生理フローの状況の下で循環細胞のケモカイン指向溢出を研究する新規三次元フローチャンバーデバイス

3Dデバイスは、幹細胞生物学、血管生物学、血液学、腫瘍学、自己免疫、および炎症など様々な分野の研究のために有用な技術である。 3D装置は、幹細胞の血管外遊出カスケードの各ステップを調節する分子機構を調べるために、間葉造血、神経、およびその他の幹細胞を研究する研究者にとって特に有用であろう。細胞遊走を研究する研究者はまた、T及びBリンパ球、単球、好中球、好酸球、NK細胞、およびその他の遊走細胞の遊走異なるメカニズムを調べるために、このデバイスを使用することができる。血管生物学では、装置は、細胞動員をサポートするために、in vitroで血液脳関門を模倣するECの能力に局所微小環境の影響を評価するために有用であろう。疾患の病因に焦点を当てた研究のために、デバイスは、I型糖尿病の間に膵臓細胞傷害性T細胞の遊走を研​​究するために使用することができ、マイル喘息患者の肺への好酸球のグレイション、障害の様々な、癒しのサイトを巻かする細胞の動員、新生血管と細胞傷害性T細胞の相互作用、及び採用における炎症部位への好中球、単球、およびリンパ球の遊走腫瘍への細胞傷害性T細胞である。

小説の3Dデバイスはまた、トランスレーショナル科学および前臨床薬剤開発とスクリーニングのための有用なツールとなるでしょう。例えば、装置は、静脈内投与のための治療用細胞懸濁液の調製を最適化するために、正常組織と比較し負傷組織に治療用細胞の動員をテストするために、その特定の器官または組織内皮および微小環境の役割を調べるために使用することができプロセス。医薬品開発のために、デバイスは、その標的腫瘍細胞の薬物候補をテストし、溢出カスケードの各ステップをブロックする、薬物送達として遊走細胞をテストするために使用することができる腫瘍部位にyが車両、人間の臓器特異的内皮またはローカル組織特異的な微小環境の機能を調節し、ホーミングカスケードの異なるステップを規制薬物の組み合わせをテストするために薬をテストする。最後に、ハイスループット系に変換するとき、デバイスは、標的分子が細胞輸送を媒介することが小分子、ペプチド、お​​よび抗体をスクリーニングするために使用することができる。

技術的な詳細やヒント

流下ローリングと接着が溢出カスケードの重要なステップであり、in vivoでの細胞移動の効率化に大きく貢献。特に、これらの手順は、in vitroで静的アッセイに寄与しない。ただし、静的遊出アッセイは、低親和性の相互作用（ローリング）と強固な接着をサポートするために、ECの機能など、細胞の生存と機能にせん断応力の影響をテストする実験でネガティブコントロールとして有用である。

3Dデバイスでの実験のための媒体の選択は重要です。媒体は、特に長いインキュベーション時間の間、循環細胞の生存に影響を及ぼし得る異なる成長因子を含んでいる。また、カルシウムの濃度は²生理的流れの条件下で、接着剤の相互作用に影響を及ぼす可能性がある⁺及びMg ^{2 +は} 、市販の培養培地中でかなり異なる。 3D装置を用いた実験を計画する際に考慮されるべき他の技術的な詳細については後述する。

EC単分子層の選択

ECの細胞表面署名は、実験設計において考慮されるべき種起源と細胞培養条件の組織を含む様々なパラメータによって影響される。いくつかの一般的に使用されるEC骨EC​​（BMDEC）、脳由来EC（BDEC）、およびHUVECを骨髄由来、肺由来の微小血管EC（LDMVEC）が含まれています。ECの特性もその起源によって異なります。例えば、ローリングと接着を担当するBMDEC恒常急行セレクチンおよびVCAM-1は、BDEC、LDMVEC、およびHUVECは、通常の条件下では、これらの分子を発現しないのに対し。したがって、BDEC、LDMVEC、およびHUVECで被覆されたインサートは、TNFα（10 ngの/ mlで、4時間）又は炎症を模倣し、ホーミング分子の発現を誘導する他の要因で前処理することができる。

局所微小環境とのクロストークのテスト

局所微小環境は、ECの機能を調節し、細胞の血管外漏出にどのように関与するかを理解する上での関心の高まりがあります。我々の結果は、EC単層の下にある間質細胞の単層のものと挿入が著しく循環細胞の血管外漏出を増加を示している。この知見は、ECと間質間のクロストークは、循環細胞の血管外漏出をサポートするECの能力を高めることを示している。 Moreoバージョン、異なる微小環境（ 例えば、間葉系幹細胞、肺線維芽細胞、腫瘍細胞、星状細胞）からの細胞の挿入は、特定の血管床を模倣するように助けることができる。特に、脳由来EC及びアストロサイトの組み合わせは、血液脳関門を模倣するために有用なアプローチであり得る。同様に、患者、又はインビトロで操作正常細胞から得られた細胞は、特定の病気の微小環境を模倣することに役立つ可能性があります。

我々の研究では、50％コンフルエンスまで増殖させ間質細胞と下部インサートを用いる。インサートに微小環境細胞の最適密度は研究の目的に依存しますが、これは容易に操作し、制御することができる。

剪断応力速度を選択する

これは、フォン·アンドリアンらによって実証されているため、0.8ダイン/ cm ²でのせん断応力は、ここで使用した。骨髄microvasculaturにせん断応力であることが造血前駆細胞は、循環を終了し、正常な生理学的条件下で、組織^15を入力して電子。対照的に、せん断応力のより高いレベルは、細胞溢出が限られている大きな血管において観察される。したがって、高剪断応力速度は、様々な細胞型の血管外遊出を調べる実験のための追加の対照として使用することができる。

剪断応力下での細胞の生存、細胞の種類とex vivoでの細胞の処理（ゴンチャロヴァら 、未発表の観察）など、複数の要因に依存し、したがって、試験中に注意深く評価されるべきである。せん断応力の異なるレベル（せん断応力抵抗）細胞の感受性を0.8ダイン/ cmの^2〜6ダイン/ cm ^2のより段階的に剪断応力速度を増加させる蠕動ポンプをプログラミングすることによって評価することができる。これらの試験の間に、細胞を用いて細胞死を監視するためのガス交換室から定期的に収集することができるトリパンブルー排除、アネキシンVおよびPI染色、及びアポ​​トーシスマーカー発現として言う。

実験は実質由来のex vivoで操作された細胞または細胞の剪断応力抵抗性をテストするために設計されている場合、それは、血液媒介細胞などの追加の陽性対照は、実験に含まれていることが推奨される。

挿入孔サイズとECMコーティングの選択

インサートは、いくつかの細孔径（3、5、8ミクロン）を用意しています。細孔径の選択は、循環テストセルのサイズと性質に依存し、これは、静的トランスウェルアッセイの場合である。大孔径（8μmの）とインサートはそのような上皮起源の腫瘍細胞などの大型細胞の血管外漏出をテストすることをお勧めします。白血球または造血幹細胞は、より一般的に5μmの細孔インサートでテストされており、3μmの細孔インサートが最善秒の血管外漏出をテストするために予約されていますメガワット以下細胞。しかし、単独のテストセルのサイズが唯一の重要な要因ではないと我々はいくつかの細孔径と挿入のテストをお勧めします。

我々の最初の研究では、インサート上でECの増殖を支持し、> 4時間せん断応力に耐えられるようにそれらの能力のための様々なECMをテストした。 ECMは、マトリゲル、ポリD-リジン、フィブロネクチン、ラミニン、入力が含まれてテストされたI型コラーゲン、ハイドロゲル、メタケラチンI、II、III、IV、および細胞外。 ECの成長のための最良の結果は、細胞外、フィブロネクチン、コラーゲンが得られた。しかし、我々の手の中に、0.8μgの/ cm ^2の細胞外ではかなり膜を横切って試験細胞の遊出を減少させた。したがって、我々は今、挿入のコーティングのためフィブロネクチン（5μgの個/ cm ^2）またはコラーゲン（5μgの/ cm ^2）を使用しています。しかしながら、ECMの最適な選択は、おそらく、ECの種類及び試験セルの移住する特性の両方によって影響される。予備実験は、integriをテストするために行われるべき選択されたECM上に成長したEC単層のTY。例えば、培養液で満たされたペトリ皿でのEC単層を持つ場所が予め被覆インサートは、せん断応力（低設定）を作成するシェーカー上皿を置き、37℃、5％12時間CO _2。せん断応力に暴露した後ECの整合性がクリスタルバイオレット染色法を用いて評価することができる。

最適なテストセル濃度の選択

循環を終了する試験細胞の能力は、各細胞型に特異的な多くの特性に依存する。統計的に有意な結果を生成するために、循環細胞密度は、十分な数の細胞を陽性対照ウェルに移行することを確実にするために最適化されなければならない。したがって、我々はシステムにロードされた細胞の数との関係を理解するために細胞密度の範囲（ 例えば 、10 ³ / mlの^10〜7 / ml）で初期テストを行うことをお勧め転生を受ける細胞の数。

また、最適な循環濃度は、異なるソースから取得した同じ細胞型に異なっていてもよい。例えば、CD34 ⁺細胞は、造血幹細胞およびコミットされた系統特異前駆細胞の両方を含む不均一な細胞集団である。それらは骨髄から得ることができる、末梢血および臍帯血を動員。これらの3つのソースから派生したCD34 ^+細胞は異なるホーミングと移植能力の^16-18を持っ^ている、3Dデバイスでこれらの細胞をテストするための条件は、本格的な調査の前に最適化する必要がありそう。

最適な細胞の循環時間を選択する

最適な循環時間は、各セルタイプに対して経験的に決定されるべきである。循環に必要な最小時間は、静的遊走アッセイの結果から推定することができるが、これはextenかもよい細胞はせん断応力を受けたときDEDに。 4と96時間の間の循環時間をテストパイロット研究が推奨されています。

ガス交換ユニット

ガス交換部の主な目的は、標準的な組織培養インキュベーターの設定と同様に、3Dデバイスを介して循環する媒体中のCO ₂の最適濃度を維持することである。ガス交換ユニットは、試験細胞と化合物を添加するため、試験中にプローブとサンプルを収集するために使用することができる。

テストセル数の評価

循環細胞は、ガス交換部を介して実験中に変化するタイミングでサンプリングすることができる。実験の最後に、循環中に残留する細胞は出口から収集することができる。 3Dデバイスは、実験の終了時に分解されたとき、転生細胞は、下部ウェルから採取およびfを回収することができるまたはさらなる分析。入力セルにラベルされている場合は、転生細胞はトリパンブルーと微視的に列挙された生/死細胞で染色することができます。あるいは、入力セルは、3Dデバイスにロードする前に、生細胞のイメージングのために利用できる多くの "セルトラッカー"色素のいずれかで標識することができ、この場合には、採取した細胞を転生蛍光の定量に溶解されるべきである。

最適なサンプルサイズを選択する

統計分析を可能にするために、サンプルサイズは、両側t検定を用いて、0.05の有意水準で試験した両群間の平均変化率で仮想的な差を検出するのに約80％の電力を提供するよう選択されな​​ければならない。骨髄細胞を用いた我々の経験に基づいて、我々は、3Dデバイスの実験のために実験条件ごとに3つの井戸を使用しています。しかし、最適なサンプルサイズは、実験の目的に応じて変化する電子を決定すべきであるmpirically。重回帰統計的検定、両側t検定、および分散分析は、結果の統計的妥当性を検証するために使用することができる。

ケモカインの選択

すべての移住アッセイとしては、化学誘引物質の選択は試験細胞の性質と研究の目的によって決定されます。 SDF-1は、造血細胞のための十分に確立された化学誘引物質である。我々の手では、50 ngの/ mlのSDF-1の濃度は、骨髄由来造血前駆細胞の血管外遊出を促進することが最適であった。また、間葉系幹細胞¹⁹化学誘引物質としてC3aのおよびbFGFを使用しています。しかし、我々は本格的な調査の前に最適な濃度範囲を識別するケモカインの各ケモカインとクロス滴定の組み合わせを滴定をお勧めします。特定の細胞型については、走化性因子の組み合わせは有益であり得る。特定のテストセルのためのケモカインは詐欺、不明または使用できない場合刺激されたリンパ球、線維芽細胞および他の細胞から培地をditioned化学誘引物質の供給源として使用することができる。

読み出しパラメータの選択

3Dデバイスの汎用性は、行うことができ、実験の成功は、思慮深い配慮と読み出しパラメータの設計に依存することになる転生実験の種類を拡大していきます。原則として、細胞が上方（循環）区画から収集され、下側（静的）区画は、細胞計数と同時に生存能力について試験されるべきである。一部の細胞は、微小血管で観察生理せん断応力に低い耐性を持っています。この場合には、死んだ細胞の数は上側区画に増加する。 EC層上に（又は捕捉された）逮捕付着細胞の数は、試験細胞によって特異的に発現するマーカーの免疫細胞化学により評価することができる。 CD31およびvWFのに特異的な抗体を使用することができるECを検出すると、試験細胞およびECとの間の区別を可能にする。また、EC単層の完全性が各試験の最後に監視されるべきである。

回収した細胞を用いて行わ分析の種類は研究者 '実験的な目標に依存しますが、マイクロアレイや定量PCR、FACS分析による表面分子の発現、FACSとウェスタンブロッティングによってシグナル伝達経路の活性化、および要因によって遺伝子発現の解析の変更を含めることができますELISAによる分泌。我々は、造血前駆細胞（ 図3）を列挙するために転生した骨髄細胞を培養している私たち自身の仕事によって証明されるように機能テストの巨大な配列は、in vitroで回収した細胞上で可能です。収集されたサンプルはまた、in vivoアッセイの様々でテストすることができます。

in vivoで試験細胞の挙動を予測するのを助けることができる1つの重要なパラメータは、傾向であるせん断応力の異なるレートの下で凝集体を形成するためにいくつかの細胞のency。例えば、3Dデバイス内凝集体形成を受ける治療用細胞は、静脈内投与後の塊を形成し、in vivoでの急性血管閉塞（ゴンチャロヴァら 、未発表の観察）が発生する傾向があるかもしれません。凝集体形成は、3Dデバイス実験の終了時に又は後の試験セルをサンプリングすることによって顕微鏡でモニターすることができる。