Un ortotopico Modello murino di Human Prostate Cancer Metastasi

Per tutte le procedure che coinvolgono gli animali, i protocolli sono stati approvati dalla cura degli animali ed uso Comitato Istituzionale (IACUC) alla Northwestern University. Le tecniche chirurgiche e le condizioni per la cura degli animali sono state osservate dal personale veterinario e modificate per ridurre al minimo lo stress degli animali o la mortalità. I singoli istituti possono avere esigenze diverse ed è importante lavorare con IACUC e animale personale quando lo sviluppo e l'esecuzione di questa tecnica chirurgica. 1. Preparazione di cellule per iniezione Questa operazione deve essere effettuata il più vicino possibile a interventi chirurgici di partenza. Trypsinize cellule di essere utilizzati per l'esperimento, togliere dal piatto, e neutralizzare con i media. La linea cellulare PC3-M umana CaP stabilmente trasfettate con GFP è stato usato con successo per questi esperimenti, a causa delle condizioni di rapida crescita delle cellule PC3-M. GFP è stato aggiunto per ulteriori facilità di rilevamento delle metastasi polmonari nei campioni di tessuto polmonare e rapida determinazionecellule tumorali rispetto a cellule immunitarie in colture ottenute da sangue e midollo osseo per identificare le cellule tumorali circolanti. Se modificando uno specifico gene di interesse, poi creazione di linee cellulari stabili con questo gene alterazione viene eseguita per prima, seguita da trasfezione con GFP. Se GFP altererà la funzione di questo gene di interesse, GFP può essere omesso. Questo renderà rilevamento di metastasi polmonari più difficile, ma ancora raggiungibile. Inoltre, se si utilizza la tecnologia di imaging specifico utilizzando marcatori fluorescenti, come base luciferasi-IVIS, altre proteine ​​fluorescenti possono essere utilizzati al posto. Centrifugare per 5 min a 225 x g. Isolare 2,5 x 10 5 cellule e centrifugare per 5 min a 225 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 20 ml di soluzione fisiologica sterile. Sospensione cellulare Aspirare in una siringa da 0,5 ml, con un permanente 28 ½ G ago (consigliato: Kendall monogetto, come altre marche hanno causato problemi), garantendo l'aria entra al agoong con la sospensione. Avvolgere la siringa in un foglio sterile e memorizzare sul ghiaccio fino al momento dell'uso. 2. L'impianto ortotopico di cellule umane di cancro alla prostata Sono utilizzati maschio di 6-8 settimane di età Balb / c athymic topi. Il mouse peso corporeo ideale per la chirurgia è 19-21 g, e topi dovrebbe essere consentito di crescere per almeno 18 g prima dell'intervento chirurgico. Animali più piccoli sono tecnicamente più difficili da operare. Animali più grandi tendono a sperimentare cinetica più lenta della crescita tumorale e metastasi. Gli animali dovrebbero essere ospitati nella struttura animale almeno una settimana prima di un intervento chirurgico per ridurre al minimo lo stress degli animali. A seconda del disegno sperimentale, il trattamento farmacologico può iniziare una settimana prima dell'intervento. Iniettare dolore pre-operatorio di farmaci secondo le istruzioni di impianto degli animali. 0,1 mg / kg di peso corporeo Buprenex sottocutanea utilizzando un ago 30 G ½ attaccato ad una siringa da 1 ml è suggerito. Posizionare gli animali nella camera di isoflurano e attendere che gli animali sono completamente unnesthetized. Nessun riflesso punta del tono muscolare dovrebbe essere presente a questo punto. Questo metodo è consigliato, ma se non disponibili, altri metodi di anestesia può essere utilizzato in base alle istruzioni del stabulario. Spostare animale fuori dalla camera isoflurano in una cappa sterile procedura. Posizionare animale nell'apparecchio cono, e ri-assicurarsi che animale è a pieno anesthetization prima di procedere. Disinfettare bassa regione addominale con uno scrub Betadine con batuffoli di cotone sterili, pulire con alcool pulire, e spruzzi finale con soluzione di Betadine. Lasciare asciugare. Utilizzando un bisturi sterile o forbici chirurgiche sterili affilate, una bassa incisione addominale mediana di circa 3-4 mm è fatto. Sollevare delicatamente la vescica con pinze e identificare il lobo ventrale della prostata. Questi due lobi si trovano direttamente sotto la vescica. Alcuni topi avranno un piccolo strato di grasso che copre la prostata che può essere spostata delicatamente parte usando un tampone di cotone sterile. Minimizzandoe qualsiasi movimento di organi e muscolatura se possibile. Iniettare soluzione di cellule di volume ul 20 nella ghiandola prostatica, minimizzando le perdite e assicurando una piccola bolla viene osservata. Sostituire la vescica e chiudere lo strato di muscolo utilizzando 4,0 assorbibili sutura Vicryl monofilamento in un semplice schema interrotto. Chiudere lo strato di pelle con sterili 9 millimetri graffette. Rimuovere animali dall'anestesia isoflurano e monitorare fino svegli e muoversi normalmente. Mettere in rilievo di riscaldamento durante il periodo di recupero. Se vengono eseguiti diversi interventi chirurgici, tra ambulatori, pulire tutti gli strumenti con il 70% di etanolo, e sterilizzare utilizzando uno sterilizzatore perle di vetro. Lasciare strumenti per raffreddare completamente prima di animale successivo. Non riutilizzare suture, batuffoli di cotone o tamponi sterili. 3. Monitoraggio Animali Somministrare farmaci antidolorifici in base alle istruzioni del stabulario. 4 ore post-chirurgia somministrazione di una dose di meloxicam sottocutanea a 1 mg / kg di peso corporeo ucantare un ago da 30 G ½ attaccato ad una siringa da 1 ml è suggerito, seguita da una dose aggiuntiva ogni 12-24 ore per il prossimo 48 hr. Staples possono essere rimossi da animali 7-10 giorni post-operatorie dopo la ferita è guarita. Controllo del peso degli animali, il consumo di cibo, e palpare i topi per i tumori due volte a settimana fino al termine dell'esperimento. Aumentare la frequenza fino a ogni altro giorno quando i tumori diventano visibili per verificare animali sotto notevole massa tumorale o costrizione. Morte prematura da questo modello è dovuto alla grande massa tumorale primaria, come tumori primari possono bloccare il flusso urinario, quindi eventuali animali con una perdita superiore al 15% del peso corporeo o un tumore primario raggiungendo un diametro di 1,5 cm dovrebbe essere necroscopia immediatamente prevenire l'ostruzione delle vie urinarie e la morte degli animali. Controllo per necessità di ulteriore arricchimento dell'ambiente animale. Lo stress della chirurgia aumenta lotte degli animali. L'aggiunta di due rifugi plastica per gabbia invece di uno e comportamento aggiuntivoAl arricchimento può ridurre questi incidenti. Discutere con le opzioni del personale veterinario disponibili presso la struttura gli animali sono ospitati a. Data la mancanza di ciglia su questo ceppo di topi, capanne e arricchimento fatto di carta non sono raccomandati in quanto possono irritare gli occhi. 4. Procedure necroscopici Dopo 4-6 settimane, i tumori sono del tutto evidenti e gli animali cominciano a perdere peso a causa di una maggiore massa tumorale. I tumori in genere può palpazione e / o sono visivamente evidenti. Necroscopico deve essere eseguita a questo punto. Eseguire un'iniezione intraperitoneale di Nembutal a 260 mg / kg di peso corporeo utilizzando un ago calibro 30 ½ attaccato ad una siringa da 1 ml, e permettono gli animali di diventare completamente incosciente, senza riflessi punta o il tono muscolare presente. Una volta che l'animale è anestetizzato, usando forbici chirurgiche sterili o un bisturi, tagliare orizzontalmente attraverso il torso dell'animale direttamente sotto la gabbia toracica, poi verticalmente per l'ascella lungo il lato dell'animale, Esporre il cuore. Eseguire una puntura cardiaca terminale usando un ago 30 G ½ attaccato ad una siringa da 1 ml lavata con 4% di citrato di sodio in DPBS per prevenire la coagulazione, ottenendo come molto sangue possibile dall'animale. Rimuovere i polmoni dall'animale tagliando la trachea con le forbici chirurgiche o un bisturi e collocare immediatamente in una cassetta di coltura tissutale e in 10% formalina. Rimuovere il tumore prostatico primario dall'animale tagliando singolarmente eventuali vasi sanguigni collegati al tumore e non accertando organi aggiuntivi come vasi deferenti o vescicole seminali sono allegati. Registrare il peso e le dimensioni del tumore. Misurare il peso del tumore in grammi su scala di laboratorio. Utilizzando pinze, misurare la lunghezza del diametro maggiore del tumore in centimetri, e il corrispondente asse perpendicolare. Moltiplicare questi valori per ottenere le dimensioni del tumore. A seconda dell'utilizzo previsto, immediatamente scattare congelare in azoto liquido, e / o posto inad una cassetta tessuto in formalina al 10%. Esporre le articolazioni dell'anca e del ginocchio con le forbici chirurgiche o un bisturi, e articolazioni delle gambe disconnessione, facendo attenzione a mantenere intatto il femore. Rimuovere i femori dall'animale e riporre in soluzione salina sterile. Ottenere tutti gli altri organi o materiali di interesse, e smaltire animali secondo le istruzioni del vostro Istituto. In particolare, linfonodi regionali tendono ad avere metastasi, tendono ad essere ampliata se li nutrire, e possono essere raccolte. Tuttavia, occorre prestare attenzione in quanto questo può essere influenzata da cambiamenti della pressione idrostatica causati dalla procedura chirurgica. 5. Lavorazione e Immunostaining di tessuto polmonare Campioni Entro 24-48 ore di mettere il tessuto in formalina al 10% in PBS, incorporare i polmoni in paraffina. Sezione polmoni a 45 sezioni micron passo, tenendo 2-3 adiacenti 4 micron sezioni di tessuto polmonare. Se sono stati utilizzati cellule GFP-positive (consigliato), eseguire immunostainingper GFP. In caso contrario, eseguire ematossilina standard ed eosina (H & E) colorazione. NOTA: Il kit Dako Envision + in combinazione con l'anticorpo GFP da Invitrogen è stato utilizzato con successo in base alle istruzioni del produttore, ma questo può essere modificato per qualsiasi procedura immunoistochimica. Punteggio metastasi in cieco. Se GFP-positive, le cellule tumorali si macchia marrone oltre ad avere nuclei caratteristici grandi. Quando prima metastasi segnare, consultare un patologo per assicurare il corretto punteggio, e usare H & E macchiato tessuto polmonare per confermare la presenza di cellule tumorali, e non infiltrante cellule immunitarie. 6. Identificazione delle cellule tumorali circolanti da sangue e midollo osseo Aggiungere tutto il sangue raccolto dal necroscopia in una provetta da centrifuga da 1,5 ml. Centrifugare 5 min a 800 x g. Rimuovere il plasma e aggiungere 1 ml di ACK Lysis Buffer (154,95 mM cloruro di ammonio, 9.99 mM di potassio Bicarbonate, 0,0995 mM EDTA,). Lasciare che il sangue per riposare a temperatura ambiente 3-5 min. Centrifugare 5 min a 800 x g. Rimuovere il surnatante e aggiungere 1 ml di coltura cellulare supporti contenenti antibiotici. Aggiungere cellule in un pallone T75 contenente 9 ml di coltura delle cellule. Cellule di coltura a 37 ° C in atmosfera umidificata contenente il 5% di CO 2 per 10 giorni, controllando la presenza di CTC ogni 2-3 giorni. Per midollo osseo, rimuovere tutto il tessuto muscolare da femori utilizzando un paio di forbici, una lama di rasoio, o bisturi. Rimuovere le estremità delle ossa, più vicino alle estremità più possibile. Utilizzando un ago 23 G ¾, estrarre delicatamente il midollo osseo dal femore in una provetta da centrifuga da 1,5 ml. Aggiungi a 1 ml di terreni di coltura cellulare e pipettare delicatamente bene per amalgamare. Aggiungere cellule in un pallone T75 contenente 9 ml di coltura delle cellule. 7. Caratterizzazione molecolare dei tumori Per reazione a catena della polimerasi (PCR)s, campioni di tumore che erano scatto congelati in azoto liquido sono prima polverizzati in ghiaccio secco e poi omogeneizzate utilizzando un omogeneizzatore tessuto per 3-5 min con 1 ml TRIzol. TRIzol estrazione è effettuata secondo le istruzioni del produttore. Purificare RNA utilizzando il kit di isolamento RNeasy RNA secondo le istruzioni del produttore. Esecuzione di sintesi del DNA e real time PCR quantitativa (qRT / PCR) utilizzando reagenti TaqMan secondo le istruzioni del produttore è consigliato, ma può essere modificato per qualsiasi metodo PCR attualmente impiegato. Per i saggi di Western blot, omogeneizzare tessuti utilizzando un omogeneizzatore tessuto per 3-5 min con 1 ml di tampone di lisi: PBS (137 mM NaCl, 10 mM Na fosfato, 2,7 mM KCl), 0,5% Triton X-100, 1 mM EDTA, pirofosfato di sodio 2,5 mM, 1 mM β-glicerofosfato, con aggiunta di cocktail di inibitori delle proteasi, inibitori fosfato cocktail 2 e 3, fluoruro di sodio 10 mM e 1 mM sodio ortovanadato. La miscela lisato cellulare viene posto in una provetta da centrifuga da 1,5 ml. Centrifuge miscela lisato cellulare per 10 minuti a 13.000 x g. Rimuovere il surnatante e posto in una nuova provetta da centrifuga da 1,5 ml e centrifugato nuovamente per 10 minuti a 13.000 x g. Se detriti cellulari è ancora presente, una fase di centrifugazione aggiuntivo può essere eseguita. Rimuovere il surnatante ed eseguire un Western blot secondo normali condizioni di laboratorio.