Ce modèle orthotopique de cancer de la prostate humain permet la quantification de la taille de la tumeur, les cellules tumorales circulantes, et la formation de métastases dans le poumon distinct. Comme les cellules doivent échapper à l'organe principal, entrer dans la circulation sanguine, et implanter dans un site secondaire, ce modèle reprend effectivement le scénario chez les humains.
Notre laboratoire a développé un nouveau modèle d'implantation orthotopique de cancer de la prostate humaine (cancer de la prostate). Comme PCa mort n'est pas dû à la tumeur primaire, mais plutôt la formation de métastases distinct, l'aptitude à modéliser efficacement cette progression pré-clinique est de grande valeur. Dans ce modèle, les cellules sont directement implantés dans le lobe ventral de la prostate chez les souris Balb / c athymiques, et on les laisse évoluer pendant 4-6 semaines. A la terminaison de l'expérience, plusieurs points de terminaison distincts peuvent être mesurés, tels que la taille et la caractérisation moléculaire de la tumeur primaire, la présence et la quantification de cellules tumorales circulantes dans le sang et la moelle osseuse, et la formation de métastases dans les poumons. En plus d'une variété de paramètres, ce modèle offre une image d'une capacité des cellules à envahir et échapper à l'organe principal, entrez et survivre dans le système circulatoire, et l'implant et de grandir dans un site secondaire. Ce modèle a été utilisé efficacement pour mesurer métastatiqueréponse à la fois des changements dans l'expression des protéines ainsi que de la réponse à petites molécules thérapeutiques, en un temps de traitement court.
Cancer de la prostate (CaP) est le cancer le plus fréquemment diagnostiqué chez les hommes, et la deuxième cause de décès par cancer aux États-Unis 1. La mort de PCa n'est pas due à la formation de la tumeur primaire, mais plutôt la formation de métastases. Par conséquent, la prévention de métastases chez les patients est d'une grande importance. Des modèles murins de cancer de la prostate offrent une diversité d'options pour découvrir l'information biologique critique sur cette maladie.
Une variété de modèles de souris de cancer de la prostate existent, chacune avec des avantages et des limites inhérentes. Bien que la fréquence de cancer de la prostate chez l'homme est élevé, naturellement cancer de la prostate est extrêmement rare chez les souris 2, malgré l'égalité de sensibilité de souris global de cancer 3. Une exception de rongeur est le développement de cancer de la prostate chez les rats Wistar Lobund, qui peut atteindre des taux de cancer de la prostate de 90% en 12 mois par induction de méthylnitrosourée et testostérone 4. Pour cette raison, induit des systèmes modèles, comme le clochard(Adénocarcinome de la prostate transgénique souris) modèle sont couramment utilisés. Le modèle TRAMP peut induire l'expression du transgène spécifiquement dans la prostate, et subit la progression normale du cancer de la prostate, de l'hyperplasie de néoplasie intra-épithéliale prostatique (PIN) à lymphatique et la métastase pulmonaire 5-6. Ces modèles fournissent des avantages d'être capable de mesurer la totalité de la progression tumorale, ainsi que contenir un système immunitaire intact. Cependant, les événements moléculaires qui sous-tendent le développement CaP peuvent différer entre les souris et les humains, et les corrélations entre les souris et les études cliniques humaines ont montré la variabilité. En outre, ces deux modèles sont de temps, par exemple, le modèle TRAMP nécessite environ 28 semaines, afin de développer des métastases.
En étudiant les métastases, souvent un ventricule modèle d'injection queue veine ou gauche est utilisé. Ce modèle bénéficie de temps de réponse rapide, et peut en outre mesurer la présence de metastas osseusesest en utilisant des lignes et des conditions spécifiques de cellules. Yang et al. Ont rapporté que l'injection sous-cutanée de cellules PC3 GFP-positives largement diffusées peut provoquer des métastases osseuses 7, et la veine caudale et les injections intercardiac ont également généré le développement de la métastase osseuse 8-9. Les principales limites de ces modèles sont liés à l'absence d'une tumeur primaire qui réside à l'intérieur de la glande de la prostate lui-même. En outre, pour les modèles Reliant lors de l'injection des cellules cancéreuses dans la circulation, ce contourne toute la première moitié de la cascade métastatique. Il empêche ainsi l'examen des premières étapes, y compris l'invasion par l'organe principal, qui sont biologiquement mesures cruciales de transformation métastatique. De nombreux organismes de réglementation de la transformation métastatique affectent directement l'invasion des cellules tôt. Les premières étapes de la cascade métastatique constituent des sites hautement prioritaires pour le ciblage thérapeutique, car une fois que les cellules cancéreuses diffusent variation clonale augmente considérablement, ce qui accroît biologiquediversité et al diminuer ciblage thérapeutique efficace.
Dans une tentative de répondre à bon nombre des limites de ces modèles, notre laboratoire a développé un modèle orthotopique de cancer de la prostate humaine dans laquelle la lignée cellulaire cancer de la prostate PC3-M humaine est directement implanté dans la prostate de souris BALB / c athymiques. Après 4-6 semaines, la taille des tumeurs, la présence de cellules tumorales circulantes (CTC), et des métastases dans les poumons et les ganglions lymphatiques peuvent tous être quantifiés. Nous avons effectivement utilisé ce modèle pour évaluer l'efficacité de la 4 ',5,7-trihydroxyisoflavone (génistéine) pour inhiber la métastase humain PCa 10. La consommation alimentaire de la génistéine a été liée à la diminution de la prostate métastatique de cancer et de décès 11-12, mais auparavant, aucune étude n'avait déterminer si l'administration de la génistéine pourrait modifier cancer de la prostate métastatique chez les animaux ou les hommes. Dans cette étude, nous avons démontré que le traitement avec la génistéine a considérablement réduit le nombre de métastases pulmonaires. De plus, nous avons déterminé la génistéine altation de l'activation et l'expression de plusieurs protéines pro-métastatiques représentées dans la tumeur primaire, y compris la kinase d'adhésion focale (FAK), la protéine kinase p38 activée par le mitogène (MAPK p38), et de protéine de choc thermique 27 (HSP27).
Ces résultats correspondent aux observations de la clinique. Utilisation de sang obtenu à partir de la souris, nous avons pu mesurer avec précision les concentrations sanguines de la génistéine et observé ceux-ci soient semblables aux niveaux chez l'homme avec la consommation alimentaire régulière de la génistéine. En outre, une étude de phase II réalisée par notre groupe a déterminé que lors du traitement avec la génistéine, les hommes diminue rencontrées dans l'ARNm de la prostate de l'expression tissulaire de gènes associés à l'invasion cellulaire et la métastase, la matrice métalloprotéinase spécifique de type 2 (MMP-2) 13.
Nous avons également utilisé ce modèle pour évaluer l'effet de l'expression altérée du gène produit dans la tumeur primaire sur les métastases cancer de la prostate humaine 14. Le suppr de tumeuressor endogline est un membre de la superfamille TGFß et supprime l'invasion cellulaire humaine in vitro via PCa altération de signalisation Smad 15. Nous avons étendu ces études pour déterminer l'effet de endoglin sur les métastases cancer de la prostate humaine. Stable knockdown de l'endogline, le contrôle de vecteur ou de l'endogline sur des lignées de cellules d'expression ont été implantées dans des souris. cellules knockdown de l'endogline montré le plus grand nombre de métastases du poumon, ainsi que les CTC dans 38% des souris. Souris implantées avec le vecteur de contrôle ont montré une réponse moyen, avec moins de métastases pulmonaires par souris, et CTC dans seulement 18% des souris. Souris haut endoglin implantés ont montré une élimination presque complète des métastases pulmonaires, et la suppression complète des CTC.
Ce ne sont que deux exemples de la grande variété d'applications de cette technique a. De la découverte de médicaments, à des changements de la modélisation de la biologie moléculaire, ce modèle offre une méthode d'évaluation des effets de diverses fonctions sur la croissance tumorale et la taupe à haut débitchangements vasculaires, la présence de CTC et de formation de métastases dans les ganglions distincte du poumon et les ganglions lymphatiques.
Dans cet article, nous proposons un nouveau modèle murin de métastases cancer de la prostate humaine. Dans ce modèle, le cancer de la prostate lignées de cellules PC3-M humaine est orthotopique implanté directement dans la prostate de souris Balb c thymoprives / et des tumeurs a permis de développer pendant 4-6 semaines. Dans la section des résultats représentatifs, nous montrons des exemples de données qui peuvent être collectées, y compris le poids de la souris et de la consommation alimentaire, la taille de la tumeur et le poids, les caractéristiques moléculaires de la tumeur, et la formation de métastases distincte au poumon. En outre, une grande variété de sorties supplémentaires peut être étudiée en fonction des intérêts particuliers de recherche. Un exemple en est la présence de CTC dans le sang et la moelle osseuse. Comme CTC sont un événement relativement rare (nous observons CTC dans environ 5-20% des animaux de contrôle), nous n'avons pas été surpris qu'aucun des cinq souris dans ces expériences développé CTC. Notre laboratoire a également utilisé ce modèle pour déterminer les changements dans l'adhésion cellulaire par mesure de la morphologie nucléaire de cellules dans l'tissu de la prostate 10. Nous avons également utilisé ce modèle pour évaluer l'état de prolifération et de l'apoptose de la tumeur primaire en utilisant Ki67 et coloration TUNEL de la tumeur de la prostate 14.
En plus de la grande variété de sorties de données qui peuvent être obtenues, ce modèle peut être utilisé pour déterminer les effets des deux modifications de l'expression de la protéine ainsi que des petites molécules thérapeutiques. Par rapport à de nombreux modèles spontanés et provoqués des métastases cancer de la prostate humain, il ya un délai d'exécution plus élevé de seulement 4-6 semaines. D'autres modèles avec un délai d'exécution de haut, comme veine de la queue ou les modèles d'injection intercardiac, ont des limites de non tumeur primaire, donc pas entièrement récapitulant la clinique cascade métastatique. Dans notre modèle, les cellules tumorales doivent échapper le principal site d'origine, entrez et survivre le système circulatoire, et implanter dans un site secondaire. Ceci permet d'obtenir des étapes supplémentaires au cours de laquelle une intervention thérapeutique ou d'un changement dans l'expression des protéines peuvent fournir un effet. Addilement, la présence de la tumeur primaire doit permettre une application facile de ce modèle aux nouvelles technologies d'imagerie comme la base de la luciférase-SIIV 16-17.
Malgré la grande diversité des avantages de ce modèle, il existe aussi plusieurs limites à prendre en considération. Un nombre croissant d'études montrent l'importance du système immunitaire dans le micro-environnement de la tumeur et le développement de métastases 18. Dans ce modèle, du fait de l'utilisation d'un rongeur athymiques, la capacité d'évaluer les effets du système immunitaire n'est pas possible. Une deuxième limite est le manque de réactivité des androgènes dans les cellules PC3-M. Lors du diagnostic initial de cancer de la prostate, les patients seront souvent suivre une thérapie androgènes comme traitement de première ligne. Cependant, les patients finiront par devenir androgènes résistant et tumeurs vont commencer à croître à nouveau. Comme les cellules PC3-M n'ont pas le récepteur aux androgènes, ce modèle ne mesure que les effets du traitement de la toxicomanie ou de la protéine de modulation de post-androgène c résistanteancer. Bien que ce soit une limitation, androgéno-sensibles cancer de la prostate est actuellement bien maniable et a une variété d'options de traitement efficaces, et donc le cancer androgéno-résistant est devenu plus visible étudié. Ce modèle utilise également spécifiquement une souche pure de souris, ce qui minimise la souris à la variabilité de la souris. Cependant, cette souche peut être particulièrement sensible aux protéines particulières ou de petites molécules, les soins doivent donc être prises lors de l'extrapolation de ces données à la clinique.
Bien que ce modèle fournit une mesure efficace de l'efficacité des médicaments dans un délai d'exécution rapide de 4-6 semaines, cela peut ne pas prendre en considération les effets des médicaments de dosage à long terme. Après une exposition prolongée à de nombreux traitements actuellement disponibles, les patients peuvent retourner à des cancers résistants aux médicaments de nombreuses années après le traitement. La rotation rapide de cette technique ne permet pas une modélisation efficace de la capacité d'une tumeur à acquérir une résistance à un traitement. Cependant, avec la modulation de cette exrience, les cellules cancéreuses prostatiques humaines résistantes aux traitements peuvent être implantés, et l'efficacité d'une thérapeutique de deuxième génération dans la prévention de la croissance tumorale et la métastase PCa peuvent être modélisés. En outre, si un groupe a tenté d'étudier les changements moléculaires dans une tumeur primaire dans le temps, un modèle plus long terme telles que le modèle TRAMP sera probablement plus efficace pour ces études.
Une autre limitation de ce modèle est la dissémination de métastases distinct seulement pour les ganglions lymphatiques et les poumons des animaux. Ces deux sites sont des sites fréquents et cliniquement pertinentes de métastases, comme l'a démontré par des études d'autopsie chaudes humains 19. Cependant, cliniquement métastase osseuse constitue une caractéristique importante de cancer de la prostate humain, et donc des modèles récapitulant ce sont d'intérêt. Malheureusement, ceux-ci sont difficiles à résumer dans un modèle de souris, avec très peu de modèles montrant des métastases osseuses sans queue veine, injection intercardial, ou implantation directe dansà l'os 20. Ainsi, si le ciblage de l'os est la clé importance expérimentale, un autre modèle peut être plus efficace. Toutefois, ce modèle ne donne une mesure de la circulation de l'os sous la forme de la moelle osseuse de cellules tumorales circulantes.
Malgré ces limites, cette technique est un puissant modèle de cancer de la prostate humaine. La capacité de mesurer les effets à la fois sur la tumeur primaire ainsi que la formation métastatique dans un court délai offre une grande variété d'applications. Dans ce modèle, les cellules doivent échapper à l'organe principal, entrer et de survivre dans le sang, et l'implant dans un site secondaire, récapitulant le processus chez les humains. La mesure supplémentaire de caractéristiques moléculaires de la tumeur primaire, les changements dans la morphologie des cellules, et la présence de cellules tumorales circulantes fournit une large souffle de l'information d'un modèle. Cette procédure peut être utilisée à la fois dans le contexte de la découverte de médicaments ainsi que pour étudier les changements dans la biologie tumorale.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health (NIH) à RCB, CA122985 et de la prostate SPORE CA90386, et à JMP, NIH T32 AG000260 "Drug Discovery formation sur les troubles liés à l'âge", et par Walter S. Et Lucienne programme d'études supérieures en sciences de la vie Driskill à l'Université Northwestern. Nous tenons également à remercier le phénotypage de souris et histologie laboratoire et des installations de base pathologie à l'Université Northwestern.
Equipment | |||
1 ml Syringe, Tuberculin, Slip-Tip | Becton Dickinson | 309659 | |
23 G 3/4 Precison Glide Needle | Becton Dickinson | 305143 | |
30 G 1/2 Precision Glide Needle | Becton Dickinson | 305106 | |
Alcohol Wipes | Triad | 10-3001 | |
Autoclip Applier, 9mm, Stainless Steel | Becton Dickinson | 427630 | |
Clips, 9mm | VWR | 15431-673 | |
Convertors Polyline Towel (Sterile) | Cardinal Health | 3520 | |
Cotton-Tipped Applicators, 6 inch, Sterile, Wooden Shaft | Fisher | 23-400-125 | |
Curad Sterile Cotton Balls | VWR | 500043-544 | |
Derf Needle Holder, Integra Miltex, 121 mm (4 3/4″) | VWR | 95039-192 | |
Duraprene SMT Sterile Neoprene Powder-Free Surgical Gloves | Cardinal Health | 2D72PN70 | |
Germinator 500 | Cell Point Scientific | SN 7030 | |
Kendall Monojet Needles, 1/2 cc syringe with permanent 28 G 1/2 needle | Tyco | 1180528012 | |
Medium Heating Pad | VWR | 100229-094 | |
Merit Iris Scissors, Sklar, 11.4 cm (4 1/2″) | VWR | 94000-000 | |
Metric/English Vernier Caliper | VWR | 19155-057 | |
PDS*11 Violet Monofilament Sutcher 4-0, 27″ | Ethicon | Z304H | |
VetEquip Inhalation Anesthesia System | Contact Your Animal Facility for Availability | ||
VWR Premium Tissue Cassettes | VWR | 18000-010 | |
VWR Specimen Forceps, Serrated, Straight, 114 mm (4 1/2″) | VWR | 82027-440 | |
Reagents | |||
Betadine Surgical Scrub | Fisher Healthcare | 19-027132 | |
Buprenex | Controlled Substance – Obtain from Animal Facility | ||
Dako DAB + Chromagen | Dako | K3468 | |
Dako Envision + System HRP-Labeled Polymer, Anti-Rabbit | Dako | K4003 | |
Dako Envision Kit Protein Block | Dako | X0909 | |
Formalin | VWR | 95042-908 | |
GFP Antibody | Invitrogen | A11122 | |
Hematoxylin | Mayer | MH580-2.5L | |
Meloxican | Obtain from Animal Facility | ||
Nembutal | Controlled Substance – Obtain from Animal Facility | ||
Rneasy RNA Isolation Kit | Qiagen | 74104 | |
Sterile Saline | Obtain from Animal Facility | ||
Taqman Reverse Transcription Reagents | Life Technologies | N8080234 | |
TaqMan Universal PCR Master Mix | Life Technologies | 4304437 | |
Trizol | Invitrogen | 10296 |