自然送信時に結核マラリア重複感染を研究する実験モデル結核菌とマラリアベルゲイ</i

安全対策と倫理に関する声明ここに提示された研究は、ヒトの病原体マウンテンバイクやげっ歯類のマラリア原虫のPlasmodiumベルゲイ（P.ベルゲイ）で作業を伴う。 マウンテンバイク （菌H37Rv株）およびP.を用いた実験ベルゲイは、適切な生物学的安全性条件下で行われなければならない。バイオセーフティレベル（BSL）2の研究室は、Pとげっ歯類のマラリア原虫のために必要とされるここに記載されているすべての共感染の研究のため、したがってベルゲイとMTB用のBSL 3と、。注：マウンテンバイクに感染したマウスはすぐ近く内の他のマウスに（私たち自身の観察）感染を拡大しないでください。実験者への普及は、したがって、除外することができますが、適切な防護服は、すべての回で、BSL 3研究室の内側に着用する必要があります。私たちのルールによると、実験者は、外側の1がいつAの破棄された手術用スクラブ、ヘアネット、使い捨ての呼吸器、および手袋の2ペアを着用rms値は、キャビネットから引き出される。新しいものを再度キャビネットに入る前に置かれる。二つの容器、2％Buraton（注：のMtbを不活性化するために承認された他の消毒剤が承認濃度で使用することができる）を有する1つの液体および感染性廃棄物および表面汚染除去のための一方は、実験の前に調製され、キャビネット内に配置される。また、ビニール袋は、固体非感染性廃棄物のために使用される。ドイツのルールに従って、 マウンテンバイクから派生したマウンテンバイクの文化や組織の取り扱いや処理に関連するすべての作業はマウスがBSL3実験室の中にクラス2バイオセーフティキャビネット内で行わなければならない感染。マイコバクテリアの処理中に、対策が常にエアロゾルの生成を避けるために注意しなければならない。 6〜8週間の間熟成雌C57BL / 6マウス（Charles River）すべての共感染実験に使用し、BSL 3施設内の特定のバリア条件下で維持した。動物のケアと実験は、PEた農業、環境省の動物実験倫理委員会によって承認されたプロトコルに従ってrformedし、シュレースヴィヒ·ホルシュタイン州の農村マラリア蚊のステージを得るためには、NMRIマウスはチャールズリバー研究所、ズルツフェルト、ドイツから購入し、大学ハイデルベルクの動物施設（IBF）内の特定の病原体を含まない条件下で飼育。全ての動物実験は、欧州の規制に従って行われ、バーデン=ヴュルテンベルク（Regierungspräsidiumカールスルーエ）の州当局によって承認された。 1。グラス-COLエアゾールチャンバーを用いてマウンテンバイクによるマウスのエアロゾル感染 マウンテンバイクで実験動物のエアロゾル感染を標準化するための最良の方法は、既知のCFU力価を凍結ストックからマイコバクテリアを使用することです。ミドル7H9ブロスに保存培養、文化マウンテンバイクを準備するためにOADC（オレインを補っ酸、アルブミン、デキストロース、カタラーゼ）富化培地および0.05％のTween 80、マイコバクテリアのための炭素源と同時に、細菌の凝集を回避するために測定する。培養は、収穫時のOD≤1を持っている必要があります。より高いODでの、細菌の凝集が増加し、生存率が低下する。 -80℃で保存する1ミリリットルずつ0.5％グリセロール、1 g / Lのアスパラギンを補充した7H11寒天プレート上に3つの独立したバイアルの10倍希釈系列をメッキすることによって凍結ストック中の単位（CFU）を形成する生存コロニーの数、およびOADCを決定し、4後にコロニーを列挙する37℃でのインキュベーションの週以下に説明するように、エアロゾル感染を行う。 慎重に解凍マウンテンバイクの既知のCFU力価の株式や27 Gの針を取り付けた1ミリリットルの注射器を用いて細菌の塊を分散させるために、サスペンションを5回混ぜる。エアロゾルの生成を避けること。 希望の感染量に応じて、中にマイコバクテリア株の必要な量を転送滅菌PBSを含む50mlチューブ。最終容量を6 mlである。注：この懸濁液中の微生物の数を変えることにより、エアロゾル液滴を有する細菌の割合が変化する。私たちは通常、肺（低用量感染症）あたり100の生菌の取り込みを目指す。我々の経験では、これは5.5ミリリットルを噴霧しているそのうちの6ミリリットルの全容量で約1〜2×10 6マウンテンバイク/ ML（下記参照）が必要です。それはあなたの感染のための理想的な条件を見つけるために、細菌の異なる濃度の実験的なエアロゾル一連の課​​題を行うことをお勧めします。 5細菌のようないくつかが正常にエアロゾルによってマウスを感染させるために使用することができるように、最大​​5,000マイコバクテリアによる高用量の感染は、感染プロセスをスピードアップするために行うことができる一方。感染率は、一般的に100％である。 接種力価を決定するためにメッキする（必要な最終容量を超えて製造した）十分なボリュームを削除し、我々は通常、技術的な三連のプレートに500μLを削除します。 動物を所定の位置に区画メッシュバスケット（バスケットごとに1つのマウス）の円形エアロゾル室内およびエアロゾル室の蓋を閉じます。注：他のモデルは、20匹のマウスを収容することができ、それぞれが5個々の区画で構成パイ形のバスケットを装備している。 3ステンレス製の接続ソケットにベンチュリーネブライザユニットを取り付けます。 18 G鈍針が装着さ10ミリリットル注射器で50mlチューブからマイコバクテリア懸濁物を削除して、閉じた輸送箱にエアロゾル室に注射器を運ぶ。 ネブライザユニットのスクリューキャップを外し、慎重にネブライザーにマイコバクテリア懸濁物を注入する。エアロゾルの生成を避けること。 Buraton 2％鋭利物容器の中に注射器を廃棄する。スクリューキャップを噴霧器を密封する。 主電源スイッチとUVランプのスイッチをオンにします。コントロールキーパッドの表示が「グラス-COL装置株式会社」を示しています。 プログラムスイッチをオンにします。ディスプレイ意志ショーは「噴霧器の準備ができている？」「バスケットがセットされていますか？ "準備ができたらenterを押して"。 Enterキーを押して入力します。 ディスプレイに "予熱時間900を入力してください"示し、これは（排気を除染）焼却炉のための予熱時間は900秒であることを意味します。 Enterキーを押して入力します。 ディスプレイに "時間1800を噴霧入力してください」と表示されますが、これは、噴霧時間はデフォルトとして1800秒に設定されていることを意味します。噴霧時間を延長するためには、「2400」を入力し、Enterキーを押します。 NOTE：噴霧サイクル中、圧力下の空気がマイコバクテリアを含む小さなエアロゾル液滴を生成し、懸濁液を霧化する。主空気流と、これらの液滴（サイズが約2〜5μm）をエアロゾル室に搬入される。 ディスプレイには「CDタイム18​​00を入力してください」と表示されますが、これは崩壊サイクルが1800秒を取ることを意味します。 「2400」と入力し、Enterキーを押しますに設定します。注：このサイクルの間、雲がuで構築されている噴霧サイクル中のエアロゾル室におけるPが減衰することができます。小さな液滴は、実験動物に吸入される。 ディスプレイに「12月の時間900を入力してください」と表示されますが、これは紫外線除染サイクルは900秒かかることを意味します。 Enterキーを押して入力します。マシンは、予熱、噴霧、雲の崩壊とUV除染を巡回を開始します。 注意：前記サイクルが開始さを噴霧する際の圧縮エアフローメータ10立方フィート/時（チェックし、それに応じてエアコントロールバルブを調整する真空流計は、（必要に応じて真空制御弁を調整する予熱サイクルが開始したときにチェックする）60立方フィート/時間を示すべきである）。 サイクルが完了すると、キーパッドは「プロセスが完了 – 検体を削除」が表示されます。プログラム、UVおよび主電源スイッチをオフにします。 マイコバクテリア懸濁液が完全に噴霧していない場合は、慎重に装着し、適切な注射器で懸濁物を除去することによって、残りの容量を記録されていないか確認してください18 Gの鈍針。残りの容量を超える1ミリリットルであってはならない。 関節からネブライザを取り外し、2時間の最低2％Buratonを含む鍋に入れて、通常の消毒は、O / N行われますその後、新鮮なパンにネブライザーを転送し、水で十分に洗い流してください。空気乾燥、噴霧器を残す。 エアロゾル室を開いて、ケージに動物を返します。オートクレーブバッグやオートクレーブ内のバッグはバスケット。 安全上の理由から、動力付き空気清浄呼吸器には、この手順の間に着用する必要があります：2％Buraton注エアロゾル室内の表面を拭いてください。 7H11寒天プレート上の技術的な三連のプレート10倍希釈液（3×100μl）を（ステップ1.3参照）マイコバクテリア懸濁液の残りの500μLを使用した。 2。肺内の所望のCFUの取り込みを確認してください実験動物のエアロゾル感染後のある日は、細菌のLOを決定所望のCFUの取り込みを確認するために指定された対照動物の肺における広告。注：私達は通常、1日目のCFU決定のために3〜5匹のマウスの追加のグループを指定します。 時間をかけてのMtb感染の経過を監視するには、マイコバクテリア組織負担は、CFU決定のための全臓器ホモジネートの連続希釈液をメッキすることで調べることができます。肺は、しかし、脾臓、肝臓、リンパ節は通常、それに応じて分析され、結核の病気の症状のプライマリ·サイトである。めっきされる希釈物は、組織中、ならびに臓器へと時点で異なる細菌負荷を生じさせる初期接種（高用量対低用量）に依存器官における予想マイコバクテリア負荷に依存分析される。低用量感染時に、肺でのマウンテンバイク菌H37Rvの細菌負荷は通常、一日25〜30の間でプラトーに達する。 CO 2窒息または：安楽死させた動物（安楽死を配置クラスIIバイオセーフティキャビネット内で解剖ボード上の吸収紙の端子麻酔）および70％エタノールでマウスを消毒。注：70％アルコールが表面だけ除染するためのものであり、マウンテンバイクを殺すことはありません。 腹部の真ん中に小さな切開を作り、頭の上にマウスの皮膚を撤回。 外科はさみで腹部と胸郭を開き、肺がアクセスできるように胸壁を削除します。 肺を除去し、均質化緩衝液（無菌水/ 1％v / vのTween80を/ 1％重量/容量アルブミン）にて15mlチューブに移す。 の5mlシリンジのプランジャを使用すると、小さなペトリ皿に100μmの篩を介して肺に負担。 1ミリリットルピペットバリアチップを搭載し、8寒天プレート間の肺ホモジネート配布使用してフラッシュするモレキュラーシーブの数倍（CA 250μL/プレートを、彼らはよく乾燥させて表面を有していることを確認してください）。 慎重に2パーセントに廃棄される使い捨てのスプレッダーを使用してサンプルプレートBuraton。 キャビネット内部を乾燥さ寒天プレートにしておきます。 、パラフィルムで一つ一つのプレートをシールアルミホイルで包み、少なくとも4週間、37℃で直立インキュベートする。 3。エスケープ防蚊ケージの構築齧歯類マラリア原虫株は人体に有害ではありません。 MTB-感染したマウスは、寄生虫の受信者であり、作業はBSL 3条件下で行われるので、予防措置をケージから逃げるの蚊を防ぐために必要です。計画された感染レジメンに応じて、オートクレーブ可能と金属フレームのケージまたは自作使い捨て再使用可能なケージを使用することができる。実験動物の咬傷感染によりマウス当たり蚊の定義された数によって実施される必要がある場合は、後者をお勧めします。自作ケージが必要な場合は、蚊の健康などの仕様は完全ではケージを用意し、実験室での安全性は、そのSOUに依存ND建設（ 図2）。 このようなハーフパイントアイスクリームカートンや紙コーヒーカップ（ 図2）のようにカートンを取る。 カートンの側面に小さな開口部をカットし、蚊のための安全な入り口を作成するには、それぞれの作品に切ったスリットとラテックスの二重の層でカバーしています。注：開口部には、2センチメートル×2cmの全体的なサイズ、我々が持って使用してチューブ（吸引器デバイス）および/または取り出し蚊が変更された15ミリリットルファルコンチューブで真空ポンプに取り付けられており、それゆえとして機能しています直径1.5cmと吸引器。 ドリップを吸収するためにカートンの内底部にフィルター紙をテープで固定します。 ネッティング（ナイロンメッシュの二重層、サイズ1ミリメートル×1ミリメートル）でアイスクリームのカップを閉鎖し、テープとゴムバンドでカートンに固定します。 マウスあたり蚊の定義された番号が必要とされる感染実験のために、10〜15で感染した蚊のケージを調製し、その各々は、理想的にはAVが含まれている万野生型唾液腺Pのerage ベルゲイスポロゾイト。 理想的には、前に血粉の実行に24時間蚊を飢えさせる。 4。蚊に刺されによるマウスのマラリア感染本明細書中で使用されるげっ歯類のマラリア原虫はPです。 ベルゲイしかし 、目的の任意の他の齧歯類マラリア原虫株を使用することができる。スポロゾイト送信のために感染性の蚊を得るために、寄生虫のライフサイクル全体を、脊椎動物宿主（マウス）および蚊ベクターの両方で維持される。寄生虫メンテナンスは昆虫館で行われる。自然の伝送実験では、唾液腺あたりのスポロゾイトの最小数は1万以上あってはならない。寄生虫·メンテナンスの詳細なプロトコルのために我々はモルらによってマラリア研究における方法を参照してください。、2013。 ケタミンでマウンテンバイクを40日間preinfectedナイーブマウスや動物を麻酔し（100 mg / kg）を腹腔内注射によっておよびキシラジン（7 mg / kg）の溶液（200μL/マウス）。注：マウンテンバイクとマラリア感染との間の時間は、基礎となる研究課題に応じて調整することができる。同様に、病原体の課題の順序は逆にすることができる、すなわち、マウスは従来のMtb感染に対する感染性の蚊に暴露することができる。 蚊のケージ（マウスの比率定義された蚊のための蚊のケージ当たり1マウス）の相殺に麻酔したマウスを置き、蚊が10〜15分間、膜を通して供給することができます。注：蚊の腸内の血液の存在は摂食ので、スポロゾイト送信を意味します。 背中をケージにマウスを移し、麻酔から目覚めまで、絶えず監督。注：場所のペーパータオルの上ではなく、寝具上のマウス（窒息のリスク）と保温（緊密に行われ、紙タオルで体をカバー）。 正味を通じて70％エタノールまたは他の消毒剤を噴霧することにより蚊を殺すケージのING。オートクレーブケージや使い捨てのものが使用された場合廃棄します。 5。監視寄生虫穿刺尾は針で一番最後に静脈やスライドの両端に血の一滴を収集します。 スライドの長さの半分以上の血液1滴を引っ張って別のスライドを使用しています。二スミアのために他のエッジを使用するようにスプレッダー裏返し。空気乾燥スライドしたままにします。 ギムザ染色スライドホルダーにス​​ライドを置き、無水メタノールでの短時間の浸漬することによって血液塗抹標本を固定します。注：ガラス製品の使用は、我々はすべてのソリューションのためのポリプロピレンキュベットを使用BSL 3で最小に保たれるべきであるので。 ギムザ（脱イオン水中1:10）での塗抹標本を浸します。 10分後、余分な汚れを洗い流すために脱イオン水で数回満たされた染色キュベットの内外にスライドを浸し。 最後に、垂直位置での空気乾燥スライドする。 ALTERNATIVE STAIN：ライト＆＃180、S染色メタノール中1ミリグラム/ mlの濃度でライト染色を溶かす。 使用前に折られたフィルターでろ過する。 染色液に血液塗抹標本を浸し、4分間インキュベート（注：染色液をベースメタノールであるように、スミアのメタノール固定は必要ありません）。 上記のように脱イオン水にスライドをすすぐことによって洗浄し、空気乾燥したスライドを残す。 ギムザ/ライトの汚れが完了したら、そっとBuraton含有廃棄ポットに使用されるすべての試薬を移す。 血液塗抹標本分析油浸で100倍の倍率で光学顕微鏡で染色血液塗抹標本を分析します。 赤血球が単層に配列されている血液塗抹の領域に感染していないし、感染した赤血球を数える。 明確に定義された寄生虫血を達成するために、赤血球の単層を表示するビューの少なくとも10個の異なるフィールドを数える。 カルキユル赤血球の数によって寄生さ赤血球の数を割り、100を掛けることによって（％）で相対的な寄生虫を食べました。