JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicine

Ортотопическая мышиной модели человеческого рака простаты Метастазы

Published: September 18, 2013
doi:
10.3791/50873
, ,
1Department of Medicine,Northwestern University, 2Robert H. Lurie Cancer Center,Northwestern University, 3Center for Molecular Innovation and Drug Discovery,Northwestern University

Summary

Это ортотопической модели рака предстательной железы человека позволяет для количественного определения размера опухоли, циркулирующих опухолевых клеток и образование различных метастазов в легких. Как клетки должны бежать первичный орган, попадает в кровь, и имплантировать в дополнительном сайте, эта модель эффективно повторяет сценарий в организме человека.

Abstract

Наша лаборатория разработала новую ортотопической имплантации модель человеческого рака простаты (РПЖ). Как РПЖ смерть не из-за первичной опухоли, а, скорее, формирование отдельного метастазов, способность эффективно моделировать эту прогрессию предварительно клинически имеет высокое значение. В этой модели клетки непосредственно имплантировали в брюшную доле простаты в линии BALB / C бестимусных мышей и давали прогрессировать в течение 4-6 недель. При прекращении эксперимента, несколько различных конечные точки могут быть измерены, например, размера и молекулярной характеристики первичной опухоли, наличие и количественного определения циркулирующих опухолевых клеток в крови и костном мозге, и формирование метастаз в легких. В дополнение к различным конечным точкам, эта модель обеспечивает картину клеток способности вторгнуться и избежать основной орган, войти и выжить в кровеносной системе, и имплантата и расти в дополнительном сайте. Эта модель была эффективно использована для измерения метастатическогоответ на обеих изменений в экспрессии белка, а также ответ на небольшие терапевтических молекул, в течение короткого времени оборота.

Introduction

Рак предстательной железы (РПЖ) является наиболее часто диагноз рака у мужчин, и второй по значимости причиной смерти от рака в Соединенных Штатах 1. Смерть от РПЖ не за счет образования первичной опухоли, а, скорее, формирование метастазов. Таким образом, предотвращение метастазирования у пациентов имеет большое значение. Мышиных моделях РПЖ предлагают разнообразие вариантов раскрыть важную биологическую информацию об этой болезни.

Разнообразие моделей мыши РПЖ существует, каждый с присущими преимущества и ограничения. В то время как частота РПЖ у людей высокая, естественным РПЖ крайне редко встречается у мышей 2, несмотря на равной восприимчивости мышей общего к раку 3. Один грызун исключением является развитие РПЖ в Lobund крыс Вистар, который может достигнуть темпов РПЖ 90% по 12-месячного возраста с помощью индукции метилнитрозомочевины и тестостерона 4. По этой причине, вызванной системы модели, такие как бродяга(Трансгенных аденокарциномы предстательной железы мыши) модели обычно используются. Бродяга модель может вызвать экспрессию трансгена специально в простате, и подвергается нормальное прогрессирование РПЖ, от гиперплазии до простатической интраэпителиальной неоплазии (ПИН) к лимфатической и легких метастазов 5-6. Эти модели обеспечивают преимущества быть в состоянии измерить полный спектр опухолевой прогрессии, а также содержат интактную иммунную систему. Однако молекулярные события, лежащие в основе развития РПЖ может отличаться от мышей и людей, и корреляции между мышами и клинических исследований человека показали изменчивость. Кроме того, обе эти модели занимают много времени, как пример модель TRAMP требуется около 28 недель с целью развития метастазов.

При изучении метастазы, часто хвост-вен или левого желудочка модель инъекции используется. Эта модель выгоды от быстрого время оборота, и может дополнительно измерять присутствие кости metastasявляется использованием специфических клеточных линий и условия. Ян и др.. Сообщили, что подкожное введение GFP-положительных клетках РС3 может вызвать широкое распространение костных метастазов 7, и хвостовую вену и intercardiac инъекции также породили развитие метастазов костей 8-9. Основные недостатки этих моделей связаны с отсутствием первичной опухоли, проживающего в самой предстательной железы. Кроме того, для модели полагается на инъекции раковых клеток в кровоток, это обходит весь первую половину метастатического каскада. Тем самым он исключает рассмотрение первоначальных шагов, включая вторжения через главный орган, которые биологически важные меры метастатическим трансформации. Многие регуляторы метастатическим преобразования непосредственно влияют раннее вторжение клеток. Ранние шаги в метастатического каскада составляют первоочередных площадок для терапевтического таргетинга, как когда-то раковые клетки распространять, клональная изменение значительно расширяет, тем самым увеличивая биологическиеаль разнообразие и уменьшения эффективного терапевтического таргетинг.

В попытке ответить на многие ограничения этих моделей, наша лаборатория разработала ортотопическую модель человеческого РПЖ, в котором человеческая клеточная линия РПЖ PC3-М непосредственно имплантированный в простату из линии BALB / C бестимусных мышей. После 4-6 недель, размер опухоли, наличие циркулирующих опухолевых клеток (CTCs), и метастазы в легких и лимфатических узлах могут быть количественно. Мы эффективно использовали эту модель для оценки эффективности 4 ',5,7-trihydroxyisoflavone (генистеина) ингибировать человеческую метастазов РПЖ 10. Диетические потребление генистеина была связана с уменьшается в метастазирования рака простаты и смерти 11-12, но ранее ни одно исследование не было установлено, может ли администрирование генистеина изменить РПЖ метастазы в животных или людей. В этом исследовании мы показали, что лечение с генистеина значительно снижается количество метастазов в легких. Кроме того, мы определили генистеина альпоступил на активацию и экспрессию нескольких важных про-метастатических белков в первичной опухоли, в том числе координационного адгезии киназы (FAK), р38 митоген-активированной протеинкиназы (р38 МАРК) и белка теплового шока 27 (Hsp27).

Эти результаты соответствовали наблюдений в клинике. Использование крови, полученных от мышей, мы смогли точно измерить концентрации в крови генистеина и наблюдается, чтобы они были похожи на уровнях у людей с обычной диетической потребления генистеина. Кроме того, исследование фазы II в исполнении нашей группы установлено, что при обработке генистеина, мужчины опытные уменьшается в простаты ткани экспрессии мРНК генов, связанных с сотовой инвазии и метастазирования, в частности, матрица металлопротеиназы 2 типа (ММП-2) 13.

Мы также использовали эту модель для оценки влияния измененной экспрессии гена-продукта в первичной опухоли на организм человека РПЖ метастазов 14. Suppr опухолиEssor эндоглин является членом надсемейства TGF-и подавляет РПЖ сотовой вторжение человека в пробирке с помощью изменения Smad сигнализации 15. Мы расширили эти исследования, чтобы определить влияние эндоглина на человека РПЖ метастазов. Стабильный эндоглин нокдаун, векторное управление или эндоглин по линиям экспрессии клеточных были имплантированы мышам. Эндоглин нокдаун клетки показали наибольшее количество метастазов в легких, а также ЦОК в 38% мышей. Мыши с имплантированным управления вектором показал средний ответ, с меньшим метастазов в легких на мышь, и ЦОК в только 18% мышей. Высокая эндоглин имплантированные мышам показали почти полное подавление метастазов в легких, а также полное подавление ЦОК.

Это всего лишь два примера широкого спектра приложений эта техника. Из лекарственных препаратов, к изменениям моделирования в молекулярной биологии, эта модель предлагает высокий метод пропускную способность оценки влияния различных функций на рост опухоли и мольизменения сосудистых, наличие ЦОК и формирование четкой метастазов в легких и лимфатических узлах.

Protocol

Для всех процедур, связанных с животными, протоколы были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета (IACUC) Северо-Западного университета в. Хирургические методы и условия по уходу за животными наблюдали ветеринарных работников и изменен, чтобы минимизировать стресс животных или смертности. Отдельные учреждения могут иметь различные требования, и важно работать с IACUC и животного персонала при разработке и выполнении этой хирургической техники. 1. Подготовка клеток для инъекций Этот шаг должен быть выполнен как можно ближе к запуску операции. Trypsinize клетки используются для эксперимента, снять с плиты, и нейтрализовать со средствами массовой информации. PC3-М клеток человека линии РПЖ стабильно трансфицированных GFP был успешно использован для этих экспериментов, в связи с быстрыми условиях роста клеток PC3-М. GFP был добавлен для дополнительного удобства обнаружения метастазов легких в образцах ткани легких и быстрого определенияраковые клетки по сравнению с иммунными клетками в культурах, полученных из крови и костного мозга для выявления циркулирующих опухолевых клеток. При изменении конкретного интересующего гена, то создание стабильных клеточных линий с этим геном изменения выполняется первым, а затем трансфекции GFP. Если GFP изменит функцию этого гена, представляющего интерес, GFP его можно опустить. Это сделает обнаружение метастазов в легких сложнее, но по-прежнему достижимы. Кроме того, при использовании конкретной технологии обработки изображений с использованием флуоресцентных маркеров, таких как люциферазы основе ИВИС, другие флуоресцентные белки могут быть использованы вместо. Центрифуга в течение 5 мин при 225 х г. Изолировать 2,5 х 10 5 клеток и центрифуги в течение 5 мин при 225 х г. Удалить супернатант и ресуспендируют клеток в 20 мкл стерильного физиологического раствора. Аспирируйте суспензии клеток в 0,5 мл шприц с постоянной 28 ½ G игла (рекомендуется: Кендалл Monojet, а другие бренды, вызвало вопросы), гарантируя, что ни воздух поступает иглы альОнг с подвеской. Оберните шприц в стерильной фольгой и хранить на льду до использования. 2. Ортотопическая Имплантация клеток предстательной железы человека Мужской 6-8 недельных BALB / C бестимусным мышей используются. Идеальная мышь массы тела в течение операции является 19-21 г, и мышей должно быть позволено расти, по крайней мере 18 г до операции. Меньшие животные являются технически более трудно работать на. Большие животные, как правило, испытывают более медленные кинетики роста опухоли и метастазов. Животные должны быть размещены в виварии по крайней мере за неделю до операции животных, чтобы минимизировать стресс. В зависимости от эксперимента, медикаментозное лечение может начаться за неделю до операции. Введите предварительно хирургии обезболивающее в соответствии с инструкциями животного Фонда. 0,1 мг / кг веса тела подкожно Buprenex с помощью иглы 30 G ½, прикрепленный к 1 мл шприц предлагается. Поместите животных в изофлурана камеры и ждать, пока животные не полностьюnesthetized. Нет ног рефлекс мышечного тонуса не должны присутствовать в этой точке. Этот метод рекомендуется, но если нет в наличии, другие методы обезболивания можно использовать в соответствии с инструкциями животного Фонда. Перемещение животное из изофлурана камеры в стерильный процедуры капотом. Поместите животное в конус аппарата носа, и вновь обеспечить, чтобы животное находится под полным обезболиванием, прежде чем приступить. Лечить нижнюю брюшную область с Betadine скраб с стерильных ватных шариков, протрите спиртом, и последний спрей с Betadine решения. Дайте высохнуть. Используя либо стерильным скальпелем или заостренные стерильные хирургические ножницы, низкий средней линии разреза брюшной полости около 3-4 мм выполнен. Аккуратно поднимите мочевого пузыря с помощью щипцов и определить вентральной доле простаты. Эти две лопасти расположены непосредственно под мочевым пузырем. Некоторые мыши будет иметь небольшой слой жира, покрывающую железу, которая может быть слегка отодвинулся в сторону, используя стерильный ватный тампон. Минимизацияе все движение органов и мускулатуры, если это возможно. Введите 20 мкл раствора объема клеток в предстательной железе, сводя к минимуму утечки и обеспечить наблюдается небольшой пузырек. Заменить мочевой пузырь и закрыть мышечного слоя с использованием 4,0 рассасывающиеся викрил мононити швов в простой прерванной узором. Закройте слой кожи с помощью стерильных 9 мм скрепок. Удалите животное от анестезии изофлюраном и контролировать до проснулся и движется нормально. Место на грелку во время восстановительного периода. Если несколько операций, которые исполнялись, между операций, чистых всех инструментов с 70% этанола, и стерилизовать с использованием стекла шарик стерилизатор. Разрешить инструменты ему полностью остыть до следующего животного. Не используйте повторно швов, ватные шарики, или стерильные тампоны. 3. Мониторинг Животные Администрирование обезболивающее на основе инструкций животного Фонда. 4 ч после операции управляющей одной дозы подкожной Мелоксикама на 1 мг / кг массы тела Uпеть иглу 30 ½ G, прикрепленную к 1 мл шприц предлагается, с последующим дополнительным дозы каждый 12-24 ч в течение следующих 48 часов. Скобы могут быть удалены из животных 7-10 дней после операции после того, как рана зажила. Вес монитора животных, потребление продуктов питания, а не ощупывать мышей при опухолях два раза в неделю до прекращения эксперимента. Увеличьте частоту до любой другой день, когда опухоли становятся видимыми для проверки животных, находящихся под значительным опухолевой или по принуждению. Ранняя смерть от этой модели из-за большого первичной опухолевой нагрузки, как первичные опухоли могут блокировать мочевого потока, так что любые животные с потерей более 15% массы тела или первичной опухоли, достигающей диаметр 1,5 см должны быть немедленно вскрывают предотвращения обструкции мочевыводящих путей и гибели животных. Монитор для необходимости для дополнительного обогащения окружающей среды животных. Стресс хирургии увеличивает животных распри. Добавление двух пластиковых хижинах в клетке вместо одного и дополнительного поведенияаль обогащение может уменьшить эти инциденты. Обсудить с ветеринарными вариантов по-английски, на объекте животные размещаются в. Учитывая отсутствие ресниц на этой линии мышей, хижины и обогащение из бумаги не рекомендуется, поскольку они могут вызвать раздражение глаз. 4. Некропсии Процедуры После 4-6 недель, опухоли полностью очевидно и животные начинают терять вес за счет увеличения бремени опухоли. Опухоли обычно можно пропальпировать и / или визуально очевидной. Вскрытие должно быть выполнено в этой точке. Выполните внутрибрюшинную инъекцию нембуталом при 260 мг / кг массы тела с помощью 30 ½ иглы, прикрепленный к 1 мл шприц, и позволяют животным, чтобы стать полностью без сознания, без ног рефлекса или мышечного тонуса настоящее время. После того, как животное анестезировали, с использованием стерильных хирургических ножниц или скальпель, которые нарезаются горизонтально поперек туловища животного непосредственно под грудной клеткой, то вертикально к подмышке вдоль стороны животного, Подвергать сердце. Выполнение терминала пункции сердца с помощью иглы 30 G ½, прикрепленный к 1 мл шприц продувают 4% цитрата натрия в DPBS для предотвращения коагуляции, получение столько, насколько это возможно крови от животного. Удалить легкие от животного, сокращая трахею с хирургическими ножницами или скальпелем и сразу поместить в кассету для культуры ткани и в 10% формалине. Удаление первичной опухоли предстательной железы у животного индивидуально резки любых кровеносные сосуды, прикрепленные к опухоли и не обеспечивает никаких дополнительных органы, такие как семяпровода или семенных пузырьков прилагаются. Запись вес и размер опухоли. Измеряют вес опухоли в граммах в лабораторном масштабе. Использование суппорты, измерить длину самого длинного диаметра опухоли в сантиметрах, и соответствующий перпендикулярную оси. Умножьте эти значения, чтобы получить размер опухоли. В зависимости от предполагаемого использования, немедленно оснастки замораживание в жидком азоте и / или места вна ткани кассеты в 10% формалине. Expose тазобедренный и коленный суставы с хирургическими ножницами или скальпелем, и отсоедините суставов ног, стараясь держать бедра нетронутыми. Извлеките бедра от животного и поместить в стерильном физиологическом растворе. Получить любые другие органы или материалов, представляющих интерес, и распоряжаться животного в соответствии с инструкциями института. В частности, региональные лимфатические узлы, как правило, метастазы, как правило, быть увеличена, если укрывает их, и могут быть собраны. Тем не менее, следует соблюдать осторожность, так как это может повлиять на изменения в гидростатического давления, вызванных хирургической процедуры. 5. Обработка и Иммуноокрашивание легочной ткани Образцы В 24-48 часов размещения ткани в 10% формалине в PBS, вставлять легкие в парафин. Раздел легкие в 45 мкм шагом секций, принимая 2-3 соседних участков легочной ткани 4 мкм. Если были использованы GFP-позитивных клеток (рекомендуется), выполните иммуноокрашиваниядля GFP. Если нет, выполните стандартный гематоксилином и эозином (H & E) окрашивание. ПРИМЕЧАНИЕ: Комплект Дако Envision + в сочетании с GFP антитела из Invitrogen успешно используется в соответствии с инструкциями изготовителя, но это может быть изменен, чтобы любой процедуры иммуногистохимии. Оценка метастазы слепым. Если GFP-положительных, опухолевые клетки будет пятно коричневого в дополнение к большим и отличительные ядра. Когда первый опасный метастаз, обратитесь патологоанатома, чтобы обеспечить правильное счет, и использовать H & E окрашенных легочной ткани, чтобы подтвердить наличие опухолевых клеток, а не проникают иммунные клетки. 6. Идентификация циркулирующих опухолевых клеток от крови и костного мозга Добавить все пробы крови, взятой из аутопсии в 1,5 мл центрифужную пробирку. Центрифуга 5 мин при 800 х г. Снимите плазмы и добавить 1 мл ACK лизиса (154.95 мМ хлорид аммония, 9,99 мМ калия BicarboНейт, 0,0995 мМ ЭДТА,). Дайте крови сидеть при комнатной температуре 3-5 мин. Центрифуга 5 мин при 800 х г. Удалить супернатант и добавить 1 мл среды для культивирования клеток, содержащей антибиотики. Добавить клеток к T75 колбу, содержащую 9 мл клеточной культуры. Культура клеток при 37 ° С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% СО 2 в течение 10 дней, проверка на наличие циркулирующих опухолевых клеток каждые 2-3 дня. Для костного мозга, удалить все мышечные ткани от бедренных костей с использованием ножницы, лезвие или скальпель. Удалить концы кости, как можно ближе к концам насколько это возможно. С помощью иглы 23 G ¾, осторожно извлечь костный мозг из бедренной кости в 1,5 мл центрифужную пробирку. Добавить в 1 мл клеточной культуральной среды и осторожно пипеткой хорошо перемешать. Добавить клеток к T75 колбу, содержащую 9 мл клеточной культуры. 7. Молекулярная характеристика опухолей Для полимеразной цепной реакции (ПЦР)с, образцы опухолей, которые были быстро замораживали в жидком азоте сначала измельчают в сухом льду и затем гомогенизируют с использованием гомогенизатора тканей в течение 3-5 мин с 1 мл TRIzol. TRIzol добыча осуществляется в соответствии с инструкциями изготовителя. Очищают РНК с использованием набора изоляции RNeasy РНК в соответствии с инструкциями изготовителя. Выполнение синтеза кДНК и количественный ПЦР в реальном времени (Qrt / ПЦР) с использованием TaqMan реагенты в соответствии с инструкциями изготовителя рекомендуется, но может быть изменен для любого метода ПЦР в настоящее время работают. Для Вестерн-блот анализов, гомогенизации тканей с использованием гомогенизатора тканей в течение 3-5 мин с 1 мл лизирующего буфера: PBS (137 мМ NaCl, 10 мМ Na-фосфат, 2,7 мМ KCl), 0,5% Тритон Х-100, 1 мМ ЭДТА, 2,5 мМ пирофосфата натрия, 1 мМ β-глицерофосфата, с добавлением коктейль ингибиторов протеаз, ингибитор фосфатных коктейлей 2 и 3, 10 мМ фторида натрия и 1 мМ ортованадат натрия. Клеточный лизат смесь помещают в 1,5 мл центрифужную пробирку. Центrifuge клеточный лизат смесь в течение 10 мин при 13000 х г. Удалить супернатант и место в новой 1,5 мл центрифужную пробирку и центрифугировали в течение 10 мин при 13000 х г. Если остатки клеток по-прежнему присутствует, дополнительный шаг центрифугирования может быть выполнена. Удалить супернатант и выполнить Вестерн-блот согласно обычных лабораторных условиях.

Representative Results

В этом эксперименте показано, репрезентативную группу мышей, полученных в ходе этих хирургических процедур. Пять мышам имплантировали GFP-положительных PC3-M клетки, содержащие вектор управления. Опухоли давали расти в течение шести недель, а затем несколько параметров были оценены. В фиг.1А и 1В, то показывают изменение массы тела и потребление пищи у мышей, соответственно. Существует небольшой провал в массы тела и потребления пищи вокруг даты операция в связи с анестезией. В ходе эксперимента, вес тела медленно увеличивается после операции, а затем начинает снижаться к концу эксперимента опухоль как нагрузка достигает критического уровня. Это будет сопровождаться потребления пищи у этих мышей. В фиг.2А и 2В, представительства размеры опухолей представлены полученные. Индивидуальные размеры опухоли варьироваться, но в среднем мы достигаем опухоли примерно 1 грамм, снормальный дисперсия между 0,5-1,5 г, а размер опухоли 1 см 2, с нормальной дисперсии 0,5-1,5 см 2. Хотя размер опухолей меняется, они не коррелируют с количеством полученного метастаз, показанного как в данной работе, и наши ранее опубликованных работ 10. Тем не менее, от этой модели, можно определить влияние лекарственной терапии или молекулярных изменений на вес и размер опухоли. Важным моментом в этой модели, когда соответствующее конечной точки для эксперимента. На рисунках 2В и 2Г, мы покажем изменения в весе и размера опухоли опухоли в одной конкретной линии PC3-М клеток стабильно трансфицированной GFP и вектора управления на 4 недели и через 6 недель. В течение последних двух недель, средний вес опухоли увеличился в 2,7 раза, а размер опухоли в 1,9 раза. Это показывает, что добавление 1-2 дополнительных недель эксперимента может значительно влиять на результаты. Как множество факторов может изменить рост опухолей, в том числевозраст и размер мышей, количество проходов клеток и т.д. мы не рекомендуем ее прекращения экспериментов пока видимых опухолей не наблюдается в большинстве мышей. На фиг.3А-3C, количество метастазов количественно тремя различными способами. На фиг.3А, общее количество GFP-положительных клеток человека РПЖ представлены. В фигуре 3В, число клеток локусов, или местах, где метастатических депозиты присутствуют, показано. Наконец, на фиг.3С, число различных метастазов, как определено четко связанного группы клеток, показывающий 5 или более GFP-положительных клеток человека СПС, отображается. Репрезентативные фотографии этих различных условиях показаны на фиг.4А-4D. В рисунке 4A, отдельная клетка в 40-кратном величине подсвечивается со стрелкой. Обратите внимание на коричневую окраску и большие отдельные ядра. Рядом раздел легких окрашивали H & E окрашиваниепоказано на фиг.4В, подтверждая, что без GFP, обнаружение раковых клеток по-прежнему легко достижимо. Это фото берется в 40-кратном величине и клетка подсвечивается со стрелкой. В фиг.4С, несколько локусов различной количества клеток в 10-кратным величине отображаются и каждый локус выделены стрелкой. . Наконец, на рисунке 4D, метастатическим депозит 10 клеток показано. Как влиять на эти методы данные показали различий в мышь 1 и 3 мыши. Мышь 1 имеет меньшее количество общего числа клеток в легких, в среднем 21,5 клеток на секции легких, по сравнению с Mouse 3, который имеет в среднем 700 клеток на секции легких. Тем не менее, мышь 3 имеет меньше локусов, или в местах, где клетки присутствуют, чем мыши 1. Мышь 3 имеет относительно небольшое число сайтов метастазов, но количество клеток на единицу площади очень высока в 82 клеток на локусов из-за нескольких очень большое количество клеток метастазов. В противоположность этому, мышь 1 имеет больше уникальную локусы, но значительно еEwer клеток на месте в только в среднем два клеток на месте. Эти различные параметры могут пролить свет на кинетики клеток оборотом в легкие и их способности начинают расти и размножаться. Кроме того, на рисунке 3D, мы покажем изменения в общих метастатических клеток на легких у мышей вскрывали в четыре по сравнению с шести недель. Как описано в цифрах 2В и 2Г, значительные изменения наблюдаются в весе и размере опухоли в последних двух недель эксперимента. Это воспроизводятся на рисунке 3D. Мыши вскрывали через четыре недели не показали метастатического развития, в то время как мыши, в 6 недель показали метастатических клеток у всех мышей оценивали. Это еще раз демонстрирует важность обеспечения мышей Вскрытие выполняются на поздней стадии конечной точке для обеспечения формирование метастазов произошло. Дополнительным измерения в этой модели является молекулярные изменения, происходящие внутри первичная опухоль. На фиг.5А-5C показано, три Пример Qrt / PCR экспериментов измерения три гена, представляющие интерес в метастатической прогрессии, матриксной металлопротеиназы 2 типа (ММП-2), матриксной металлопротеиназы 9 Тип (MMP-9), а белок теплового шока 27 (HSP27) соответственно. Любой интерес ген измеряется с помощью Qrt / ПЦР могут быть обнаружены с помощью этой техники. Кроме того, уровни белка может быть определена количественно с использованием вестерн-блоттинга процедуры. Рисунок 1. Наблюдаемое вес тела и потребление пищи у животных. AB) Масса тела в граммах или среднее потребление пищи на мышь в день в граммах, записывается в течение всего эксперимента и показано в позиции А) и В) соответственно. fig2highres.jpg "Первоначально" / files/ftp_upload/50873/50873fig2.jpg "/> Рисунок 2. Размер опухоли и вес опухоли в частных лиц и групп мышей. AB) Опухоль вес в граммах и размера опухоли в сантиметрах квадратов из пяти репрезентативных контрольных мышей, а средний из пяти мышей в конце шести недель показаны в а) и б) соответственно. CD) Сравнение веса опухоли в граммах и размер опухоли в сантиметрах квадратов между группами мышей вскрывали в четыре и шесть недель. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок . Рисунок 3. Метастазирования в частных лиц и группы мышей. AC) Средняя метастатическим spreaд в разделе легких в течение пяти отдельных мышей и в среднем из пяти мышей в конце шести недель, представленных либо как общего числа клеток (A), расположения метастатических клеток (B), или отдельной метастазов, как это определено 5 + клеток в четко определены кластера (С). D) Сравнение среднего числа метастатических клеток в группе легких на мышь между мышей вскрывали в четыре и шесть недель. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок . Рисунок 4. Представитель изображения легочных метастазов. А) Индивидуальный GFP положительные легкого при 40-кратном цели будет выделено из лука. B) рядом легкихраздел из А), показано в одной камере под H & E окрашивания. С) Одна часть легких в 10 раз Цель с семь отдельных локусов, содержащей различные количества клеток. D) один отдельный метастазирование при 10x цели, содержащей 10 раковые клетки четко определенных как одна группа. Рисунок 5. PCR анализ трех метастатических интересующих генов. Qrt / ПЦР проводили в отдельных образцах опухолей, полученных от мышей в возрасте шести недель. Относительные уровни мРНК Стенограмма ММР-2 (А), ММП-9 (В), и HSP27 (С) измеряются, нормированная на GAPDH. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Discussion

В этой статье мы предлагаем новый мышиной модели человеческого рака предстательной железы метастазов. В этой модели, человеческий РПЖ клеточные линии PC3-M ортотопически имплантирован непосредственно в предстательную железу линии BALB / C бестимусных мышей и опухолей позволило разработать в течение 4-6 недель. В результатах раздела представительства, мы показываем примеры данных, которые можно собрать, в том числе веса мыши и потребления продуктов питания, размера опухоли и веса, молекулярных характеристик опухоли, и формирование отдельного метастазами в легких. Кроме того, большое разнообразие дополнительных выходов могут быть изучены в зависимости от конкретных исследовательских интересов. Одним из примеров является наличие ЦОК в крови и костном мозге. Как ЦОК являются относительно редким событием (мы наблюдаем CTCs примерно 5-20% от контрольных животных), мы не были удивлены, что ни один из пяти мышей в этих экспериментах не разработаны CTCs. Наша лаборатория также использовали эту модель для определения изменений в клеточной адгезии путем измерения морфологии ядерной клеток впростаты ткани 10. Мы также использовали эту модель для оценки первичной пролиферации опухоли и апоптоз статус помощью Ki67 и TUNEL окрашивание опухоли простаты 14.

В дополнение к широким спектром информационных выходов, которые можно получить, эта модель может быть использована для определения влияния обоих изменений в экспрессии белка, а также малых терапевтических молекул. По сравнению со многими спонтанных и индуцированных моделей человеческого РПЖ метастазов, существует более высокая оборотное время только из 4-6 недель. Другие модели с высоким сроки выполнения работ, такие как хвостовую вену или intercardiac моделей инъекций, имеют ограничения не первичной опухоли, таким образом, не в полной мере Резюмируя клиники метастатического каскада. В нашей модели, опухолевые клетки должны избежать основной сайт происхождения, введите и выжить кровеносную систему, и имплантировать в дополнительном сайте. Это обеспечивает дополнительные шаги, на которых терапевтическое вмешательство или изменение в экспрессии белка может доставить эффект. Аддиtionally, наличие первичной опухоли должны обеспечивать легкость в применении этой модели на новые технологии визуализации, таких как люциферазы основе IVIS 16-17.

Несмотря на широкий спектр преимуществ этой модели, есть также несколько ограничений, которые следует учитывать. Все большее число исследований показывают важность иммунной системы в микросреды опухоли и развития метастазов 18. В этой модели, в связи с использованием в бестимусным грызуна, способность оценить эффекты иммунной системы не представляется возможным. Второе ограничение является отсутствие андрогенов отзывчивость в PC3-M клеток. По первоначальной диагностики РПЖ, пациенты часто будут проходить андрогенов терапии в качестве терапии первой линии. Однако, пациенты в конечном итоге станет андроген-стойкие и опухоли начнут расти снова. Как PC3-M клетки лишены рецепторов андрогенов, эта модель измеряет только эффекты лекарственной терапии или модуляции белка на пост-андрогенов устойчивы сancer. Хотя это ограничение, андроген-чувствительных РПЖ в настоящее время хорошо управляемым и имеет целый ряд эффективных методов лечения, и, таким образом андрогенов устойчивостью рак стал более заметно изучены. Эта модель также специально использует врожденный штамм мышей, которая минимизирует мышь к изменчивости мыши. Тем не менее, этот штамм может быть особенно реагировать на конкретных белков или малых молекул, таким образом, следует позаботиться при экстраполяции этих данных в клинику.

Хотя эта модель обеспечивает эффективное измерение эффективности препарата в быстром времени оборота 4-6 недель, это может не принимать во внимание долгосрочные наркотиков дозирования эффекты. После длительного воздействия многих имеющихся в настоящее время методов лечения, пациенты могут вернуться с лекарственно-устойчивых видов рака много лет после лечения. Быстрый поворот этой методики не обеспечивают эффективного моделирования способности опухоли, чтобы стать устойчивым к обработке. Тем не менее, с модуляцией этом эксэксперимент, лечение устойчивостью человека клетки рака простаты могут быть имплантированы, и эффективность второго поколения терапевтических в предотвращении РПЖ рост опухоли и метастазирование могут быть смоделированы. Кроме того, если группа пыталась изучить молекулярные изменения в первичной опухоли с течением времени, в долгосрочной перспективе модель таких как модель TRAMP, вероятно, будет более эффективным для этих исследований.

Другим ограничением этой модели является распространение отдельной метастазов только в лимфатические узлы и легкие животных. Оба из этих сайтов являются частые и клинически значимых сайтов метастазов, о чем свидетельствует человека теплых аутопсии 19. Однако клинически костных метастазов составляет заметную особенность человеческого РПЖ, и, таким образом модели Резюмируя этот представляют интерес. К сожалению, это трудно резюмировать в мышиной модели, с очень немногими моделей, показывающих костных метастазов без хвостовой вены, intercardial инъекции, или прямой имплантации вдо костей 20. Таким образом, если ориентации на кости имеет ключевое экспериментальной значение, другая модель может быть более эффективным. Тем не менее, эта модель действительно обеспечивает некоторую меру трафика до костей в виде костного мозга циркулирующих опухолевых клеток.

Несмотря на эти ограничения, этот метод является мощным модель человеческого РПЖ. Возможность измерения эффектов как на первичной опухоли, а также метастатического образования в течение короткого времени оборота предоставляет широкий спектр приложений. В этой модели, клетки должны бежать первичный орган, ввести и выжить в кровотоке, и имплантат в дополнительном сайте обобщал процесс в организме человека. Дополнительное измерение молекулярных характеристик первичной опухоли, изменения в морфологии клеток и наличие циркулирующих опухолевых клеток предоставляет широкий дыхание информации от одной модели. Эта процедура может быть использована как в контексте новых лекарств, а также для изучения изменений в биологии опухоли.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана грантами от Национальных Институтов Здоровья (NIH) в РКБ, CA122985 и простаты SPORE CA90386 и СПМ, NIH T32 AG000260 "Drug Discovery подготовке специалистов в области возрастных заболеваний", и со стороны Вальтера С. и Lucienne Driskill Высшее Программа в области естественных наук Северо-Западного университета. Мы также хотели бы поблагодарить Mouse Фенотипирование и гистологическая лаборатория и патологии основной комплекс в Северо-западном университете.

Materials

Equipment
1 ml Syringe, Tuberculin, Slip-Tip Becton Dickinson 309659
23 G 3/4 Precison Glide Needle Becton Dickinson 305143
30 G 1/2 Precision Glide Needle Becton Dickinson 305106
Alcohol Wipes Triad 10-3001
Autoclip Applier, 9mm, Stainless Steel Becton Dickinson 427630
Clips, 9mm VWR 15431-673
Convertors Polyline Towel (Sterile) Cardinal Health 3520
Cotton-Tipped Applicators, 6 inch, Sterile, Wooden Shaft Fisher 23-400-125
Curad Sterile Cotton Balls VWR 500043-544
Derf Needle Holder, Integra Miltex, 121 mm (4 3/4″) VWR 95039-192
Duraprene SMT Sterile Neoprene Powder-Free Surgical Gloves Cardinal Health 2D72PN70
Germinator 500 Cell Point Scientific SN 7030
Kendall Monojet Needles, 1/2 cc syringe with permanent 28 G 1/2 needle Tyco 1180528012
Medium Heating Pad VWR 100229-094
Merit Iris Scissors, Sklar, 11.4 cm (4 1/2″) VWR 94000-000
Metric/English Vernier Caliper VWR 19155-057
PDS*11 Violet Monofilament Sutcher 4-0, 27″ Ethicon Z304H
VetEquip Inhalation Anesthesia System Contact Your Animal Facility for Availability
VWR Premium Tissue Cassettes VWR 18000-010
VWR Specimen Forceps, Serrated, Straight, 114 mm (4 1/2″) VWR 82027-440
Reagents
Betadine Surgical Scrub Fisher Healthcare 19-027132
Buprenex Controlled Substance – Obtain from Animal Facility
Dako DAB + Chromagen Dako K3468
Dako Envision + System HRP-Labeled Polymer, Anti-Rabbit Dako K4003
Dako Envision Kit Protein Block Dako X0909
Formalin VWR 95042-908
GFP Antibody Invitrogen A11122
Hematoxylin Mayer MH580-2.5L
Meloxican Obtain from Animal Facility
Nembutal Controlled Substance – Obtain from Animal Facility
Rneasy RNA Isolation Kit Qiagen 74104
Sterile Saline Obtain from Animal Facility
Taqman Reverse Transcription Reagents Life Technologies N8080234
TaqMan Universal PCR Master Mix Life Technologies 4304437
Trizol Invitrogen 10296
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jemal, A., et al. Global cancer statistics. CA Cancer J Clin. 61, 69-90 (2011).
  2. Shappell, S. B., et al. Prostate pathology of genetically engineered mice: definitions and classification. The consensus report from the Bar Harbor meeting of the Mouse Models of Human Cancer Consortium Prostate Pathology Committee. Cancer Res. 64, 2270-2305 (2004).
  3. Rangarajan, A., Weinberg, R. A. Opinion: Comparative biology of mouse versus human cells: modelling human cancer in mice. Nat. Rev. Cancer. 3, 952-959 (2003).
  4. Pollard, M. Lobund-Wistar rat model of prostate cancer in man. Prostate. 37, 1-4 (1998).
  5. Gingrich, J. R., et al. Androgen-independent prostate cancer progression in the TRAMP model. Cancer Res. 57, 4687-4691 (1997).
  6. Gingrich, J. R., et al. Metastatic prostate cancer in a transgenic mouse. Cancer Res. 56, 4096-4102 (1996).
  7. Yang, M., et al. A fluorescent orthotopic bone metastasis model of human prostate cancer. Cancer Res. 59, 781-786 (1999).
  8. Wu, T. T., et al. Establishing human prostate cancer cell xenografts in bone: induction of osteoblastic reaction by prostate-specific antigen-producing tumors in athymic and SCID/bg mice using LNCaP and lineage-derived metastatic sublines. Int. J. Cancer. 77, 887-894 (1998).
  9. Dolman, C. S., et al. Suppression of human prostate carcinoma metastases in severe combined immunodeficient mice by interleukin 2 immunocytokine therapy. Clin. Cancer Res. 4, 2551-2557 (1998).
  10. Lakshman, M., et al. Dietary genistein inhibits metastasis of human prostate cancer in mice. Cancer Res. 68, 2024-2032 (2008).
  11. Messina, M. J., Persky, V., Setchell, K. D., Barnes, S. Soy intake and cancer risk: a review of the in vitro and in vivo data. Nutr. Cancer. 21, 113-131 (1080).
  12. Adlercreutz, H., Markkanen, H., Watanabe, S. Plasma concentrations of phyto-oestrogens in Japanese men. Lancet. 342, 1209-1210 (1993).
  13. Xu, L., et al. MEK4 function, genistein treatment, and invasion of human prostate cancer cells. J. Natl. Cancer Inst. 101, 1141-1155 (2009).
  14. Lakshman, M., et al. Endoglin suppresses human prostate cancer metastasis. Clin. Exp. Metastasis. 28, 39-53 (2011).
  15. Craft, C. S., Romero, D., Vary, C. P., Bergan, R. C. Endoglin inhibits prostate cancer motility via activation of the ALK2-Smad1 pathway. Oncogene. 26, 7240-7250 (2007).
  16. Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. J. Vis. Exp. , e1210 (2009).
  17. Cordero, A. B., Kwon, Y., Hua, X., Godwin, A. K. In vivo imaging and therapeutic treatments in an orthotopic mouse model of ovarian cancer. J. Vis. Exp. , e2125 (2010).
  18. Buijs, J. T., vander Pluijm, G. Osteotropic cancers: from primary tumor to bone. Cancer Lett. 273, 177-193 (2009).
  19. Rubin, M. A., et al. Rapid (“warm”) autopsy study for procurement of metastatic prostate cancer. Clin. Cancer Res. 6, 1038-1045 (2000).
  20. Singh, A. S., Figg, W. D. In vivo models of prostate cancer metastasis to bone. J. Urol. 174, 820-826 (2005).

Tags

Prostate CancerOrthotopic ModelMetastasisPreclinical ModelCirculating Tumor CellsLung MetastasisTherapeutic Response

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Pavese, J., Ogden, I. M., Bergan, R. C. An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis. J. Vis. Exp. (79), e50873, doi:10.3791/50873 (2013).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image