نموذج تجريبي لدراسة الملاريا والسل عدوى مرافقة على انتقال الطبيعية السل المتفطرة و المتصورة berghei</i
Summary
والسل، والملاريا وهما من الإصابات الأكثر انتشارا في البشر والأسباب الرئيسية للمراضة والوفيات في السكان الفقراء في المناطق المدارية. أنشأنا نظام نموذج تجريبي لدراسة نتائج عدوى مرافقة الملاريا والسل في الفئران بعد التحدي مع كل مسببات الأمراض عبر الطريق الطبيعية للعدوى.
Abstract
Coinfections تحدث بشكل طبيعي بسبب التداخل الجغرافي للأنواع متميزة من الكائنات الحية المسببة للأمراض. العدوى المتزامنة على الأرجح تعدل الاستجابة المناعية منها إلى كل الممرض واحد، وبالتالي قد تؤثر المرضية ونتائج المرض. المرضى المصابون قد تستجيب بشكل مختلف أيضا للتدخلات المضادة للعدوى. لم يدرس عدوى مرافقة بين السل الناجم عن المتفطرات وطفيل الملاريا المتصورة، وكلاهما coendemic في أجزاء كثيرة من أفريقيا جنوب الصحراء الكبرى، بالتفصيل. من أجل الاقتراب من التحدي ولكن علميا وسريريا مسألة ذات أهمية كبيرة كيف عدوى مرافقة الملاريا السل تعدل الحصانة المضيفة وبالطبع من كل مرض، أنشأنا نموذجا الماوس التجريبية التي تسمح لنا لتشريح الاستجابات المناعية أثارت لكلا مسببات الأمراض في البلد المضيف المصابون . من المذكرة، من أجل تقليد الأكثر تحديدا الإصابات البشرية المكتسبة بشكل طبيعي، ونحن أداء التجريبيةالعدوى من الفئران مع كل مسببات الأمراض من خلال مساراتها الطبيعية للعدوى، أي الهباء الجوي ودغة البعوض، على التوالي.
Introduction
نادرا ما يتعرض البشر لالممرض واحد فقط. ولا سيما في المناطق التي يرتفع فيها عدد الإصابات مثل أفريقيا جنوب الصحراء الكبرى، coinfections تمثل مشكلة صحية عامة ولكن رئيس بالتقدير للغاية. والسل، والملاريا هي الالتهابات البكتيرية والطفيلية الأكثر انتشارا في البشر، على التوالي وما زالت الأسباب الرئيسية للمراضة والوفيات في السكان الفقراء في المناطق المدارية. على الرغم من تداخل جغرافي واسع بين السل والملاريا وعدد كبير من الأفراد المعرضين لخطر عدوى مرافقة، والقليل جدا هو المعروف عن التفاعلات بين مختلف وغالبا مواجهة المنظمين والمستجيبات المناعي أثارت في وقت واحد ضد طفيليات الملاريا والعصيات السلية في الأفراد المصابون.
نماذج القوارض من الإصابات المختلطة تسمح تميز الفرق التفاعلات المناعية ضد مسببات الأمراض متميزة في مضيف واحد، وبالتالي تسليط الضوء على influ المتبادلةبسبب الخلافات تحوير علم الأمراض والنتائج السريرية للمرض الفردية، والتي سوف تساعد أيضا على تحديد توصيات جديدة لعلاج والوقاية. أنشأنا نموذج الفأر التجريبية التي تمكننا من تحقيق في تداعيات الناجمة عن العدوى المتزامنة مع المتفطرة السلية (MTB) وأنواع القوارض المتصورة ضمن نفس المضيف 1. الأهم من ذلك، لمحاكاة الإصابات البشرية المكتسبة بشكل طبيعي قدر الإمكان، نموذجنا تنفذ الطرق الطبيعية للعدوى يستخدمها كل من مسببات الأمراض. السل هو عدوى المحمولة جوا، وبالتالي الذي يظهر أساسا في الرئتين. العامل المسبب، تبث MTB من قبل أشخاص يعانون من مرض نشطة عبر الطريق الهباء الجوي عندما طرد قطرات المعدية أثناء السعال أو العطس. وهكذا، والعدوى الهباء الجوي هو الأسلوب المفضل لتقليد العدوى الطبيعية. لا يمكن أن يتحقق جيل من الجسيمات العالقة في الهواء التي تحتوي على MTB عن طريق استخدامنظام التعرض للاستنشاق. هذا كله غرفة تعرض الجسم يسمح تعريض حيوانات التجارب لMTB التي تحتوي على قطرات المعدية (الشكل 1) والتي يتم استنشاقها إلى الحويصلات الهوائية في الرئتين حيث يبدأ المرض 2.
الملاريا من ناحية أخرى هي الأمراض المنقولة بالنواقل الناجمة عن الأوالي، apicomplexan طفيلي المتصورة التي تبث بشكل طبيعي عن طريق لدغة أنثى البعوض أنوفيلي. خلال وجبة الدم، تترسب sporozoites المعدية تحت الجلد وتصل في وقت لاحق المضيف الكبد عن طريق مجرى الدم. داخل خلايا الكبد أن تتطور وتتكاثر بسرعة في schizonts مرحلة الكبد. في نهاية المطاف، schizonts ناضجة تمزق والافراج عن الآلاف من الإمراض merozoites الجيل الأول في مجرى الدم حيث بدء دورة التدريجي للغزو الخلية الحمراء، والنسخ، وتمزق الخلايا الحمراء، والاجتياح 3. في دورة حياة المتصورة continUES لبعض merozoites تتطور إلى مراحل الطفيلي الجنسي، من الذكور والإناث gametocytes، والتي يمكن تناولها عن طريق البعوض خلال وجبات الدم. في البعوض، sporozoites المتصورة تطوير داخل بيض التوكسوبلازما المقيمين في المعي المتوسط البعوض ويهاجر في نهاية المطاف إلى الغدد اللعابية لإحالتها إلى 3،4 مضيف آخر.
بينما في النماذج الحيوانية التجريبية تسليم MTB عبر الأيروسول والطريق وبالتالي الأكثر أهمية هو شائع جدا، وقد أجريت العديد من الدراسات العدوى القوارض المتصورة بما في ذلك الدراسات التجريبية على عدوى مرافقة الملاريا السل 5-7 خارج عن طريق إصابة الفئران مع الكريات الحمراء مطفول، مما أدى لعدوى الملاريا مرحلة الدم مع استبعاد مرحلة مرحلة الكبد سريريا الصامتة. ومع ذلك، فإن المرحلة الكبد هو خطوة إلزامية خلال العدوى وذات الصلة لمكافحة الحصانة متصوري 8-11. لذا نعتبر أنه من المهم أن تشمل فتاه كبديبورصة عمان من انتقال الملاريا والصيانة في دراسات كل من الملاريا وعدوى مرافقة الملاريا السل، على التوالي. بالإضافة إلى ذلك، فقد تبين أن تنتقل بشكل طبيعي sporozoites هي أكثر من تلك المعدية التي تنتقل عن طريق العدوى إبرة 12، والتي دفعتنا إلى تأسيس عدوى الملاريا من قبل لدغة البعوض بدلا من حقن معزولة الغدة اللعابية sporozoites مشتقة. الطريقة الوحيدة للحصول على البعوض المعدية للانتقال الطبيعية من طفيليات الملاريا هو الحفاظ على دورة الحياة الكاملة للطفيل في كل من الفقاريات المضيف (هنا الماوس) والبعوض الناقل للمرض. وبالتالي، الوصول إلى معمل الحشرات للصيانة الطفيلي أمر لا مفر منه من أجل أداء الإرسال الطبيعية عن طريق لدغة.
وقد وضعت لدينا بروتوكول الموصوفة هنا لمعرفة كيف عدوى مرافقة مع المتصورة sporozoites التأثيرات على السل المزمن 1. للقيام بذلك، يصاب الفئران الهباء الجوي مع م. السل و4في وقت لاحق 0 يوم، عندما M. وصلت عدوى السل المرحلة المزمنة، ويتعرض الفئران لبعوض الملاريا المعدية. يمكن اتباعها نتائج كل من الملاريا والسل في الحيوانات المصابون من خلال رصد الطفيل في الدم والحمل البكتيري في الأنسجة، على التوالي. في بروتوكول لدينا، فإننا سوف تصف بالتفصيل كيفية تصيب الفئران مع كل مسببات الأمراض من طريق العدوى الطبيعية، وكيف لتأكيد انتقال الممرض ناجحة. في أيدينا، وحققت معدل الإصابة عادة لكلا الالتهابات التجريبية هو 100٪. ويمكن تطبيق هذه البروتوكولات لدراسة كل على حدة أو الالتهابات، كما نفعل، لنموذج ودراسة عدوى مرافقة بين اثنين من الأمراض المعدية الأكثر تحديا الإنسان. هذا النموذج ينطبق على الأنواع المتفطرة والقوارض المتصورة أخرى خارجة عن تلك الموصوفة في هذا البروتوكول.
Protocol
Representative Results
Discussion
وصفنا كيف الفئران يمكن أن يصاب مثمر مع المواضيع المتميزة وP. berghei عبر الطرق الطبيعية للعدوى. نطبق تأسيس بروتوكولات عدوى السل إلى دراسة تجريبية 13 أو 12 الملاريا والتي اعتمدت مؤخرا لدراسة لهم عدوى مرافقة بين المواضيع المتميزة والمتصورة في نموذج الفأر 1.
الخطوات الأكثر أهمية بالنسبة لالتهابات الناجحة هي انتقال مسببات الأمراض سواء على الأرقام المطلوبة. يجب أن لا تكون الأسهم المتفطرات مضى عليها أكثر من 2 سنوات لأنها سوف تفقد جدوى مع مرور الوقت، وسوف عيار مصممة أصلا للأسهم على الأرجح لن تكون دقيقة. ونتيجة لذلك، فإن الجرعات العدوى تكون أقل بكثير مما كان متوقعا. لذلك، ينبغي تحديد التتر كفو الثقافات الأسهم كل بضعة أشهر. نفس القدر من الأهمية هو زراعة موحدة وجيل من الأسهم المواضيع المتميزة في المقام الأول. ظروف مثل الثقافةالمتوسطة، وملاحق، والوقت، وحجم يجب أن تكون موحدة لكي تكون قادرا على مقارنة البيانات من التجارب باستخدام مخزونات مختلفة من المواضيع المتميزة. المتفطرات تميل إلى تتجمع خلال الثقافة، وبالتالي فإنه من المهم للحفاظ على ظروف ثقافة موحدة، والبكتيريا الحصاد في مرحلة النمو نفسه و resuspend في كثير من الأحيان خلال aliquoting. خلاف ذلك يمكن أن يكون هناك تباين واسع في التتر كفو ونتيجة العدوى.
توليد دفعات البعوض المصابة متجانس هو خطوة حاسمة أخرى. منذ البعوض المختلفة وتتغذى على كل فأر الفردية، من المهم أن جميع من البعوض تستخدم لعدوى التجربة واحدة تأتي من نفس الدفعة والتي تستخدم فقط تلك دفعات حيث يصاب أكثر من 90٪ من البعوض.
النموذج الحالي يمكن استخدامها لتشريح الاستجابات المناعية والتحويرات المناعي في مجموعة المصابون عن طريق مقارنتها إلى الاستجابات المناعية في المضيفين المصابة واحد. يمكننا تطبيق فامنهجيات rious زارة راسخة مثل الأنسجة، المناعية، تحليل الخلوي من السكان الخلايا المناعية، أو PCR وELISA للخلوى وكشف chemokine للأنسجة أو سوائل جسم من الفائدة. تجدر الإشارة إلى أن مثل هذه النماذج الماوس على قيود معينة. في حين أن الغالبية العظمى من المصابين MTB تطوير عدوى كامنة مع عدم وجود علامات لهذه الأعراض السريرية والفئران تطوير مرض مزمن مع التدريجي أمراض الرئة. لا يزال، C57BL / 6 الفئران هي مقاومة نسبيا للإصابة MTB ولا تطوير حبيبية الكلاسيكية كما لوحظ في مرضى السل الإنسان. ونتيجة لذلك، وردود الفعل immunopathological في الماوس لا تعكس ولا مرض السل الكامنة الإنسان ولا نشطة بشكل مناسب. على الرغم من التباين بين المرض الكامنة والمزمنة في الإنسان والفأر، وقد استخدمت على نطاق واسع الفئران لتحديد ودراسة العوامل المضيفة التي تتحكم العدوى المواضيع المتميزة وأدوات قيمة والتي لا غنى عنها للتحقيقالاستجابات المناعية في الأمراض المعدية. الأهم من ذلك، القابلية للإصابة MTB اختلافا كبيرا بين السلالات الفطرية الماوس استخداما وسلالات أكثر عرضة مثل DBA أو C3H يمكن تضمينها في الدراسات وشارك في العدوى واحد. علاوة على ذلك، وبصرف النظر عن الأنواع الممرض الموصوفة هنا، يمكن أن تستخدم أي نوع من الأنواع المتفطرة الأخرى ذات الاهتمام (على سبيل المثال العزلات السريرية). وبالمثل، في حين يعيد يوجد نموذج واحد الملاريا جميع جوانب المرض الإنسان نماذج الماوس مختلفة لا تشبه جوانب مختلفة من عدوى الملاريا البشرية المكتسبة بشكل طبيعي. على سبيل المثال، P. berghei أنكا وP. ودرس yoelii YM/17XL على نطاق واسع من النماذج البشرية (المتصورة المنجلية التي يسببها) الملاريا الحادة، مع P. berghei أنكا التي تعتبر نموذجا ممتازا للإنسان malari الدماغي و 14،15. P. berghei NK65 هو نموذج ممتاز لhyperparasitaemia وفقر الدم الحاد الملاريا، وقد تم مؤخراوصفها بأنها نموذج تجريبي لمتلازمة المرتبطة بالملاريا الحادة الضائقة التنفسية (MA-ARDS 16). باستخدام نموذج عدوى مرافقة وصفها، ويمكن أن تظهر في الآونة الأخيرة أن المتزامنة P. عدوى berghei NK65 تفاقم السل المزمن 1.
وبصرف النظر عن استخدام مختلف الطفيليات القوارض والملاريا، ويمكن تكييفها ترتيب وتوقيت الأحداث العدوى اعتمادا على سؤال البحث الأساسي. في هذا المجال، وقد تكون العدوى المصاحبة المتصورة في الوقت الحاضر من العدوى المكتسبة MTB أو في وقت لاحق. في كل من السيناريوهات قد تتأثر الاستجابات المناعية لMTB والمتصورة بشكل مختلف. وبالتالي، يمكن أن تصاب الفئران مع sporozoites المتصورة إما قبل أو بعد الإصابة MTB. علاوة على ذلك، يمكن الطعن الفئران في أوقات مختلفة إصابة آخر المواضيع المتميزة لتقييم أثر الاستجابة المناعية التي يسببها المتصورة على الحادة مقابل المزمنةالسل. الأهم من ذلك، عند اختيار طفيلي الملاريا لدراسة عدوى مرافقة الملاريا والسل، وينبغي للمرء أن يكون على علم بأن بعض سلالات الملاريا القوارض تسبب المرض الحاد في بعض سلالات الفئران والاستسلام للإصابة خلال أيام أو أسابيع فقط في حين MTB يسبب التهابات مزمنة وطويلة الأمد في مناعيا الفئران. وبالتالي، توقيت عدوى مرافقة أمر بالغ الأهمية من أجل تجنب الوفاة المبكرة من حيوانات التجارب.
يبقى التشكيل الحصانة المضيف عن طريق العدوى المتزامنة مع الأنواع الممرض متعددة غير مفهومة. توفر لدينا نموذج عدوى مرافقة التجريبية أداة قوية لتحقيق المتفطرة – التفاعل المتصورة مع الجهاز المناعي للمضيف المصابون وسوف تسهم في فهمنا كيف يمكن أن تؤثر coinfections المرضية، نتيجة المرض، والتطعيم، والمناعي، والعلاج.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر ميريام استر لتكاثر البعوض. وأيد هذا العمل عن طريق التمويل في المنزل من مركز أبحاث Borstel وانضم التمويل من قبل مركز العدوى لايبنتز.
Materials
| Buraton | Schülke | active ingredients: aldehyds (formaldehyde, glutaraldehyde, oxalaldehyde, ethyl hexanal) | |
| Middlebrook 7H9 | Sigma | M0178 | For Mtb broth cultures |
| Middlebrook 7H11 | BD Biosciences | 283810 | Agar medium for Mtb culture |
| Middlebrook OADC enrichment medium | BD Biosciences | 212240 | Add to 7H9 and 7H11 for Mtb culture |
| Staining Dish | Science Services | E62542-12 | |
| 24-Slide Holder w/Handle | Science Services | E62543-06 | |
| Giemsas Azur-Eosin-Methylene blue solution | Merck Millipore | 109204 | |
| Wright´s stain | Sigma | W0625 | |
| Inhalation Exposure System | Glas-Col | ||
| Nebulizer-Venturi | Glas-Col | ||
| Ice cream cups | Häagen-Dazs | Used as mosquito cages | |
| Metal-frame mosquito cages | BioQuip Products | 1450A |
References
- Mueller, A. -. K., et al. Natural Transmission of Plasmodium berghei Exacerbates Chronic Tuberculosis in an Experimental Co-Infection Model. PLoS ONE. 7, e48110 (2012).
- Korbel, D. S., Schneider, B. E., Schaible, U. E. Innate immunity in tuberculosis: myths and truth. Microbes Infect. 10, 995-1004 (2008).
- Aly, A. S., Vaughan, A. M., Kappe, S. H. Malaria parasite development in the mosquito and infection of the mammalian host. Annu. Rev. Microbiol. 63, 195-221 (2009).
- Cirimotich, C. M., Dong, Y., Garver, L. S., Sim, S., Dimopoulos, G. Mosquito immune defenses against Plasmodium infection. Dev. Compar. Immuno. 34, 387-395 (2010).
- Page, K. R., et al. Mycobacterium-induced potentiation of type 1 immune responses and protection against malaria are host specific. Infect. Immun. 73, 8369-8380 (2005).
- Hawkes, M., et al. Malaria exacerbates experimental mycobacterial infection in vitro and in vivo. Microbes Infect. 12, 864-874 (2010).
- Scott, C. P., Kumar, N., Bishai, W. R., Manabe, Y. C. Short report: modulation of Mycobacterium tuberculosis infection by Plasmodium in the murine model. Am. J. Trop. Med. Hyg. 70, 144-148 (2004).
- Hoffman, S. L., Doolan, D. L. Malaria vaccines-targeting infected hepatocytes. Nat. Med. 6, 1218-1219 (2000).
- Mueller, A. K., et al. Genetically attenuated Plasmodium berghei liver stages persist and elicit sterile protection primarily via CD8 T cells. Am. J. Pathol. 171, 107-115 (2007).
- Mueller, A. K., Labaied, M., Kappe, S. H., Matuschewski, K. Genetically modified Plasmodium parasites as a protective experimental malaria vaccine. Nature. 433, 164-167 (2005).
- Nussenzweig, R. S., Vanderberg, J., Most, H., Orton, C. Protective immunity produced by the injection of x-irradiated sporozoites of plasmodium berghei. Nature. 216, 160-162 (1967).
- Vaughan, J. A., Scheller, L. F., Wirtz, R. A., Azad, A. F. Infectivity of Plasmodium berghei sporozoites delivered by intravenous inoculation versus mosquito bite: implications for sporozoite vaccine trials. Infect. Immun. 67, 4285-4289 (1999).
- Coleman, J., Juhn, J., James, A. A. Dissection of midgut and salivary glands from Ae. aegypti mosquitoes. J. Vis. Exp. , e228 (2007).
- Franke-Fayard, B., et al. A Plasmodium berghei reference line that constitutively expresses GFP at a high level throughout the complete life cycle. Mol. Biochem. Parasitol. 137, 23-33 (2004).
- Lin, J. W., et al. Loss-of-function analyses defines vital and redundant functions of the Plasmodium rhomboid protease family. Mol. Microbiol. 88, 318-338 (2013).
- Bancroft, J. D. G., M, . Theory and Practice of Histological Techniques. , (2007).
- Schneider, B. E., et al. A role for IL-18 in protective immunity against Mycobacterium tuberculosis. Eur. J. Immunol. 40, 396-405 (2010).
- Craig, A. G., et al. The role of animal models for research on severe malaria. PLoS Pathog. 8, e1002401 (2012).
- de Souza, J. B., Hafalla, J. C., Riley, E. M., Couper, K. N. Cerebral malaria: why experimental murine models are required to understand the pathogenesis of disease. Parasitology. 137, 755-772 (2010).
- Van den Steen, P. E., et al. Immunopathology and dexamethasone therapy in a new model for malaria-associated acute respiratory distress syndrome. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 181, 957-968 (2010).
