İnsan Prostat Kanser metastaz Ortotopik fare modeli

Hayvanları ile ilgili tüm prosedürler için, protokoller Northwestern Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Cerrahi teknikler ve hayvan bakım koşulları veteriner personeli tarafından gözlemlenen ve hayvan stres ya da ölüm oranını en aza indirmek için modifiye edildi. Bireysel kurumlar farklı gereksinimleri olabileceğini ve bunu geliştirmek ve bu cerrahi teknik yürütürken IACUC ve hayvan personel ile çalışmak önemlidir. 1.. Enjeksiyon için hücrelerin hazırlanması Bu adım ameliyatları başlamadan mümkün olduğunca yakın yapılmalıdır. Deney için kullanılan Hücreleri tripsinize edin, levha kaldırmak ve ortam ile nötralize edin. Kararlı bir şekilde GFP ile transfekte edilmiş insan PC3-M PCa hücre hattı, başarılı bir şekilde nedeniyle PC3-M hücrelerinin hızlı büyüme koşullarına, bu deneyler için kullanılmıştır. GFP akciğer doku örnekleri ve hızlı tespiti de akciğer metastazı tespit ek kolaylığı için ilave edildiKan ve dolaşımdaki tümör hücrelerini tespit etmek kemik iliğinden elde edilen kültürlerin bağışıklık hücrelerinin karşı kanser hücreleri. Ilgi çekici bir spesifik gen değiştirme ise, bu gen değişiklikleri ile stabil hücre çizgilerinin oluşturulması GFP ile transfeksiyonu takiben, ilk olarak gerçekleştirilir. GFP ilgi bu genin işlevini değiştirmek olacaksa, GFP bu ihmal edilebilir. Bu, akciğer metastazı saptanması daha zor, ama yine de ulaşılabilir yapacaktır. Örneğin lusiferaz bazlı IVIS floresan belirteçleri kullanarak spesifik bir görüntüleme teknolojisi kullanılarak, ayrıca, diğer floresan proteinleri yerine kullanılabilir. 225 x g, 5 dakika boyunca santrifüj. 225 x g, 5 dakika boyunca 2.5 x 10 5 hücre ve santrifüj izole edin. Steril tuzlu su içinde 20 ul süpernatan ve hücreler tekrar süspansiyon çıkarın. Kalıcı bir 28 ile 0.5 ml şırınganın içine aspire hücre süspansiyonu ½ G iğne (önerilen: diğer markalar sorunlara yol gibi Kendall MONOJET), hiçbir hava sağlanması iğne al girersüspansiyon ile Ong. Steril folyo şırınga sarın ve kullanılıncaya kadar buz üzerinde saklayın. 2. İnsan Prostat Kanseri Hücrelerinin Ortotopik implantasyon Erkek 6-8 haftalık Balb / c atimik fareler kullanılır. Ameliyat için ideal bir fare vücut ağırlığı 19-21 g, ve farenin ameliyat öncesi en azından 18 g kadar büyümesi izin verilmelidir. Küçük hayvanlar teknik olarak daha zor çalışmasına vardır. Daha büyük hayvanlar, tümör büyümesi ve metastazın yavaş kinetik deneyim eğilimindedir. Hayvanlar, hayvan barınağında en az bir hafta önce hayvanlar stresi en aza indirmek için cerrahi olarak muhafaza edilmelidir. Deneysel tasarım bağlı olarak, ilaç tedavisi ameliyattan bir hafta başlayabilir. Hayvan tesisin talimatlarına göre ön cerrahi ağrısı ilaç enjekte edilir. Bir 1 ml şırınga bağlanmış bir 30 ½ G iğne kullanılarak 0.1 mg / kg vücut ağırlığı deri altından Buprenex önerilmektedir. Izofluran odasına hayvanlar koyun ve hayvanlar tamamen bir kadar bekleyinnesthetized. Kas tonusu hiçbir ayak refleks bu noktada mevcut olmalıdır. Bu yöntem tavsiye edilir, ancak uygun olmaması halinde, anestezi diğer yöntemler hayvan tesis talimatlarına göre kullanılabilir. Steril bir prosedür kaputun içine Izofluran odasının dışında hayvan taşımak. Burun konisi cihazın içine yerleştirin hayvan ve hayvan geçmeden önce tam anestezi altında olduğunu yeniden sağlamak. , Steril pamuk topları ile bir Betadinede fırçalayın ile alt karın bölgesi dezenfekte silin alkol ile silin, ve Betadinede çözüm ile son sprey. Kurumasını bekleyin. Steril bir bisturi bıçağını veya keskinleştirilmiş steril cerrahi makas, yaklaşık 3-4 mm'lik bir düşük orta hat karın ya da insizyon kullanılarak yapılır. Yavaşça forseps kullanarak mesane kaldırın ve prostat ventral lobu belirlemek. Bu iki lobları doğrudan mesane altında yer almaktadır. Bazı fareler yavaşça steril pamuklu çubuk kullanarak kenara taşınmış olabilir prostat kaplayan yağ küçük bir katman olacak. Minimize tüm organların hareketi ve kas mümkünse. Sızıntısını en aza indirir ve küçük bir kabarcık görülmektedir sağlanması, prostat bezine 20 ul hacmi, hücre enjekte çözüm. Mesane değiştirin ve basit bir kesintiye desen 4.0 emilebilir vikril monofilament sütür kullanarak kas tabakası kapatın. Steril 9 mm zımba kullanılarak deri tabakası kapatın. Uyanık ve normalde hareketli kadar izofluran anestezi hayvan çıkarın ve monitör. Iyileşme döneminde ısıtma yastığı yerleştirin. Birden ameliyatları% 70 etanol ile ameliyatları, temiz, tüm araçlar arasında yapılan ve bir cam boncuk sterilizatör kullanılarak sterilize ediliyor ise. Araçlar yanında hayvan önce tamamen soğumasını bekleyin. Sütür, pamuk topları, ya da steril bezlerden tekrar etmeyin. 3. Hayvanlar İzleme Hayvan tesisin talimatlara göre ağrı kesici ilaç yönetmek. 1 mg / kg vücut ağırlığı u da deri altı Meloksikam bir doz 4 saat ameliyat sonrası tatbikbir 1 ml şırınga bağlanmış bir 30 G iğne ½ şarkı, önerilen ek bir doz bir sonraki 48 saat boyunca her 12-24 saat takip edilir. Yara iyileştikten sonra Staples hayvanlar 7-10 gün ameliyat sonrası kaldırılabilir. Hayvan ağırlığı, gıda tüketimini izlemek ve deney bitimine kadar haftada iki kez tümörler için fareler palpe. Tümörler belirgin tümör yükü ya da baskı altında hayvanlara kontrol etmek için görünür olunca her gün kadar sıklığını arttırın. Primer tümörler idrar akışını engelleyebilir bu modelden Erken ölüm, büyük bir primer tümör yükü nedeniyle, bu yüzden daha büyük% 15 vücut ağırlığına veya 1,5 cm'lik bir çapa ulaşan bir primer tümör kaybı ile herhangi bir hayvan hemen otopsi olmalıdır idrar tıkanıklığı ve hayvan ölümleri önlemek. Hayvan ortamının ek zenginleştirilmesi için ihtiyacı için izleme. Cerrahi stres hayvan sürtüşmenin artırır. Bir yerine ve ek davranış kafes başına iki plastik kulübe ilavesial zenginleştirme bu olayları azaltabilir. Hayvanların en yerleştirilmiştir tesisinde mevcut veteriner personeli seçenekleri ile tartışın. Onlar gözleri tahriş edebilir gibi farelerin bu gerginlik üzerine kirpik eksikliği göz önüne alındığında, kulübe ve kağıttan yapılmış zenginleştirme tavsiye edilmez. 4. Otopsi İşlemleri 4-6 hafta sonra, tümörler tamamen belirgindir ve hayvanların artan tümör yükü kilo kaybetmeye başlar. Tümörler genelde elle muayene ve / veya görsel olarak belirgin olabilir. Otopsi bu noktada yapılmalıdır. Bir 1 ml şırınga bağlanmış bir 30 ½ iğne kullanılarak 260 mg / kg vücut ağırlığı Nembutal bir intraperitoneal enjeksiyon yapın ve hayvanlar herhangi bir ayak refleks veya kas tonu mevcut olan, tam olarak bilinçsiz hale gelmesini sağlar. Hayvan steril cerrahi makas veya bir bisturi bıçağını kullanarak, anestezi sonra, hayvanın tarafındaki koltuk altına dikey olarak, daha sonra yatay doğrudan göğüs kafesinin altında hayvanın gövdesi boyunca kesilmiş, Kalp maruz. Hayvandan mümkün olduğu kadar kan alınarak, pıhtılaşmayı önlemek için DPBS içinde% 4 sodyum sitrat ile yıkanmış, 1 ml şırınga bağlanmış bir 30 G iğne kullanılarak ½ bir terminal kardiyak ponksiyon yapın. Cerrahi makas veya bir bisturi ile kesilerek trakea hayvandan ciğerleri çıkarın ve hemen bir doku kültürü kaseti içine ve% 10 formalin içine koyun. Tek tümöre bağlı herhangi bir kan damarları kesme ve bu vas deferens veya seminal vesiküller gibi herhangi bir ek organları sağlanarak hayvandan birincil prostat tümörü bağlıdır. Tümörün ağırlığı ve boyutunu kaydedin. Bir laboratuar ölçeğinde gram olarak tümör ağırlığını ölçün. Kumpas kullanarak, santimetre olarak tümörün en uzun çapı uzunluğunu ve karşılık gelen dikey ekseni ölçer. Tümör boyutu elde etmek için bu değerleri çarpın. Kullanım amacına bağlı olarak, hemen sıvı nitrojen ve / veya yerine de dondurma oturtun% 10 formalin içine bir doku kasetine. Sağlam femur tutmak için dikkatli olmak, cerrahi makas veya neşter, ve ayırma bacak eklemleri ile kalça ve diz eklemleri Açığa. Hayvandan femur çıkarın ve steril tuzlu su içine koyun. Başka herhangi bir organ veya ilgi malzemeleri edinmek ve enstitünün talimatlarına göre hayvanın imha. Özellikle, bölgesel lenf düğümleri, metastaz var eğilimindedir onları barındıran, büyütüldüğünde olma eğilimindedir, ve hasat edilebilir. Bu cerrahi işlem nedeniyle hidrostatik basınç değişiklikleri etkilenebilir Ancak, dikkat edilmelidir. 5. İşleme ve Akciğer Doku Örnekleri immün PBS içinde% 10 formalin içine doku verme 24-48 saat içinde, parafin içine gömmek akciğer. Bölüm 2-3 bitişik 4 mikron akciğer doku kesitleri alarak 45 mikron adım bölümlerde akciğerler. GFP pozitif hücreler kullanılmıştır (önerilen), immun boyama yapmakGFP için. Değilse, standart hematoksilen ve eozin (H & E) lekeleme gerçekleştirin. Not: Invitrogen'den GFP antikor ile birlikte Dako Envision + Kiti, üreticinin talimatlarına uygun olarak başarıyla kullanılmıştır, ancak bu bir immünohistokimya prosedüre değiştirilebilir. Kör bir şekilde metastaz skor. GFP pozitif ise, tümör hücreleri, büyük ve farklı çekirdek sahip olmanın yanı sıra, kahverengi leke olacaktır. İlk puanlama metastaz, doğru puanlama sağlamak ve bağışıklık hücrelerini infiltre tümör hücrelerinin varlığını teyit değil, H & E boyalı akciğer dokusu kullanmak için bir patolog başvurulmalıdır. 6. Kan ve Kemik İliği gelen dolaşan tümör hücrelerinin tanımlanması 1,5 ml santrifüj tüpüne otopsiden toplanan kan ekleyin. 800 x g santrifüj 5 dak. Plazma çıkarın ve 1 ml ACK Lysis Buffer (154,95 mM amonyum klorür, 9,99 mM potasyum bikarbonat, eklemeNate, 0.0995 mM EDTA). Kan oda sıcaklığında 3-5 dk bekletin. 800 x g santrifüj 5 dak. Süpernatantı ve hücre kültür ortamı antibiyotik içeren 1 ml ekleyin. Hücre kültür ortamı içinde 9 ml ihtiva eden bir şişeye T75 hücreleri ekleyin. Her gün, 2-3 kapalı zaman eğrileri varlığı kontrol, 10 gün boyunca% 5 CO2 içeren nemli bir atmosferde 37 ° C 'de kültür hücreleri. Kemik iliği için, bir makas, jilet veya neşter kullanılarak femur tüm kas dokusu kaldırmak. Mümkün olduğunca yakın uçlarına, kemik uçlarını çıkarın. 23 ¾ G iğne kullanarak, yavaşça bir 1.5 ml santrifüj tüpüne femur kemik iliği çıkarır. Hücre kültür ortamı, 1 ml ekle ve hafifçe karıştırmak için iyi pipetle. Hücre kültür ortamı içinde 9 ml ihtiva eden bir şişeye T75 hücreleri ekleyin. 7. Tümörlerinde Moleküler Karakterizasyonu Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) için, tahlils, sıvı azot içinde dondurulmuş ek olan tümör örnekleri önce kuru buz üzerinde toz haline getirildi ve daha sonra, 1 ml Trizol ile 3-5 dakika boyunca, bir doku homojenleştirici kullanılarak homojenize edilir. TRIzol ekstraksiyon, üretici talimatlarına göre gerçekleştirilir. Üreticinin talimatlarına göre RNeasy RNA izolasyon kiti kullanılarak RNA arındırın. CDNA sentezi gerçekleştirme ve kantitatif gerçek zamanlı, üreticinin talimatlarına uygun olarak TaqMan reaktifler kullanılarak PCR (qRT / PCR) kullanılması tavsiye edilir, ancak şu anda kullanılan herhangi bir PCR yöntemi için modifiye edilebilir. , PBS (137 mM NaCl, 10 mM Na-fosfat, 2.7 mM KCl),% 0.5 Triton X-100, 1 mM EDTA: Western blot analizi için, liziz tamponu 1 ml 3-5 dakika boyunca, bir doku homojenleştirici kullanılarak dokular homojenize 2.5 mM sodyum pirofosfat, proteaz inhibitör kokteyli, fosfat inhibitörü kokteyl, 2 ve 3, 10 mM sodyum fluorür, 1 mM sodyum ortovanadat ilavesi ile 1 mM β-gliserofosfat,. Hücre lizatı karışımı, 1,5 ml santrifüj tüpüne yerleştirilmiştir. Sent13,000 x g de 10 dakika boyunca rifuge hücre lisatı bir karışım. Yeni bir 1.5 ml santrifüj tüpüne süpernatan ve yer çıkarın ve 13000 x g ile 10 dakika boyunca tekrar santrifüje tabi tutulur. Hücre artıkları hala mevcut olan, diğer bir santrifüjleme aşaması gerçekleştirilebilir. Süpernatant kaldırmak ve normal laboratuar koşullarında başına bir Western lekesini gerçekleştirin.