ヒト前立腺癌転移の同所マウスモデル

動物に関わるすべての手続きのために、プロトコルは、ノースウェスタン大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認された。外科技術および動物ケアの条件は、獣医スタッフによって観察し、動物のストレスまたは死亡率を最小化するために修飾した。個々の機関が異なる要件を持つことができ、この手術法を開発し、実行する際には、動物実験委員会および動物のスタッフと連携することが重要です。 1。注射用細胞の調製このステップは、手術の開始のできるだけ近くに行われるべきである。実験に使用されてトリプシン処理細胞を、プレートから除去し、培地を中和する。安定的にGFPをトランスフェクトしたPC3-MヒトのPCa細胞株は、正常に起因PC3-M細胞の急速な成長条件に、これらの実験に使用されている。 GFPは、肺組織試料中の肺転移の検出の追加の容易さ、および迅速な決定のために添加した循環腫瘍細胞を同定するために、血液および骨髄から得られた培養物における免疫細胞に対する癌細胞。関心対象の特定の遺伝子を改変する場合、この遺伝子の変化を有する安定な細胞株の作成は、GFPでのトランスフェクションに続いて、最初に実行される。 GFPは、目的のこの遺伝子の機能を改変する場合は、GFPには、省略することができる。これは肺転移の検出がより困難、まだ達成可能になります。さらに、このようなルシフェラーゼに基づくIVISのような蛍光マーカーを使用して、特定のイメージング技術を使用する場合、他の蛍光タンパク質が代わりに使用することができる。 225 X gで5分間遠心分離します。 2.5×10 5細胞を分離し、225×gで5分間遠心分離します。 上清を除去し、滅菌生理食塩水20μlに細胞を再懸濁。 永久28½G針で0.5ミリリットルシリンジに吸引細胞懸濁液（推奨：ケンドールMonojetを、他のブランドには問題を引き起こしているように）、空気を確保していないが、針らに入る懸濁液とONG。 無菌ホイルでシリンジをラップし、使用するまで氷上で保存する。 2。ヒト前立腺癌細胞の同所移植 6〜8週齢の雄のBalb / cの無胸腺マウスを使用する。手術の理想的なマウス体重19〜21 gで、マウスは、手術の前に少なくとも18 gまで増殖させるべきである。小さい動物は、技術的に操作することがより困難である。より大きな動物は、腫瘍増殖および転移のより遅い速度を経験する傾向がある。動物は、動物のストレスを最小限にするために手術前に少なくとも1週間動物施設に収容されるべきである。実験設計に応じて、薬物治療は、手術の前に一週間を開始することができる。 動物施設の説明書に従って手術前鎮痛剤を注入する。 1mlシリンジに取り付けられた30½Gの針を用いて0.1 mg / kg体重の皮下Buprenexが示唆される。 イソフルラン室に動物を置き、動物が完全になるまで待つnesthetized。筋緊張のないつま先の反射は、この時点では存在してはならない。この方法は推奨されるが、利用できない場合には、麻酔の他の方法は、動物施設の指示に従って使用することができる。 無菌手順フードにイソフルラン室から動物を移動します。ノーズコーン装置に動物を置き、その動物が進む前に、完全な麻酔の下で再確認してください。 ベタジン溶液で拭いてアルコールで拭いて、滅菌した綿球でベタジンスクラブで下腹部を消毒し、最終的なスプレー。乾燥することができます。 滅菌メスや鋭利に無菌手術用ハサミのいずれかを使用して、約3〜4程度の低い腹部正中切開を行う。優しく鉗子を使用して膀胱を持ち上げ、前立腺の腹葉を識別します。これら2葉は、膀胱のすぐ下に位置しています。一部のマウスを静かに滅菌綿棒を使用して脇に移動させることができ、前立腺をカバーする脂肪の薄い層を持つことになります。最小限に抑えるため、Eすべての臓器の動きや筋肉、可能な場合。 漏れを最小限に抑え、小さな気泡が観察さを確保し、前立腺に20μlの体積細胞溶液を注入する。 膀胱を交換して、簡単な中断パターンで4.0吸収性ビクリルモノフィラメント縫合糸を使用して、筋層を閉じます。 無菌9ミリメートルのステープルを使用して、スキン層を閉じます。 イソフルラン麻酔から動物を削除して、目を覚まし、通常移動するまで監視します。回復期間中加熱パッド上に置きます。 複数の手術が行われている場合、手術の間、70％エタノールですべてのツールをきれいにし、ガラスビーズ滅菌器を用いて滅菌する。ツールは次の動物の前に完全に冷却します。縫合糸、コットンボール、または滅菌綿棒は再使用しないでください。 3。動物を監視する動物施設の指示に基づいて、鎮痛薬を管理します。 1 mg / kg体重で皮下uのメロキシカムの単回投与の4時間術後投与1ミリリットルのシリンジに取り付けた30½G針を歌うには、提案され、追加の用量で、次の48時間ごとに12から24時間後に続いている。 傷が治癒した後のステープルは、手術後7〜10日の動物から削除することができます。 動物の体重、食物消費を監視し、実験終了まで、週に2回、腫瘍に対してマウスを触診。腫瘍が有意な腫瘍の負担又は強迫の下で動物をチェックする目に見えるようになるとき、一日おきまで頻度を上げる。原発腫瘍が尿流を遮断することができるように、このモデルから早期死亡は、大規模な原発腫瘍負荷によるものなので、15％を超える体重または直径1.5cmに達した原発性腫瘍の消失を持つ動物は、直ちに剖検する必要があります尿路閉塞や動物の死を防ぐ。 動物の環境のさらなる濃縮の必要性を監視。手術のストレスは動物の内紛を向上させます。代わりに、1と追加行動のケージあたり2プラスチック小屋の追加アル濃縮は、これらの事件を減らすことができます。動物がで収容されている施設で利用可能な獣医スタッフのオプションを使用して説明します。彼らが目を刺激することができますようにマウスのこの株にまつげの欠如を考えると、紙製の小屋と濃縮はお勧めできません。 4。剖検手順 4-6週間後、腫瘍が完全に明らかであり、動物が増加し、腫瘍負荷のために体重を失い始める。腫瘍は通常、触診および/または視覚的に明らかであることができます。剖検は、この時点で実行する必要があります。 1ミリリットルのシリンジに取り付けた30½ゲージの針を使用して260 mg / kg体重でネンブタールの腹腔内注射を行い、動物が無つま先反射や筋緊張の存在を完全に意識不明になることができます。 動物を麻酔した後、滅菌した手術用ハサミやメスを用いて、動物の側に沿って脇下に垂直にして、直接、胸郭の下で動物の胴体全体に水平にカット、心臓を露出。動物からできるだけ多くの血液を得、血液凝固を防ぐためにDPBS中の4％クエン酸ナトリウムでフラッシュした1mlシリンジに取り付けた30½Gの針を用いて末端心穿刺を行う。 外科ハサミやメスで気管を切断することにより動物から肺を取り出して、すぐに組織培養カセットに、10％ホルマリンに入れる。 個別に腫瘍に接続されているすべての血管を切断し、このような精管や精嚢などの追加の臓器を確保していないことにより、動物から原発性前立腺腫瘍を除去が付属します。 腫瘍の重さと大きさを記録します。実験室規模でのグラム単位での腫瘍の重量を測定する。ノギスを使用して、センチの腫瘍の最長径、対応する垂直軸の長さを測定します。腫瘍の大きさを得るために、これらの値を掛けます。使用目的に応じて、直ちに液体窒素、および/または場所でフリーズスナップ10％ホルマリンに組織カセットである。 外科ハサミやメスで、股関節と膝関節を露出させ、脚の関節を外して、そのまま骨を維持するように注意しながら。動物から大腿骨を削除し、滅菌生理食塩水に入れる。 関心のある他の臓器や資料を入手して、あなたの研究所の指示に従って動物を処分。具体的には、局所リンパ節に転移を有する傾向がある、それらを保有する場合に拡大される傾向にあり、収穫することができる。これは外科的処置によって生じる静水圧の変化によって影響を受けることができるように、しかし、注意を払うべきである。 5。肺組織サンプルの処理および免疫染色 PBS中の10％ホルマリンに組織を置くことの24〜48時間以内に、パラフィンに肺を埋め込む。 セクション2月3日、隣接する4μmの肺組織切片を取って45ミクロン段部での肺、。 GFP陽性細胞は（推奨）を使用した場合、免疫染色を行うGFPについて。そうでない場合、標準的なヘマトキシリン​​およびエオシン（H＆E）染色を行う。 NOTE：InvitrogenのGFP抗体と組み合わせたダコエンビジョン+キットは、製造業者の説明書に従って成功裏に使用されてきたが、これは、任意の免疫組織化学的手順に変更することができる。 盲検法で転移をスコア。 GFP陽性の場合、腫瘍細胞は大きく、独特の核を有することに加えて褐色染色する。第一のスコアリング時転移、正確なスコアリングを確保し、腫瘍細胞の存在を確認するために、H＆E染色した肺組織を使用するために病理学者に相談して、免疫細胞の浸潤はない。 6。血と骨髄から循環腫瘍細胞の同定 1.5ミリリットルの遠心分離管に剖検から収集されたすべての血液を追加します。 800×gで5分間遠心。 血漿を除去し、1mlのACK溶解バッファーを追加（154.95 mMの塩化アンモニウム、9.99 mMのカリウムBicarboネイト、0.0995のEDTA、）。血液は室温3〜5分で座ることができます。 800×gで5分間遠心。 上清を除去し、抗生物質を含む細胞培養培地の1ミリリットルを加える。細胞培養培地の9ミリリットルを含むT75フラスコにセルを追加。 2-3日ごとにCTCの存在をチェックする、10日間の5％CO 2を含む加湿雰囲気中で37℃で培養細胞。 骨髄では、はさみ、かみそりの刃、またはメスを用いて大腿骨からすべての筋肉組織を削除します。できるだけ両端近くに、骨の末端を削除します。 23¾G針を使用して、穏やかに1.5ミリリットルの遠心管に大腿骨から骨髄を取り出す。 細胞培養培地1mlに加え、穏やかに混合するためによくピペット。 細胞培養培地の9ミリリットルを含むT75フラスコにセルを追加。 7。腫瘍の分子特性ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）アッセイのためのsは、液体窒素中で急速凍結した腫瘍試料は、第1のドライアイス上で粉砕し、次いで1ミリリットルのTRIzolに3〜5分間、組織ホモジナイザーを用いてホモジナイズする。トリゾール抽出は、製造者の指示に従って行われる。製造業者の説明書に従ってをRNeasy RNA単離キットを用いてRNAを精製する。製造業者の指示に従ってたTaqMan試薬を用いてcDNA合成および定量的リアルタイムPCR（定量RT / PCR）を行うことが推奨され、現在使用される任意のPCR法に変更することができる。 、PBS（137mMのNaCl、10mMのリン酸Na、2.7mMのKCl）、0.5％トリトンX-100、1mMのEDTA：ウェスタンブロットアッセイのために、溶解緩衝液1mlで3〜5分間、組織ホモジナイザーを用いて組織をホモジナイズ2.5mMのピロリン酸ナトリウム、プロテアーゼインヒビターカクテル、リン阻害剤カクテル2および3、10mMのフッ化ナトリウム、および1mMのオルトバナジン酸ナトリウムを添加して1mMのβ-グリセロリン酸、。細胞溶解混合物を1.5 mlの遠心管に入れる。 セント13,000×gで10分間rifuge細胞溶解物。 新しい1.5 ml遠心チューブに上清と場所を削除し、13,000×gで10分間再度遠心分離した。細胞の破片がまだ存在する場合、追加の遠心分離工程を行うことができる。 上清を除去し、通常の実験室条件に従ってウエスタンブロットを行う。