מודל ניסיוני לחקר המלריה שחפת-coinfection על הילוכים טבעיים של חפת Mycobacterium ו Berghei Plasmodium</i
Summary
שחפת ומלריה הן שניים מהזיהומים הנפוצים ביותר בבני אדם וגורמים עיקריים לתחלואה ותמותה באוכלוסיות עניות באזורים הטרופיים. הקמנו מערכת מודל ניסיונית ללמוד תוצאה של coinfection מלריה שחפת בעכברים לאחר אתגר עם שני פתוגנים דרך התוואי הטבעי שלהם לזיהום.
Abstract
Coinfections מתרחש באופן טבעי עקב החפיפה הגיאוגרפית של סוגים שונים של אורגניזמים פתוגניים. זיהומים במקביל סביר ביותר לווסת את התגובה החיסונית המתאימה לכל פתוגן היחיד ועשויים ובכך משפיעים על הפתוגנזה ותוצאות מחלה. חולי נישאים עשויים גם להגיב באופן דיפרנציאלי להתערבויות אנטי זיהומיות. Coinfection בין שחפת שנגרם על ידי mycobacteria וטפיל המלריה Plasmodium, אשר שניהם coendemic בחלקים רבים של אפריקה שמדרום לסהרה, לא נחקר בפירוט. כדי להתקרב המאתגר אבל מבחינה מדעית וקליני שאלה רלוונטית מאוד איך חסינות מארח לווסת coinfection מלריה שחפת וכמובן של כל מחלה, הקמנו מודל עכבר ניסיוני המאפשר לנו לנתח את התגובה החיסונית שהושרו לשני פתוגנים במארח הנישאים . ראוי לציין, על מנת שרוב הזיהומים אנושיים שנרכשו באופן טבעי בדיוק לחקות, אנו מבצעים ניסויזיהומים של עכברים עם שני פתוגנים על ידי מסלוליהם הטבעיים של זיהום, כלומר בתרסיס ועקיצת יתוש, בהתאמה.
Introduction
אוכלוסיות אנושיות לעתים רחוקות נחשפות לפתוגן אחד בלבד. במיוחד באזורים עם שכיחות גבוהה של זיהומים כגון אפריקה שמדרום לסהרה, coinfections מייצג בעיה של בריאות ציבור ראש אבל מעריכים מאוד. שחפת ומלריה הן הזיהומים חיידקיים וטפילים הנפוצים ביותר בבני אדם, בהתאמה, ותמשיך להיות גורמים עיקריים לתחלואה ותמותה באוכלוסיות עניות באזורים הטרופיים. למרות החפיפה הגיאוגרפית הרחב בין שחפת והמלריה והמספר הגדול של אנשים בסיכון של coinfection, מעט מאוד ידוע על האינטראקציות בין הרגולטורים השונים, ולעתים קרובות מנטרלים חיסוניים וeffectors שהושרו בו זמנית נגד טפילי מלריה וחיידקים גבשושית בנישאים.
מודלים של מכרסמים של מעורבים זיהומים לאפשר אפיון תגובות חיסוניים ההפרש נגד פתוגנים שונים במארח אחד, ובכך לשפוך אור על influ ההדדיences הפתולוגיה ויסות ותוצאות קליניות של המחלה בודדת, אשר תסייע גם לזהות המלצות חדשות לטיפול ומניעה. הקמנו מודל עכבר ניסיוני המאפשר לנו לחקור את ההשלכות נגרמות על ידי זיהום במקביל עם שחפת Mycobacterium (MTB) ומיני Plasmodium המכרסם בתוך אותו המארח 1. חשוב לציין, לחקות זיהומים אנושיים שנרכשו באופן טבעי ככל האפשר, המודל שלנו מיישם את המסלולים הטבעיים של זיהום בשימוש על ידי שני גורמי המחלה. שחפת היא מחלה עוברת באוויר, שכן בראש ובראשונה באה לידי ביטוי בתוך הריאות. הסוכן סיבתי, MTB מועבר על ידי אנשים עם מחלה פעילה דרך מסלול התרסיס כאשר הם לגרש טיפות תרסיס זיהומיות במהלך שיעול או התעטשות. לכן, זיהום אירוסול הוא שיטת הבחירה לחקות זיהום טבעי. דור של חלקיקים הנישאים באוויר המכילים MTB יכול להיות מושגת על ידי השימוששל מערכת חשיפת משאיפת. תא חשיפת כל גוף זה מאפשר לחשוף חיות מעבדה לMTB המכיל טיפות תרסיס זיהומיות (איור 1) שבו הם נשאפים לתוך alveoli של הריאות שבו זיהום הוא יזם 2.
מלריה ומצד שני היא מחלה וקטור נישא הנגרמת על ידי protozoan, Plasmodium טפיל apicomplexan אשר מועבר על ידי עקיצת יתוש Anopheline נשי באופן טבעי. במהלך ארוחת דם, sporozoites זיהומיות מופקדים מתחת לעור המארח ולאחר מכן להגיע לכבד דרך זרם הדם. בתוך הפטוציטים שהם מפתחים במהירות ולהתרבות לschizonts כבד השלבים. סופו של הדבר, schizonts הבוגר הקרע ולשחרר אלפי merozoites הדור הראשון פתוגניים לתוך זרם הדם שם הם ליזום מחזור מתקדם של פלישה אדומה תא, שכפול, קרע תא אדום, וreinvasion 3. Contin מחזור החיים PlasmodiumUES כמו כמה merozoites להתפתח לשלבי הטפיל המיניים, gametocytes הזכר והנקבה, אשר יכול להיות נלקח על ידי יתושים במהלך ארוחות דם. ביתושים, sporozoites Plasmodium להתפתח בתוך ביצים המתגוררות בmidgut היתושים וסופו של דבר להגר לבלוטות הרוק להעברה הלאה ל3,4 מארח אחר.
בעוד במודלים של בעלי חיים ניסיוני המשלוח של MTB באמצעות התרסיס ומסלול ובכך הרלוונטי ביותר הוא נפוץ מאוד, מחקרים רבים זיהום ניסיון Plasmodium המכרסמים כוללים מחקרים על coinfection מלריה שחפת 5-7 בוצעו על ידי הדבקה של עכברים עם אריתרוציטים parasitized, והוליד להידבקות במלריה בדם בשלב תוך הדרת שלב כבד בשלב הקלינית השקט. עם זאת, בשלב הכבד הוא צעד הכרחי במהלך זיהום ורלוונטי לחסינות נגד plasmodial 8-11. אנחנו רואים את זה ולכן חשוב לכלול את ה-pH בכבדASE של שידור מלריה ותחזוקה בלימודים של שניהם מלריה וcoinfection מלריה שחפת, בהתאמה. בנוסף, זה כבר הראה כי sporozoites מועבר באופן טבעי יותר זיהומיות מאלה מועברים באמצעות מחט 12 זיהומים, שגרמו לנו להקים את ההידבקות במלריה על ידי עקיצת יתוש במקום הזרקת sporozoites נגזר בלוטת רוק מבודדת. הדרך היחידה להשיג יתושים זיהומיות לשידור טבעי של טפילי מלריה היא לשמור על כל מחזור החיים של הטפיל בשני מארח החוליות (כאן בעכבר) ווקטור היתוש. לפיכך, גישה לinsectary לתחזוקת הטפיל היא בלתי נמנעת על מנת לבצע העברת טבעית על ידי נשיכה.
הפרוטוקול שלנו שיתואר בהמשך פותח כדי לחקור כיצד coinfection עם Plasmodium sporozoites משפיע על שחפת כרונית 1. לשם כך, עכברים נגועים בתרסיס עם מ ' שחפת ו40 ימים לאחר מכן, כאשר מ ' זיהום השחפת הגיע לשלב הכרוני, עכברים שנחשפו ליתושי מלריה מדבקת. תוצאתם של שתי מלריה ושחפת בבעלי החיים הנישאים יכולה להיות מלווה ניטור parasitemia דם ועומס חיידקים ברקמות, בהתאמה. בפרוטוקול שלנו, נתאר בפירוט כיצד להדביק עכברים עם שני פתוגנים דרך כביש הזיהום הטבעי שלהם וכיצד לאשר העברת הפתוגן מוצלחת. בידיים שלנו, שיעור הזיהום הנפוץ השיג עבור שני הזיהומים הניסיוניים הוא 100%. יכולים להיות מיושמים על פרוטוקולים אלה ללמוד שני זיהומים בנפרד או, כפי שאנו עושים, למודל וללמוד coinfection בין שתי המחלות זיהומיות האדם המאתגרות ביותר. מודל זה ישים למינים Mycobacterium וPlasmodium מכרסמים אחרים מעבר לאלה שתוארו בפרוטוקול זה.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנחנו תיארתי כיצד עכברים יכולים להיות נגועים באופן פרודוקטיבי עם MTB ופ berghei דרך נתיביהם הטבעיים של זיהום. אנחנו מיישמים הוקמו פרוטוקולי זיהום ללמוד ניסיונית שחפת 13 או מלריה 12 ולאחרונה אימצנו אותם ללמוד coinfection בין MTB וPlasmodium במודל העכבר 1.
השלבים הקריטיים ביותר לזיהומים מוצלחים הם השידור של שני פתוגנים במספרים הרצויים. מניות mycobacterial לא צריכים להיות מבוגרות יותר מ 2 שנים, כי הם יאבדו את יכולת קיום לאורך זמן, וכיילו במקור הנחוש של המניות סבירות להניח שכבר לא יהיו מדויק. כתוצאה מכך, מינוני זיהום יהיו נמוכים בהרבה מהצפוי. לכן, כותרות CFU של תרבויות המניה צריכה להיקבע בכל כמה חודשים. לא פחות חשוב הוא הטיפוח הסטנדרטי והדור של מניות MTB במקום הראשון. תנאי תרבות כגוןבינוני, תוספי מזון, זמן, ונפח צריכים להיות אחידים כדי שתוכל להשוות נתונים מניסויים באמצעות מניות שונות של MTB. Mycobacteria נוטה גוש בתרבות, ולכן חשוב לשמור על תנאי תרבות טופל, חיידקי קציר באותו שלב הצמיחה וresuspend לעתים קרובות במהלך aliquoting. אחרת לא יכולה להיות וריאציה רחבה של כותרות CFU ותוצאת זיהום.
הדור של קבוצות יתושים נגועים הומוגנית הוא עוד שלב קריטי. מאז יתושים שונים יהיה להאכיל על כל עכבר בודד, חשוב שכל היתושים המשמשים לניסוי זיהום אחד באים מאותו אצווה וכי רק אלה קבוצות שבו יותר מ -90% מיתושים נגועים נמצאות בשימוש.
המודל הנוכחי יכול לשמש כדי לנתח את תגובה חיסונית ומודולציות חיסוניים במארח נישאים ידי השוואתה לתגובה החיסונית במארחים נגועים אחד. אנחנו יכולים ליישם את vaמתודולוגיות מבוססות היטב rious כגון היסטולוגיה, אימונוהיסטוכימיה, cytometry הניתוח של אוכלוסיות תאים חיסוניים, או PCR וELISA לציטוקינים וזיהוי chemokine לנוזלים ברקמות גוף או של עניין. יש לציין, שיש להם מודלים עכבר כזה מגבלות מסוימות. ואילו הרוב המכריע של אנשים שנדבקו בMTB לפתח זיהום סמוי ללא סימנים של תסמינים קליניים, עכברים לפתח מחלה כרונית עם הפתולוגיה ריאות מתקדמת. ובכל זאת, עכברי C57BL / 6 הם עמידים יחסית לזיהום MTB ולא לפתח גרנולומות הקלסית כפי שנצפו בחולי שחפת אדם. כתוצאה מכך, תגובות immunopathological בעכבר משקפות לא מחלת שחפת אדם רדומה ולא פעילה כראוי. למרות הפער בין מחלה הסמויה וכרונית באדם ובעכבר, עכברים נעשו שימוש נרחב כדי לזהות וללמוד גורמי מארח ששולטים זיהום MTB והם כלים חשובים והכרחיים כדי לחקורתגובה חיסונית במחלות זיהומיות. חשוב מכך, רגישות לזיהום MTB משתנה במידה ניכרת בין זנים נפוצים טהורים עכבר וזנים רגישים יותר כגון DBA או C3H יכול להיכלל במחקרים משותפים וחד זיהום. יתר על כן, מלבד מיני פתוגן שתוארו במסמך זה, יכול לשמש לכל מיני Mycobacterium אחרים בעלי עניין (למשל קליני מבודד). כמו כן, בזמן שאין מודל מלריה אחד משכפל את כל ההיבטים של דגמי עכבר שונים מחלה אנושית שדומים היבטים שונים של הידבקות במלריה אנושית שנרכשה באופן טבעי. למשל, פ berghei אנקה ופ yoelii YM/17XL נלמדים בהרחבה מודלים של מלריה חמורה אנושית (מושרה פ falciparum), עם פ berghei אנקה להיחשב כמודל מצוין לאדם malari של מוחין 14,15. פ berghei NK65 הוא מודל מצוין לhyperparasitaemia ואנמיה מלריה חריפה, וכבר מזמןתואר כמודל ניסיוני לתסמונת הקשורים מלריה מצוקה נשימתית חריפה (ARDS MA-16). שימוש במודל coinfection תאר, שנוכל לאחרונה מראה כי פ 'במקביל זיהום berghei NK65 מחריף חפת כרונית 1.
מלבד שימוש טפילי מלריה מכרסם שונים, הסדר והתזמון של אירועי זיהום עלול להיות מותאם בהתאם לשאלת המחקר הבסיסית. בתחום, זיהומי Plasmodium נלווים עשויים להיות נוכחים בזמן זיהום MTB או נרכש לאחר מכן. בשני תרחישי התגובה החיסונית לMTB וPlasmodium עשויה להיות מושפעת באופן שונה. לכן, יכולים להיות נגועים בעכברים עם sporozoites Plasmodium לפני או אחרי זיהום MTB. יתר על כן, ניתן לערער עכברים בזמנים שונים לאחר זיהום MTB כדי להעריך את ההשפעה של התגובה החיסונית הנגרם על Plasmodium אקוטי מול כרונישחפת. חשוב מכך, בעת בחירת טפיל מלריה ללימוד coinfection מלריה שחפת, אחד צריך להיות מודע לכך שכמה זני Plasmodium מכרסמים לגרום למחלה חריפה בזני עכבר מסוימים ונכנעים לזיהום בתוך ימים או שבועות בלבד ואילו MTB גורם כרוני וזיהומים ארוכים טווח במערכת חיסון עכברים. לפיכך, עיתוי coinfection הוא קריטי על מנת למנוע מוות בטרם עת של חיות ניסוי.
האפנון של חסינות מארח על ידי זיהום בו זמנית עם מיני הפתוגן מרובים נשאר הבין היטב. מודל coinfection הניסיוני שלנו מספק כלי רב עוצמה כדי לחקור Mycobacterium – האינטראקציה Plasmodium עם המערכת החיסונית של מארח נישאים ויתרמו להבנה שלנו איך coinfections יכול להשפיע על פתוגנזה, תוצאות מחלה, חיסון, immunodiagnostics, וטיפול.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות למרים אסתר לגידול יתושים. עבודה זו נתמכה על ידי מימון בבית מBorstel מרכז המחקר והצטרפה מימון על ידי זיהום לייבניץ המרכז.
Materials
| Buraton | Schülke | active ingredients: aldehyds (formaldehyde, glutaraldehyde, oxalaldehyde, ethyl hexanal) | |
| Middlebrook 7H9 | Sigma | M0178 | For Mtb broth cultures |
| Middlebrook 7H11 | BD Biosciences | 283810 | Agar medium for Mtb culture |
| Middlebrook OADC enrichment medium | BD Biosciences | 212240 | Add to 7H9 and 7H11 for Mtb culture |
| Staining Dish | Science Services | E62542-12 | |
| 24-Slide Holder w/Handle | Science Services | E62543-06 | |
| Giemsas Azur-Eosin-Methylene blue solution | Merck Millipore | 109204 | |
| Wright´s stain | Sigma | W0625 | |
| Inhalation Exposure System | Glas-Col | ||
| Nebulizer-Venturi | Glas-Col | ||
| Ice cream cups | Häagen-Dazs | Used as mosquito cages | |
| Metal-frame mosquito cages | BioQuip Products | 1450A |
References
- Mueller, A. -. K., et al. Natural Transmission of Plasmodium berghei Exacerbates Chronic Tuberculosis in an Experimental Co-Infection Model. PLoS ONE. 7, e48110 (2012).
- Korbel, D. S., Schneider, B. E., Schaible, U. E. Innate immunity in tuberculosis: myths and truth. Microbes Infect. 10, 995-1004 (2008).
- Aly, A. S., Vaughan, A. M., Kappe, S. H. Malaria parasite development in the mosquito and infection of the mammalian host. Annu. Rev. Microbiol. 63, 195-221 (2009).
- Cirimotich, C. M., Dong, Y., Garver, L. S., Sim, S., Dimopoulos, G. Mosquito immune defenses against Plasmodium infection. Dev. Compar. Immuno. 34, 387-395 (2010).
- Page, K. R., et al. Mycobacterium-induced potentiation of type 1 immune responses and protection against malaria are host specific. Infect. Immun. 73, 8369-8380 (2005).
- Hawkes, M., et al. Malaria exacerbates experimental mycobacterial infection in vitro and in vivo. Microbes Infect. 12, 864-874 (2010).
- Scott, C. P., Kumar, N., Bishai, W. R., Manabe, Y. C. Short report: modulation of Mycobacterium tuberculosis infection by Plasmodium in the murine model. Am. J. Trop. Med. Hyg. 70, 144-148 (2004).
- Hoffman, S. L., Doolan, D. L. Malaria vaccines-targeting infected hepatocytes. Nat. Med. 6, 1218-1219 (2000).
- Mueller, A. K., et al. Genetically attenuated Plasmodium berghei liver stages persist and elicit sterile protection primarily via CD8 T cells. Am. J. Pathol. 171, 107-115 (2007).
- Mueller, A. K., Labaied, M., Kappe, S. H., Matuschewski, K. Genetically modified Plasmodium parasites as a protective experimental malaria vaccine. Nature. 433, 164-167 (2005).
- Nussenzweig, R. S., Vanderberg, J., Most, H., Orton, C. Protective immunity produced by the injection of x-irradiated sporozoites of plasmodium berghei. Nature. 216, 160-162 (1967).
- Vaughan, J. A., Scheller, L. F., Wirtz, R. A., Azad, A. F. Infectivity of Plasmodium berghei sporozoites delivered by intravenous inoculation versus mosquito bite: implications for sporozoite vaccine trials. Infect. Immun. 67, 4285-4289 (1999).
- Coleman, J., Juhn, J., James, A. A. Dissection of midgut and salivary glands from Ae. aegypti mosquitoes. J. Vis. Exp. , e228 (2007).
- Franke-Fayard, B., et al. A Plasmodium berghei reference line that constitutively expresses GFP at a high level throughout the complete life cycle. Mol. Biochem. Parasitol. 137, 23-33 (2004).
- Lin, J. W., et al. Loss-of-function analyses defines vital and redundant functions of the Plasmodium rhomboid protease family. Mol. Microbiol. 88, 318-338 (2013).
- Bancroft, J. D. G., M, . Theory and Practice of Histological Techniques. , (2007).
- Schneider, B. E., et al. A role for IL-18 in protective immunity against Mycobacterium tuberculosis. Eur. J. Immunol. 40, 396-405 (2010).
- Craig, A. G., et al. The role of animal models for research on severe malaria. PLoS Pathog. 8, e1002401 (2012).
- de Souza, J. B., Hafalla, J. C., Riley, E. M., Couper, K. N. Cerebral malaria: why experimental murine models are required to understand the pathogenesis of disease. Parasitology. 137, 755-772 (2010).
- Van den Steen, P. E., et al. Immunopathology and dexamethasone therapy in a new model for malaria-associated acute respiratory distress syndrome. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 181, 957-968 (2010).
