Un modelo murino de cáncer de próstata humano Metástasis ortotópico

Para todos los procedimientos con animales, los protocolos fueron aprobados por el Cuidado de Animales y el empleo Comisión Institucional (IACUC) de la Universidad Northwestern. Las técnicas quirúrgicas y las condiciones de cuidado de los animales fueron observados por el personal veterinario y modificar para minimizar el estrés de los animales o la mortalidad. Las instituciones individuales pueden tener requisitos diferentes y es importante trabajar con IACUC y animal del personal en el desarrollo y ejecución de esta técnica quirúrgica. 1. Preparación de las células para inyección Este paso se debe realizar lo más cerca posible a partir cirugías. Trypsinize células que se utilizan para el experimento, retirar del plato, y neutralizan con los medios de comunicación. La línea celular PC3-M humana CaP establemente transfectadas con GFP ha sido utilizado con éxito para estos experimentos, debido a las condiciones de crecimiento rápido de las células PC3-M. GFP se añadió para la facilidad adicional de detección de la metástasis de pulmón en muestras de tejido pulmonar, y la determinación rápida decélulas de cáncer frente a las células inmunes en cultivos obtenidos a partir de sangre y la médula ósea para identificar células tumorales circulantes. Si la modificación de un gen específico de interés, a continuación, la creación de líneas celulares estables con esta alteración del gen se lleva a cabo primero, seguida de la transfección con GFP. Si GFP va a alterar la función de este gen de interés, GFP puede ser omitido. Esto hará que la detección de metástasis de pulmón más difícil, pero todavía alcanzable. Además, si se utiliza tecnología de imagen específica el uso de marcadores fluorescentes, tales como basado en la luciferasa de IVIS, otras proteínas fluorescentes se pueden utilizar en su lugar. Centrifugar durante 5 min a 225 x g. Aislar 2.5 x 10 5 células, y centrifugar durante 5 minutos a 225 x g. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender las células en 20 l de solución salina estéril. Aspirar suspensión de células en una jeringa de 0,5 ml con un permanente 28 ½ aguja de calibre (recomendado: Kendall monojet, ya que otras marcas han causado problemas), lo que garantiza no entre aire en la aguja alOng con la suspensión. Envolver la jeringa en papel de aluminio estéril y almacenar en hielo hasta su uso. 2. Implantación ortotópico de células de cáncer de próstata humano Se utilizan 6-8 semanas de edad Balb / c atímicos ratones machos. El peso corporal de ratón ideal para la cirugía es 19-21 g, y los ratones se debe permitir que crezca a por lo menos 18 g antes de la cirugía. Los animales más pequeños son técnicamente más difíciles de operar. Los animales más grandes tienden a experimentar más lenta cinética del crecimiento tumoral y la metástasis. Los animales deben ser alojados en las instalaciones de animales al menos una semana antes de la cirugía para minimizar el estrés de los animales. Dependiendo del diseño experimental, el tratamiento farmacológico puede comenzar una semana antes de la cirugía. Inyectar medicamentos para el dolor antes de la cirugía de acuerdo a las instrucciones del animalario. 0,1 mg / kg de peso corporal subcutánea Buprenex usando una aguja de 30 ½ T unido a una jeringa de 1 ml se sugiere. Coloque los animales en la cámara de isoflurano y esperar hasta los animales son totalmente unnesthetized. No toe reflejo del tono muscular debería estar presente en este punto. Este método se recomienda, pero si no está disponible, otros métodos de anestesia se puede utilizar de acuerdo a las instrucciones del animalario. Mueva los animales fuera de la cámara de isoflurano en una campana de procedimiento estéril. Coloca los animales dentro del aparato cono de la nariz, y volver a asegurar que los animales se encuentra bajo anestesia completa antes de proceder. Desinfectar región inferior del abdomen con un exfoliante Betadine con bolitas de algodón estériles, limpie con una toallita de alcohol, y final de pulverización con una solución de Betadine. Deje que se seque. Utilizando un bisturí estéril o tijeras quirúrgicas estériles afiladas, una incisión abdominal en la línea media baja de aproximadamente 3-4 mm está hecho. Levante suavemente la vejiga usando fórceps e identificar el lóbulo ventral de la próstata. Estos dos lóbulos se encuentran directamente debajo de la vejiga. Algunos ratones tendrán una pequeña capa de grasa que cubre la próstata que se puede mover suavemente a un lado usando un bastoncillo de algodón estéril. Minimizandoe todos los movimientos de los órganos y la musculatura si es posible. Inyectar 20 ul volumen de solución de células en la glándula de la próstata, lo que minimiza las fugas y asegurar que se observa una pequeña burbuja. Vuelva a colocar la vejiga y cerrar la capa muscular utilizando 4,0 absorbibles suturas monofilamento vicryl en un patrón interrumpido simple. Cierre la capa de la piel con grapas estériles 9 mm. Retire los animales de la anestesia isoflurano y monitorear hasta despiertos y moviéndose con normalidad. Coloque el cojín de la calefacción durante el período de recuperación. Si se realizan múltiples cirugías, entre cirugías, limpiar todas las herramientas con etanol al 70%, y esterilizan utilizando un esterilizador de cuentas de vidrio. Permita que las herramientas que se enfríen completamente antes del próximo animal. No vuelva a usar suturas, bolas de algodón o hisopos estériles. 3. Animales Monitoreo Administrar medicamentos para el dolor en base a las instrucciones de instalación para animales. 4 horas después de la cirugía de administración de una dosis de meloxicam subcutánea de 1 mg / kg de peso corporal ucantar una aguja 30 ½ T unido a una jeringa de 1 ml se sugiere, seguido por una dosis adicional cada 12-24 horas para el próximo 48 hr. Las grapas se pueden quitar de los animales de 7-10 días después de la cirugía una vez que la herida ha sanado. Vigilar el peso del animal, el consumo de alimentos, y palpar los ratones para los tumores dos veces por semana hasta la terminación del experimento. Aumentar la frecuencia de hasta cada dos días, cuando los tumores se vuelven visibles para verificar si hay animales bajo carga tumoral significativa o coacción. La muerte prematura de este modelo es debido a la gran carga tumoral primaria, como los tumores primarios pueden bloquear el flujo de orina, por lo que cualquier animales con una pérdida de más del 15% del peso corporal o un tumor primario alcanzando un diámetro de 1,5 cm debe ser necropsia inmediatamente a evitar la obstrucción urinaria y la muerte de los animales. Vigilar la necesidad de enriquecimiento adicional del entorno de los animales. El estrés de la cirugía aumenta las luchas internas de los animales. La adición de dos chozas de plástico por jaula en vez de uno y comportamiento adicionalal enriquecimiento puede disminuir estos incidentes. Discutir con el personal veterinario opciones disponibles en la instalación estén alojados en. Dada la falta de pestañas en esta cepa de ratones, no se recomiendan las chozas y el enriquecimiento de papel, ya que pueden irritar los ojos. 4. Procedimientos de necropsia Después de 4-6 semanas, los tumores son totalmente evidentes y los animales comienzan a perder peso debido al aumento de la carga tumoral. Los tumores normalmente se pueden palpar y / o son claramente visibles. La necropsia se debe realizar en este punto. Lleve a cabo una inyección intraperitoneal de Nembutal a 260 mg / kg de peso corporal utilizando una aguja de calibre 30 ½ unida a una jeringa de 1 ml, y permiten a los animales se vuelven totalmente inconsciente, sin reflejo dedo del pie o el tono muscular presente. Una vez que el animal es anestesiado, usando tijeras quirúrgicas estériles o un escalpelo, cortar horizontalmente a través del torso del animal directamente debajo de la caja torácica, entonces verticalmente a la axila a lo largo del lado del animal, Exponer el corazón. Realice una punción cardiaca terminal usando una aguja 30 ½ T unido a una jeringa de 1 ml purgado con 4% de citrato de sodio en DPBS para evitar la coagulación, la obtención de tanta sangre como sea posible a partir del animal. Eliminar los pulmones de los animales mediante la reducción de la tráquea con tijeras quirúrgicas o un escalpelo y colocar inmediatamente en un casete de cultivo de tejidos y en 10% de formalina. Retire el tumor primario de próstata del animal cortando individualmente cualquier vaso sanguíneo unidos al tumor y la garantía de ningún órgano adicionales, tales como los conductos deferentes o vesículas seminales se unen. Anotar el peso y el tamaño del tumor. Medir el peso del tumor en gramos a escala de laboratorio. Usando pinzas, medir la longitud del diámetro más largo del tumor en centímetros, y el eje perpendicular correspondiente. Multiplique estos valores para obtener el tamaño del tumor. Dependiendo del uso previsto, inmediatamente complemento congelación en nitrógeno, y / o lugar de líquido ena un casete de tejido en formalina al 10%. Exponga las articulaciones de la cadera y de la rodilla con tijeras quirúrgicas o un bisturí, y las articulaciones de desconexión de la pierna, teniendo cuidado de mantener intacto el fémur. Retire los fémures de los animales y el lugar en solución salina estéril. Obtener cualquier otro órgano o materiales de interés, y disponer de animales de acuerdo con las instrucciones de su instituto. En particular, los ganglios linfáticos regionales tienden a tener metástasis, tienden a ser ampliado si albergar ellos, y pueden ser cosechadas. Sin embargo, se debe tener cuidado ya que esto puede verse afectado por cambios en la presión hidrostática causada por el procedimiento quirúrgico. 5. Tramitación y inmunotinción de Tejido Pulmonar Muestras Dentro de 24 a 48 horas de la colocación de tejido en formalina al 10% en PBS, integrar los pulmones en parafina. Sección de los pulmones a 45 micras secciones escalonadas, teniendo 2-3 adyacentes 4 micras secciones de tejido pulmonar. Si se utilizaron células positivas para GFP (recomendado), lleve a cabo la inmunotinciónpara las buenas prácticas agrarias. Si no es así, realice hematoxilina estándar y eosina (H & E) tinción. NOTA: El kit Dako Envision + combinado con el anticuerpo de GFP de Invitrogen ha sido utilizada con éxito de acuerdo con las instrucciones del fabricante, pero esto puede ser modificado para cualquier procedimiento de inmunohistoquímica. Puntuación metástasis en un modo ciego. Si GFP-positivas, las células tumorales se tiñen de marrón además de tener núcleos grandes y distintivas. La primera vez que la metástasis de puntuación, consulte a un patólogo para asegurar una puntuación correcta y use el H & E manchadas tejido pulmonar para confirmar la presencia de las células tumorales, y no la infiltración de células inmunes. 6. La identificación de células tumorales circulantes de Sangre y Médula Ósea Añadir toda la sangre obtenida de la autopsia a un tubo de centrífuga de 1,5 ml. Se centrifuga 5 min a 800 x g. Retire el plasma y se añade 1 ml de tampón de lisis ACK (154,95 mM cloruro de amonio, bicarbonato de potasio 9,99 mMnate, EDTA 0,0995 mM,). Permita que la sangre llegue a temperatura ambiente 3-5 min. Se centrifuga 5 min a 800 x g. Eliminar el sobrenadante y añadir 1 ml de medio de cultivo celular que contiene antibióticos. Añadir células a un matraz T75 que contiene 9 ml de medio de cultivo celular. Células de cultivo a 37 ° C en un ambiente humidificado contiene 5% de CO 2 durante 10 días, la comprobación de la presencia de CTCs cada 2-3 días. Para médula ósea, eliminar todo el tejido muscular de fémures utilizando un par de tijeras, una cuchilla de afeitar, o un escalpelo. Retire los extremos del hueso, tan cerca de los extremos posibles. Usando una aguja 23 ¾ G, expulsar suavemente la médula ósea del fémur en un tubo de centrífuga de 1,5 ml. Añadir a 1 ml de medios de cultivo celular y la pipeta suavemente para mezclar bien. Añadir células a un matraz T75 que contiene 9 ml de medio de cultivo celular. 7. Caracterización molecular de los tumores Para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)s, muestras de tumor que se congelaron en nitrógeno líquido se pulverizan primero en hielo seco y luego se homogeneizaron usando un homogeneizador de tejidos durante 3-5 min con 1 ml de TRIzol. TRIzol extracción se lleva a cabo según las instrucciones del fabricante. Se purifica ARN utilizando el kit de aislamiento de ARN RNeasy de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Realización de la síntesis de ADNc y la PCR cuantitativa en tiempo real (QRT / PCR) usando reactivos TaqMan de acuerdo con las instrucciones del fabricante se recomienda pero puede ser modificado por cualquier método de PCR empleada actualmente. Para los ensayos de Western blot, homogeneizar los tejidos usando un homogeneizador de tejidos durante 3-5 min con 1 ml de tampón de lisis: PBS (NaCl 137 mM, 10 mM de fosfato de Na, 2,7 mM de KCl), 0,5% de Triton X-100, EDTA 1 mM, pirofosfato de sodio 2,5 mM, 1 mM de β-glicerofosfato, con la adición de cóctel inhibidor de la proteasa, inhibidores de fosfato cócteles 2 y 3, fluoruro de sodio 10 mM, y ortovanadato de sodio 1 mM. La mezcla de lisado celular se coloca en un tubo de centrífuga de 1,5 ml. Centavorifuge mezcla de lisado de células durante 10 min a 13.000 x g. Aspirar el sobrenadante y colocar en un nuevo tubo de centrífuga de 1,5 ml y se centrifuga de nuevo durante 10 minutos a 13.000 x g. Si los restos celulares aún está presente, se puede realizar una etapa de centrifugación adicional. Aspirar el sobrenadante y efectuar una transferencia Western según las condiciones normales de laboratorio.