Um modelo experimental para estudar a Tuberculose-Malária Coinfection sobre Transmissão Natural de Mycobacterium tuberculosis E Plasmodium berghei</i
Summary
Tuberculose e malária são duas das infecções mais prevalentes em seres humanos e as principais causas de morbidade e mortalidade em populações empobrecidas nos trópicos. Nós estabelecemos um sistema de modelo experimental para estudar resultado de malária tuberculose co-infecção em camundongos após o desafio com ambos os patógenos através de sua rota natural de infecção.
Abstract
Co-infecções ocorrem naturalmente devido à sobreposição geográfica dos diferentes tipos de organismos patogênicos. Infecções simultâneas provavelmente modulam a respectiva resposta imune a cada único patógeno e afectar, assim, patogênese e evolução da doença. Pacientes co-infectados também podem responder diferencialmente a intervenções anti-infecciosos. A co-infecção entre a tuberculose como causada por micobactérias e do parasita da malária Plasmodium, sendo que ambos são coendemic em muitas partes da África Subsaariana, não foi estudada em detalhe. A fim de abordar o desafio, mas cientificamente e clinicamente questão de grande relevância como a imunidade do hospedeiro malária tuberculose coinfecção modular eo curso de cada doença, estabelecemos um modelo experimental do rato, que nos permite dissecar as respostas imunes desencadeados para ambos os patógenos no hospedeiro co-infectados . De notar que, a fim de a maioria das infecções humanas naturalmente adquiridos precisamente imitar, realizamos experimentalinfecções de camundongos com ambos os patógenos por suas rotas naturais de infecção, ou seja, aerosol e picada de mosquito, respectivamente.
Introduction
As populações humanas são raramente exposta a apenas um agente patogénico. Especialmente em regiões com alta incidência de infecções, como a África sub-saariana, co-infecções representam um problema de saúde pública principal, mas altamente subestimada. A tuberculose ea malária são as infecções bacterianas e parasitárias mais prevalentes em seres humanos, respectivamente, e continuam a ser as principais causas de morbidade e mortalidade em populações empobrecidas nos trópicos. Apesar da grande sobreposição geográfica entre a tuberculose ea malária e ao grande número de indivíduos em risco de co-infecção, muito pouco se sabe sobre as interações entre as diversas e, muitas vezes contrariando os reguladores do sistema imunológico e efetores desencadeados simultaneamente contra os parasitas da malária e bacilo da tuberculose em indivíduos co-infectados.
Modelos de roedores de infecções mistas permitem caracterizar reações imunes diferenciais contra patógenos diferentes em um host, lançando assim a luz na influência mútuaências modulando patologia e evolução clínica da doença individual, o que também ajudará a identificar novas recomendações para tratamento e prevenção. Nós estabelecemos um modelo experimental do rato que nos permite investigar as ramificações causadas pela infecção concomitante com Mycobacterium tuberculosis (MTB) e as espécies de Plasmodium roedor dentro do mesmo host 1. É importante ressaltar que para emular infecções humanas naturalmente adquiridos, tanto quanto possível, o nosso modelo implementa as rotas naturais de infecção utilizadas por ambos os patógenos. A tuberculose é uma infecção no ar, o que, por conseguinte, se manifesta principalmente nos pulmões. O agente causal, Mtb é transmitida por pessoas com doença ativa por via aerossol quando expelir gotículas de aerossóis infecciosos durante tossir ou espirrar. Assim, a infecção por aerossol é o método de escolha para imitar a infecção natural. Geração de partículas transportadas pelo ar que contêm M. tuberculosis pode ser alcançada através da utilizaçãode um sistema de exposição por inalação. Esta câmara de exposição do corpo inteiro permite expor animais experimentais para Mtb contendo gotículas de aerossóis infecciosos (Figura 1), que se inalada para os alvéolos dos pulmões onde a infecção é iniciada 2.
A malária, por outro lado é uma doença transmitida por vetor causada pelo protozoário, apicomplexan parasita Plasmodium, que é transmitido naturalmente pela picada de um mosquito Anofelíneos feminino. Durante a farinha de sangue, esporozoitos infecciosos são depositados sob a pele de acolhimento e subsequentemente atingir o fígado através da corrente sanguínea. Dentro de hepatócitos eles desenvolvem e se multiplicam rapidamente em esquizontes fígado em estágio. Eventualmente, esquizontes maduros rompem e libertam milhares de patogénicos merozóitos de primeira geração para a corrente sanguínea, onde eles iniciam um ciclo progressivo de invasão de glóbulos vermelhos, a replicação, a ruptura dos glóbulos vermelhos, e re-invasão 3. O ciclo de vida do Plasmodium continues como alguns merozoites evoluir para os estágios parasitários sexuais, os gametócitos masculinos e femininos, que podem ser ocupados por mosquitos durante as refeições de sangue. No mosquito, esporozoítos do Plasmodium desenvolver dentro de oocistos que residem no intestino médio do mosquito e, eventualmente, migram para as glândulas salivares para transmissão posterior em outro 3,4 host.
Enquanto em modelos animais experimentais da entrega de M. tuberculosis através do aerossol e rota assim mais relevante é muito comum, muitos estudos experimentais de infecção por Plasmodium de roedor, incluindo estudos sobre a malária-tuberculose coinfecção 5-7 foram efectuados através da infecção de ratinhos com eritrócitos parasitados, dando origem à infecção da malária do sangue em estágio, excluindo a fase de fígado em estágio clinicamente silenciosa. No entanto, a fase de fígado é um passo obrigatório durante a infecção e relevantes para a imunidade anti-plasmódio 8-11. Consideramos, portanto, importante para incluir o ph hepáticaase de transmissão e manutenção em estudos de ambos malária e malária tuberculose co-infecção, respectivamente malária. Além disso, tem sido demonstrado que os esporozoítos naturalmente transmissíveis são mais infeccioso do que os que foram transmitidos via infecções agulha 12, o que nos levou a estabelecer a infecção da malária pelo mosquito morder em vez de injetar isolado salivar das glândulas esporozoítos derivados. A única maneira de obter os mosquitos infecciosos para a transmissão natural de parasitas da malária é manter todo o ciclo de vida do parasita, tanto no hospedeiro vertebrado (aqui mouse) eo vetor mosquito. Assim, o acesso a um insetário para a manutenção do parasita é inevitável, a fim de realizar a transmissão natural, através da mordida.
Nosso protocolo aqui descrito foi desenvolvido para investigar como a co-infecção com Plasmodium esporozoítos impactos sobre a tuberculose crônica 1. Para fazê-lo, os ratinhos são infectados com M. aerossol tuberculose e 40 dias mais tarde, quando M. infecção por tuberculose atingiu a fase crônica, os ratos são expostos a mosquitos transmissores da malária infecciosa. O resultado de tanto da malária e da tuberculose nos animais co-infectados pode ser seguida monitorizando a parasitemia sanguínea e a carga bacteriana no tecido, respectivamente. Em nosso protocolo, vamos descrever em detalhes como para infectar ratos com ambos os patógenos através de sua rota de infecção natural e como confirmar transmissão de patógenos de sucesso. Em nossas mãos, a taxa de infecção comumente alcançada por ambas as infecções experimentais é 100%. Estes protocolos podem ser aplicados para estudar ambas as infecções separadamente ou, como fazemos, para modelar e estudar a co-infecção entre duas das doenças infecciosas humanas mais difíceis. Este modelo é aplicável a outras espécies de Mycobacterium e de roedores Plasmodium além dos descritos neste protocolo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nós descrevemos como ratos podem ser produtivamente infectados com Mtb e P. berghei através de suas rotas naturais de infecção. Nós aplicamos estabelecidos protocolos de infecção para estudar a tuberculose ou a malária experimental 13 12 e, recentemente adoptada-los a estudar a co-infecção entre Mtb e Plasmodium no modelo do rato 1.
Os passos mais críticos para infecções bem sucedidas são a transmissão de ambos os patógenos para os números desejados. Estoques de micobactérias não deve ser mais de 2 anos, porque eles vão perder a viabilidade ao longo do tempo, eo título originalmente determinado das ações provavelmente não será mais preciso. Como resultado, as doses de infecção seria muito menor do que o esperado. Por isso, os títulos de UFC de culturas de deve ser determinada a cada poucos meses. Igualmente importante é o cultivo padronizado e geração de estoques de Mtb em primeiro lugar. Condições de cultura, tais comomédio, suplementos, tempo e volume devem ser padronizados, a fim de poder comparar os dados de experimentos usando diferentes estoques de Mtb. Micobactérias tendem a aglutinar-se durante a cultura, por isso é importante para manter as condições de cultivo padronizado, as bactérias colheita na mesma fase de crescimento e ressuspender com freqüência durante alíquotas. Caso contrário, pode haver uma grande variação nos títulos de UFC e desfecho infecção.
A geração de lotes de mosquitos infectados de forma homogênea é mais um passo crítico. Uma vez que diferentes mosquitos se alimentam de cada ratinho individual, é importante que todos os mosquitos utilizados para um ensaio de infecção vêm do mesmo lote e que apenas os lotes em que mais de 90% dos mosquitos infectados são utilizados.
O actual modelo pode ser usado para dissecar as respostas imunes e modulações imunes num hospedeiro co-infectados por comparação com as respostas imunitárias nos hospedeiros infectados individuais. Podemos aplicar various metodologias como histologia, imuno-histoquímica, citometria de análise de populações de células do sistema imunológico, ou PCR e ELISA para detecção de citocinas e quimiocinas no tecido ou fluidos corporais de interesse bem estabelecidos. Deve notar-se, que tais modelos de ratos têm certas limitações. Considerando que a maioria das pessoas infectadas com M. tuberculosis vão desenvolver uma infecção latente, sem sinais de sintomas clínicos, os ratos desenvolvem uma doença crônica com patologia pulmonar progressiva. Ainda, ratinhos C57BL / 6 são relativamente resistentes a infecção por M. tuberculosis e não se desenvolvem os granulomas clássicos como observado em pacientes com tuberculose humana. Como resultado, as reações imunopatológicos no rato nem refletem a doença tuberculose humana latente nem ativo de forma adequada. Apesar da discrepância entre a doença latente e crônica no homem e rato, ratos têm sido amplamente utilizados para identificar e estudar os fatores do hospedeiro que controlam a infecção por M. tuberculosis e que são ferramentas valiosas e indispensáveis para investigarrespostas imunitárias em doenças infecciosas. Importante, a susceptibilidade à infecção por M. tuberculosis varia consideravelmente entre estirpes de ratos consanguíneos comumente utilizados e as estirpes mais sensíveis, tais como DBA ou C3H podem ser incluídas em estudos de co-e com somente uma infecção. Além disso, para além das espécies de agentes patogénicos aqui descritos, quaisquer outras espécies de Mycobacterium de interesse (por exemplo, isolados clínicos) poderia ser utilizado. Da mesma forma, enquanto um modelo único malária reproduz todos os aspectos da doença humana diferentes modelos de ratos que se assemelham muito diferentes aspectos da infecção da malária humana adquirida naturalmente. Por exemplo, P. berghei e P. ANKA yoelii YM/17XL são amplamente modelos de humano (induzida por P. falciparum) malária grave estudada, com P. berghei ANKA ser considerado um excelente modelo para cerebral humano Malari s 14,15. P. berghei NK65 é um excelente modelo para hyperparasitaemia e anemia malária aguda, e tem sido recentementedescrito como um modelo experimental para a síndrome associada à malária do desconforto respiratório agudo (SDRA MA-16). Utilizando o modelo de co-infecção descrito, podemos mostrar que recentemente concomitante P. infecção berghei NK65 agrava a tuberculose crônica 1.
Além de usar diferentes parasitas da malária de roedores, a ordem eo tempo dos eventos de infecção podem ser adaptadas de acordo com a questão de pesquisa subjacente. No campo, infecções Plasmodium concomitantes podem estar presentes na altura da infecção por M. tuberculosis ou adquirida posteriormente. Em ambos os cenários das respostas imunes a Mtb e Plasmodium podem ser afetados de forma diferente. Portanto, os ratinhos podem ser infectados com Plasmodium esporozoítos, quer antes ou depois da infecção por M. tuberculosis. Além disso, os ratos podem ser contestadas em diferentes momentos após a infecção Mtb para avaliar o impacto da resposta imune induzida por Plasmodium em aguda contra crônicatuberculose. É importante ressaltar que quando se escolhe um parasita da malária para estudar malária tuberculose co-infecção, deve-se estar ciente de que algumas estirpes de Plasmodium roedores causar doença aguda em certas linhagens de camundongos e sucumbir à infecção dentro de poucos dias ou semanas, enquanto Mtb causa crônica e infecções de longa duração em imunocompetentes ratinhos. Assim, o tempo de co-infecção é fundamental para evitar a morte prematura dos animais experimentais.
A modulação da imunidade do hospedeiro por infecção simultânea com várias espécies de patógenos ainda é mal-compreendido. Nosso modelo de co-infecção experimental fornece uma ferramenta poderosa para investigar Mycobacterium – interação Plasmodium com o sistema imunológico de uma série co-infectados e vai contribuir para a nossa compreensão como co-infecções podem afetar a patogênese, evolução da doença, a vacinação, imunodiagnóstico, e terapia.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer a Miriam Ester para reprodução do mosquito. Este trabalho foi apoiado por in-house financiamento do Centro de Pesquisa Borstel e juntou-se o financiamento pelo Infecção Leibniz Center.
Materials
| Buraton | Schülke | active ingredients: aldehyds (formaldehyde, glutaraldehyde, oxalaldehyde, ethyl hexanal) | |
| Middlebrook 7H9 | Sigma | M0178 | For Mtb broth cultures |
| Middlebrook 7H11 | BD Biosciences | 283810 | Agar medium for Mtb culture |
| Middlebrook OADC enrichment medium | BD Biosciences | 212240 | Add to 7H9 and 7H11 for Mtb culture |
| Staining Dish | Science Services | E62542-12 | |
| 24-Slide Holder w/Handle | Science Services | E62543-06 | |
| Giemsas Azur-Eosin-Methylene blue solution | Merck Millipore | 109204 | |
| Wright´s stain | Sigma | W0625 | |
| Inhalation Exposure System | Glas-Col | ||
| Nebulizer-Venturi | Glas-Col | ||
| Ice cream cups | Häagen-Dazs | Used as mosquito cages | |
| Metal-frame mosquito cages | BioQuip Products | 1450A |
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