% di CO 2 per 12 ore. L'integrità della CE dopo esposizione alla sollecitazione di taglio può essere valutata utilizzando cristallo colorazione viola.
Selezione delle concentrazioni cellulari ottimali di prova
La capacità delle cellule di prova per uscire dalla circolazione dipende da molte caratteristiche specifiche per ogni tipo cellulare. Per generare risultati statisticamente significativi, la densità cellulare circolanti deve essere ottimizzata per garantire che un numero sufficiente di cellule migrano nei pozzetti di controllo positivi. Pertanto, si consiglia di eseguire test iniziali con una gamma di densità cellulari (es. 10 3 / ml a 10 7 / ml) per comprendere il rapporto tra il numero di cellule caricato nel sistema eil numero di cellule che subiscono trasmigrazione.
Inoltre, la concentrazione ottimale circolante può differire per il medesimo tipo cellulare ottenuta da fonti diverse. Ad esempio, cellule CD34 + sono una popolazione cellulare eterogenea contenente sia le cellule staminali ematopoietiche e impegnati progenitori lineage-specifici. Essi possono essere ottenute da midollo osseo, sangue periferico mobilizzato, e sangue del cordone ombelicale. Le cellule CD34 + derivate da queste tre fonti possiedono abilità diverse homing e l'attecchimento 16-18, per cui le condizioni di prova di queste cellule nel dispositivo 3D deve essere ottimizzata prima di uno studio su vasta scala.
Selezione del tempo di circolazione ottimale delle cellule
Il tempo ottimale circolazione dovrebbe essere determinata empiricamente per ogni tipo cellulare. Il tempo minimo richiesto per la circolazione potrebbe essere estrapolata dai risultati di test di migrazione statici, ma questo può essere Extenata quando le cellule sono sottoposte a sollecitazioni di taglio. Sono raccomandati studi pilota di test volte circolazione tra 4 e 96 ore.
L'unità di scambio di gas
Lo scopo principale della unità di scambio di gas è di mantenere la concentrazione ottimale di CO 2 nel mezzo di circolazione attraverso il dispositivo 3D, simili alle impostazioni in incubatori coltura di tessuti standard. L'unità di scambio di gas può anche essere usato per aggiungere cellule da testare e composti e per la raccolta sonde e campioni durante la prova.
Valutazione del numero di cellule di prova
Cellule circolanti possono essere campionati in momenti diversi durante l'esperimento attraverso l'unità di scambio di gas. Al termine dell'esperimento, le celle rimanenti nella circolazione potrebbero essere raccolti dalla presa. Quando il dispositivo 3D è smontato al termine dell'esperimento, le cellule possono essere raccolte trasmigrato dai pozzetti inferiori e raccolti fo ulteriori analisi. Se le celle di input sono adenoidi, le cellule trasmigrato possono essere colorati con trypan blu e cellule vive / morte enumerati microscopicamente. In alternativa, le celle di input possono essere etichettati con uno dei tanti "inseguitore cellulare" coloranti disponibili per l'imaging cellulare dal vivo prima di caricare nel dispositivo 3D, in questo caso, il raccolto trasmigrato cellule devono essere lisate per la quantificazione della fluorescenza.
Selezione della dimensione ottimale del campione
Per consentire l'analisi statistica, una dimensione del campione deve essere selezionato in grado di fornire circa il 80% di potenza per rilevare la differenza ipotetico nei cambiamenti percentuali medi tra due gruppi durante il test a un livello di significatività di 0,05 con un t-test a due code. Sulla base della nostra esperienza con cellule del midollo osseo, usiamo tre pozzi per ogni condizione sperimentale per gli esperimenti di dispositivi 3D. Tuttavia, la dimensione del campione ottimale varierà con l'obiettivo dell'esperimento e dovrebbe essere determinato empirically. Più test di regressione statistica, su due lati t-test, e analisi della varianza possono essere utilizzati per verificare rilevanza statistica dei risultati.
Selezione di chemochine
Come per tutti i saggi di trasmigrazione, la scelta del fattore chemiotattico sarà dettata dalle proprietà delle cellule da testare e l'obiettivo dello studio. SDF-1 è un fattore chemiotattico ben consolidata per le cellule ematopoietiche. Nelle nostre mani, una concentrazione di 50 ng / ml SDF-1 era ottimale per stimolare stravaso dell'osso cellule progenitrici ematopoietiche derivate dal midollo. Usiamo anche C3a e bFGF come fattori chemiotattici per le cellule staminali mesenchimali 19. Tuttavia, si consiglia di titolazione ognuno combinazioni chemochine e cross-titolazione di chemochine per individuare l'intervallo di concentrazione ottimale prima di uno studio su vasta scala. Per certi tipi di cellule, una combinazione di fattori chemiotattici può essere utile. Se chemochine per celle di test specifici sono sconosciuti o non disponibili, consupporti ditioned da linfociti stimolati, fibroblasti e altre cellule possono essere utilizzati come fonte di fattori chemiotattici.
Selezione dei parametri di lettura
La versatilità del dispositivo 3D si espanderà il tipo di esperimenti di trasmigrazione che possono essere eseguite, e il successo degli esperimenti dipenderà da un'attenta considerazione e progettazione dei parametri di lettura. Come regola generale, le cellule raccolte dal vano superiore (ad anello) e il vano inferiore (statica) devono essere testati per la vitalità allo stesso tempo come conteggio delle cellule. Alcune cellule possiedono scarsa tolleranza alla sollecitazione di taglio fisiologica osservato nella microcircolo. In questo caso, il numero di cellule morte sarà aumentato nel compartimento superiore. Il numero di cellule aderenti arrestati (o intrappolata) sullo strato CE può essere valutata mediante immunocitochimica di marcatori espressi specificamente dalle cellule da testare. Anticorpi specifici per CD31 e vWF può essere utilizzatoper rilevare CE e consentire la discriminazione tra le celle di prova e della CE. Inoltre, l'integrità del monostrato CE deve essere monitorato al termine di ciascuna prova.
Le tipologie di analisi effettuate con le cellule raccolte dipenderà obiettivi sperimentali degli investigatori, ma potrebbero includere cambiamenti analizzando nell'espressione genica da microarrays e qPCR, superficie espressione molecola mediante analisi FACS, l'attivazione di vie di segnalazione da FACS e Western blotting, e il fattore di secrezione da ELISA. Una serie enorme di test funzionali sono possibili sulle cellule raccolte in vitro, come dimostra il nostro lavoro in cui abbiamo colto le cellule del midollo osseo trasmigrato enumerare le cellule progenitrici ematopoietiche (Figura 3). I campioni raccolti potrebbero anche essere testati in una varietà di saggi in vivo.
Un parametro importante che può aiutare a prevedere il comportamento delle celle di test in vivo è il tendererenza di alcune cellule a formare aggregati sotto diversi tassi di shear stress. Per esempio, le cellule terapeutiche che subiscono aggregate formazione nel dispositivo 3D potrebbero avere una maggiore tendenza a formare grumi dopo somministrazione endovenosa e causare ostruzione acuto vascolare in vivo (Goncharova et al., Osservazioni non pubblicate). Formazione degli aggregati potrebbe essere monitorato microscopicamente campionando cellule da testare durante o dopo il completamento dell'esperimento dispositivo 3D.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Chuck Scott e Victor McKnight dalla CBS Scientific Company Inc. ( www.cbsscientific.com ) per l'assistenza tecnica e la fabbricazione della camera 3D, unità di scambio di gas, e gli inserti. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (sovvenzioni R21DK067084 e R43CA141782 di SKK).
Materials
| Reagent/Material | |||
| PVC tubing (bore 1.42, wall 0.8) | Watson-Marlow Limitid | 981.0142.000 | |
| 3D Chamber | C.B.S.Scientific | FC-1000 | |
| Gas exchange unit | C.B.S.Scientific | FCR-1000 | |
| Inserts | C.B.S.Scientific | FCI-1005U | |
| Collagen Bovine,Type I | BD Biosciences | 354231 | |
| Hydrochloric Acid 0.1M | VWR | BDH3200-1 | |
| PBS | Invitrogen | 14190 | |
| HUVEC | Lonza | CC- 2517 | |
| EGM Bullet Kit (cc – 3121 & cc – 4133) | Lonza | CC – 3124 | |
| Trypsin Neutralizing Solution | Lonza | CC-5002 | |
| Trypsin | Lonza | CC-5012 | |
| HEPES | Lonza | CC-5024 | |
| SDF-1 | R7D System | 460-SD | |
| Extracel Trial 2.5 Kit | Glycosam Byosystems | GS211 | |
| Fibronectin, human , nature | BD Biosciences | 356008 | |
| Poly-D-lysine | Millipore | A-003-E | |
| BD Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Human Brain Microvascular Endothelial Cells | ScienCell | 1000 | |
| Endotelial Cell Medium (ECM) for brain cells | ScienCell | 1001 | |
| Trypan Blue | StemCells Tecnologies | 7050 | |
| TNF-alfa, 10 μg | Invitrogen | PHC3015 | |
| VCAM-1, mouse anti-human, CD106-FITC | Southern Bioteck | 9519-02 | |
| Propidium Iodide Staining Solutuion | BD Pharmingen | # 556463 | |
| Frozen Human Cord Blood CD34+ cells | StemCell | CB007F | |
| Frozen Human Cord Blood CD34+ cells | Zenbio | SER – CD34-F | |
| MethoCult GF M3434 | StemCells Tecnologies | GFM3434 | |
| Mouse Methylcellulose complete media | R&D | HSC007 | |
| Anti-Von Willibrand Factor antibody | abcam | C# ab11713 | |
| Petry dish (35 x 10 mm) | VWR | CA25373-041 | |
| 15 ml tubes | VWR Fisher | 21008 – 918 | |
| Tissue culture flasks 75cm2 | VWR | BD353136 | |
| Cristal violet | Sigma | C-3886-25G | |
| Dissecting forceps, curved | VWR | 82027-384 | |
| 1,000 μl Pipette tips | VWR | 83007-380 | |
| 1 – 200 μl Pipette tips | VWR | 37001-530 | |
| Equipment | |||
| Peristaltic pump | Watson-Marlow Limitid | 403U/VM3 |
References
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