Un modello sperimentale per studiare la tubercolosi, la malaria coinfezione sulla trasmissione naturale di Mycobacterium tuberculosis E Plasmodium berghei</i
Summary
La tubercolosi e la malaria sono due delle infezioni più diffuse negli esseri umani e le principali cause di morbilità e mortalità nelle popolazioni povere nei tropici. Abbiamo stabilito un sistema modello sperimentale per lo studio esito della malaria, tubercolosi coinfezione nei topi dopo la sfida con entrambi i patogeni tramite il loro percorso naturale di infezione.
Abstract
Coinfezione naturalmente si verificano a causa della sovrapposizione geografica di diversi tipi di organismi patogeni. Infezioni concomitanti probabilmente modulano la rispettiva risposta immune ad ogni singolo agente patogeno e possono quindi influenzare la patogenesi e l'esito della malattia. Pazienti co-infetti possono anche rispondere in modo differenziato agli interventi anti-infettivi. La coinfezione tra tubercolosi causata da micobatteri e il parassita della malaria Plasmodium, che sono entrambi coendemic in molte parti dell'Africa sub-sahariana, non è stato studiato in dettaglio. Per accedere alla impegnativo ma scientificamente e clinicamente questione di grande rilevanza come la malaria, la tubercolosi coinfezione modulare l'immunità ospite e il decorso di ogni malattia, abbiamo stabilito un modello sperimentale del mouse che ci permette di sezionare le risposte immunitarie indotte a entrambi i patogeni nell'ospite coinfezione . Da segnalare, per la maggior parte delle infezioni umane precisamente imitare naturalmente acquisiti, eseguiamo sperimentaleinfezioni di topi con entrambi i patogeni da parte dei loro percorsi naturali di infezione, cioè aerosol e puntura di zanzara, rispettivamente.
Introduction
Popolazioni umane sono raramente esposti a un solo patogeno. In particolare nelle regioni con alta incidenza di infezioni come l'Africa sub-sahariana, coinfezioni rappresentano un problema di salute pubblica primaria ma altamente sottovalutata. Tubercolosi e malaria sono le infezioni batteriche o parassitarie più frequenti nell'uomo, rispettivamente, e continuano ad essere le principali cause di morbilità e mortalità nelle popolazioni povere nei tropici. Nonostante l'ampia sovrapposizione geografica tra la tubercolosi e la malaria e il gran numero di persone a rischio di coinfezione, si sa molto poco circa le interazioni tra i vari e spesso di contrasto regolatori del sistema immunitario ed effettori contemporaneamente suscitate contro i parassiti della malaria e bacilli tubercolari in individui con coinfezione.
Modelli di roditori di infezioni miste permettono di caratterizzare le reazioni immunitarie differenziali contro gli agenti patogeni distinti in un host, mettendo così in luce la reciproca influenzarenze modulando patologia e l'esito clinico della malattia individuale, che aiuterà anche a individuare nuove raccomandazioni per la terapia e la prevenzione. Abbiamo stabilito un modello sperimentale del mouse che ci permette di indagare le conseguenze causate da infezione concomitante da Mycobacterium tuberculosis (Mtb) e specie di roditori Plasmodium all'interno dello stesso host 1. È importante sottolineare che, per emulare il più fedelmente possibile le infezioni umane naturalmente acquisite, il nostro modello implementa le vie naturali di infezione utilizzati da entrambi i patogeni. La tubercolosi è un'infezione aerea, che quindi manifesta principalmente nei polmoni. L'agente eziologico, Mtb è trasmesso da persone con malattia attiva per via aerosol quando si espellono goccioline di aerosol infettivi durante la tosse o starnuti. Pertanto, l'infezione aerosol è il metodo di scelta per imitare infezione naturale. Generazione di particelle sospese nell'aria che contengono Mtb può essere ottenuto mediante l'usodi un sistema di esposizione per inalazione. Questa intera camera di esposizione corpo permette di esporre animali sperimentali per Mtb contenenti goccioline di aerosol infettivi (Figura 1) che vengono inalati negli alveoli dei polmoni dove viene avviata infezione 2.
Malaria invece è una malattia trasmessa da vettori causata dal protozoo, Apicomplexa parassita Plasmodium che è naturalmente trasmessa dal morso di una zanzara anofele femmina. Durante la farina di sangue, sporozoiti infettanti sono depositati sotto la pelle ospitante e successivamente raggiungono il fegato attraverso il flusso sanguigno. All'interno di epatociti si sviluppano e si moltiplicano rapidamente in schizonti fegato stadio. Alla fine, schizonti maturi rompono e rilasciano migliaia di patogeni merozoiti di prima generazione nel flusso sanguigno, dove l'inizio di un ciclo progressivo di invasione dei globuli rossi, la replica, la rottura dei globuli rossi, e reinvasion 3. Il Plasmodium ciclo di vita continUES come alcuni merozoiti si sviluppano nelle fasi parassiti sessuali, i gametociti maschili e femminili, che possono essere ripresi dalle zanzare durante i pasti di sangue. Nella zanzara, sporozoiti del Plasmodium si sviluppano all'interno di oocisti residenti nel midgut zanzara e, infine, migrano verso le ghiandole salivari per la ritrasmissione in un altro 3,4 host.
Mentre in modelli sperimentali animali la consegna della Mtb tramite aerosol e via così più rilevante è molto comune, molti studi infezione roditori Plasmodium sperimentali compresi studi sulla malaria, tubercolosi coinfezione 5-7 sono stati effettuati infettando topi con eritrociti parassitati, dando luogo alla malaria infezione del sangue-fase, mentre escludendo la fase epatica fase clinicamente silente. Tuttavia, la fase di fegato è una tappa obbligatoria durante l'infezione e rilevante per l'immunità anti-plasmodiale 8-11. Riteniamo quindi importante includere il ph epaticaase di trasmissione della malaria e manutenzione in studi sia di malaria e tubercolosi malaria-coinfezione, rispettivamente. Inoltre, è stato dimostrato che sporozoiti trasmessi naturalmente sono più virulenta quelli trasmessi da infezioni ago 12, che ci hanno spinto a stabilire l'infezione da malaria zanzara mordere invece di iniettare ghiandole salivari isolato sporozoiti derivati. L'unico modo per ottenere le zanzare infettive per la trasmissione naturale dei parassiti della malaria è quello di mantenere l'intero ciclo di vita del parassita sia l'ospite vertebrato (qui mouse) e il vettore zanzara. L'accesso ad un insectary per manutenzione parassita è inevitabile per eseguire la trasmissione naturale morso.
Il nostro protocollo qui descritto è stato sviluppato per studiare come coinfezione da Plasmodium sporozoiti impatti sulla tubercolosi cronica 1. Per farlo, i topi sono aerosol infettati con M. tubercolosi e 40 giorni più tardi, quando M. infezione da tubercolosi ha raggiunto la fase cronica, i topi sono esposti alle zanzare malaria-infettiva. L'esito di entrambi malaria e tubercolosi sugli animali coinfezione può essere seguita monitorando parassitemia sangue e carica batterica nel tessuto, rispettivamente. Nel nostro protocollo, descriveremo in dettaglio come infettare i topi con entrambi i patogeni attraverso il loro percorso infezione naturale e come confermare la trasmissione del patogeno successo. Nelle nostre mani, il grado di infezione comunemente conseguito per entrambe le infezioni sperimentali è 100%. Questi protocolli possono essere applicati a studiare entrambe le infezioni separatamente o, come noi, per modellare e studiare coinfezione tra due delle malattie infettive umane più difficili. Questo modello è applicabile ad altre specie Mycobacterium e roditori Plasmodium oltre quelle descritte in questo protocollo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo descritto come topi possono essere produttivamente infettati con Mtb e P. berghei attraverso i loro percorsi naturali di infezione. Applichiamo stabilito protocolli di infezione per studiare la tubercolosi o la malaria sperimentale 13 12 e recentemente li adottato per studiare coinfezione tra Mtb e Plasmodium nel modello murino 1.
Le fasi più critiche per le infezioni di successo sono la trasmissione di entrambi i patogeni ai numeri desiderati. Scorte micobatteri non dovrebbero essere più vecchio di due anni perché perderanno vitalità nel tempo, e il titolo originariamente determinato degli stock molto probabilmente non saranno più accurate. Come risultato, le dosi infettive sarebbero molto inferiore al previsto. Pertanto, CFU titoli di culture archivi dovrebbero essere stabiliti ogni pochi mesi. Altrettanto importante è la coltivazione standardizzata e la generazione delle scorte Mtb, in primo luogo. Condizioni di coltura comemedio, integratori, tempo e volume dovrebbero essere standardizzati in modo da poter confrontare i dati provenienti da esperimenti utilizzando diversi scorte di Mtb. Micobatteri tendono a raggrupparsi in cultura, quindi è importante mantenere condizioni di coltura standardizzato, batteri raccolto presso la stessa fase di crescita e risospendere frequentemente durante aliquotazione. Altrimenti non ci può essere un'ampia variazione nei titoli e CFU esito infezione.
La generazione di lotti di zanzara omogeneamente infetti è un altro passo fondamentale. Da diversi zanzare si nutrono di ogni singolo topo, è importante che tutte le zanzare utilizzati per un esperimento di infezione provengono dallo stesso lotto e che sono utilizzati soltanto lotti in cui più del 90% delle zanzare sono infettati.
L'attuale modello può essere utilizzato per analizzare le risposte immunitarie e modulazioni immunitarie in un host coinfezione confrontandola con le risposte immunitarie in host infetti singoli. Possiamo applicare various metodologie già consolidati, come l'istologia, immunoistochimica, analisi di citometria di popolazioni di cellule immunitarie, o PCR ed ELISA per citochine e chemochine rilevazione ai tessuti o fluidi corporei di interesse. Va notato che tali modelli murini hanno alcune limitazioni. Considerando che la maggior parte delle persone infettate con Mtb sviluppare una infezione latente senza segni di sintomi clinici, i topi sviluppano una malattia cronica progressiva patologia polmonare. Eppure, C57BL / 6 topi sono relativamente resistenti all'infezione Mtb e non sviluppano granulomi classici come osservato in pazienti affetti da tubercolosi umani. Di conseguenza, le reazioni immunopatologici nel topo riflettono né malattia né attiva latente tubercolosi umana appropriato. Nonostante la discrepanza tra la malattia latente e cronica nell'uomo e mouse, i topi sono stati ampiamente utilizzati per identificare e studiare fattori dell'ospite che controllano l'infezione Mtb e sono strumenti preziosi e indispensabili per indagarerisposte immunitarie in malattie infettive. Importante, suscettibilità alle infezioni Mtb varia considerevolmente tra ceppi di topi inbred comunemente utilizzati e più ceppi sensibili come DBA o C3H possono essere inclusi in studi co-and-infezione singolo. Inoltre, a parte dell'agente patogeno qui descritti, possono essere usati qualsiasi altra specie Mycobacterium di interesse (ad esempio isolati clinici). Allo stesso modo, mentre un unico modello malaria replica tutti gli aspetti della malattia umana diversi modelli murini non assomigliano molto differenti aspetti della acquisita naturalmente malaria umana. Per esempio, P. berghei ANKA e P. yoelii YM/17XL sono ampiamente studiati modelli di umana (P. falciparum-indotta) malaria grave, con P. berghei ANKA essere considerato come un ottimo modello per Malari cerebrale umana s 14,15. P. berghei NK65 è un ottimo modello per iperparassitemia e anemia malarica acuta, ed è stato recentementedescritto come modello sperimentale per la sindrome da distress respiratorio malaria-associata (MA-16 ARDS). Utilizzando il modello coinfezione descritto, abbiamo potuto dimostrare recentemente che concomitante P. infezione berghei NK65 aggrava la tubercolosi cronica 1.
Oltre ad utilizzare diversi parassiti della malaria roditore, l'ordine e la tempistica degli eventi di infezione possono essere adeguati a seconda della domanda di ricerca sottostante. Nel campo, infezioni Plasmodium concomitanti possono essere presenti al momento dell'infezione Mtb o acquisite successivamente. In entrambi i casi le risposte immunitarie a Mtb e Plasmodium possono essere influenzati in modo diverso. Pertanto, i topi possono essere infettati da Plasmodium sporozoiti prima o dopo l'infezione Mtb. Inoltre, i topi possono essere contestate in tempi diversi postare infezione Mtb per valutare l'impatto della risposta immunitaria Plasmodium-indotta acuta rispetto cronicatubercolosi. È importante sottolineare che, quando si sceglie un parassita della malaria per studiare la malaria-tubercolosi coinfezione, si deve essere consapevoli del fatto che alcuni ceppi di Plasmodium roditori causano malattie acute in alcuni ceppi di topo e soccombere alle infezioni entro pochi giorni o settimane, mentre Mtb causa cronica e infezioni di lunga durata in immunocompetente topi. Quindi, i tempi di coinfezione è cruciale al fine di evitare la morte prematura degli animali da esperimento.
La modulazione dell'immunità ospite da infezione simultanea con più specie di patogeni rimane poco conosciuta. Il nostro modello di coinfezione sperimentale fornisce un potente strumento per indagare Mycobacterium – Plasmodium interazione con il sistema immunitario di un host coinfezione e contribuiranno alla nostra comprensione di come co-infezioni possono influenzare la patogenesi, decorso della malattia, la vaccinazione, immunodiagnostics, e la terapia.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare Miriam Ester per l'allevamento delle zanzare. Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti in-house dal Centro di Ricerca Borstel e si unì finanziamento da parte Infection Leibniz Center.
Materials
| Buraton | Schülke | active ingredients: aldehyds (formaldehyde, glutaraldehyde, oxalaldehyde, ethyl hexanal) | |
| Middlebrook 7H9 | Sigma | M0178 | For Mtb broth cultures |
| Middlebrook 7H11 | BD Biosciences | 283810 | Agar medium for Mtb culture |
| Middlebrook OADC enrichment medium | BD Biosciences | 212240 | Add to 7H9 and 7H11 for Mtb culture |
| Staining Dish | Science Services | E62542-12 | |
| 24-Slide Holder w/Handle | Science Services | E62543-06 | |
| Giemsas Azur-Eosin-Methylene blue solution | Merck Millipore | 109204 | |
| Wright´s stain | Sigma | W0625 | |
| Inhalation Exposure System | Glas-Col | ||
| Nebulizer-Venturi | Glas-Col | ||
| Ice cream cups | Häagen-Dazs | Used as mosquito cages | |
| Metal-frame mosquito cages | BioQuip Products | 1450A |
References
- Mueller, A. -. K., et al. Natural Transmission of Plasmodium berghei Exacerbates Chronic Tuberculosis in an Experimental Co-Infection Model. PLoS ONE. 7, e48110 (2012).
- Korbel, D. S., Schneider, B. E., Schaible, U. E. Innate immunity in tuberculosis: myths and truth. Microbes Infect. 10, 995-1004 (2008).
- Aly, A. S., Vaughan, A. M., Kappe, S. H. Malaria parasite development in the mosquito and infection of the mammalian host. Annu. Rev. Microbiol. 63, 195-221 (2009).
- Cirimotich, C. M., Dong, Y., Garver, L. S., Sim, S., Dimopoulos, G. Mosquito immune defenses against Plasmodium infection. Dev. Compar. Immuno. 34, 387-395 (2010).
- Page, K. R., et al. Mycobacterium-induced potentiation of type 1 immune responses and protection against malaria are host specific. Infect. Immun. 73, 8369-8380 (2005).
- Hawkes, M., et al. Malaria exacerbates experimental mycobacterial infection in vitro and in vivo. Microbes Infect. 12, 864-874 (2010).
- Scott, C. P., Kumar, N., Bishai, W. R., Manabe, Y. C. Short report: modulation of Mycobacterium tuberculosis infection by Plasmodium in the murine model. Am. J. Trop. Med. Hyg. 70, 144-148 (2004).
- Hoffman, S. L., Doolan, D. L. Malaria vaccines-targeting infected hepatocytes. Nat. Med. 6, 1218-1219 (2000).
- Mueller, A. K., et al. Genetically attenuated Plasmodium berghei liver stages persist and elicit sterile protection primarily via CD8 T cells. Am. J. Pathol. 171, 107-115 (2007).
- Mueller, A. K., Labaied, M., Kappe, S. H., Matuschewski, K. Genetically modified Plasmodium parasites as a protective experimental malaria vaccine. Nature. 433, 164-167 (2005).
- Nussenzweig, R. S., Vanderberg, J., Most, H., Orton, C. Protective immunity produced by the injection of x-irradiated sporozoites of plasmodium berghei. Nature. 216, 160-162 (1967).
- Vaughan, J. A., Scheller, L. F., Wirtz, R. A., Azad, A. F. Infectivity of Plasmodium berghei sporozoites delivered by intravenous inoculation versus mosquito bite: implications for sporozoite vaccine trials. Infect. Immun. 67, 4285-4289 (1999).
- Coleman, J., Juhn, J., James, A. A. Dissection of midgut and salivary glands from Ae. aegypti mosquitoes. J. Vis. Exp. , e228 (2007).
- Franke-Fayard, B., et al. A Plasmodium berghei reference line that constitutively expresses GFP at a high level throughout the complete life cycle. Mol. Biochem. Parasitol. 137, 23-33 (2004).
- Lin, J. W., et al. Loss-of-function analyses defines vital and redundant functions of the Plasmodium rhomboid protease family. Mol. Microbiol. 88, 318-338 (2013).
- Bancroft, J. D. G., M, . Theory and Practice of Histological Techniques. , (2007).
- Schneider, B. E., et al. A role for IL-18 in protective immunity against Mycobacterium tuberculosis. Eur. J. Immunol. 40, 396-405 (2010).
- Craig, A. G., et al. The role of animal models for research on severe malaria. PLoS Pathog. 8, e1002401 (2012).
- de Souza, J. B., Hafalla, J. C., Riley, E. M., Couper, K. N. Cerebral malaria: why experimental murine models are required to understand the pathogenesis of disease. Parasitology. 137, 755-772 (2010).
- Van den Steen, P. E., et al. Immunopathology and dexamethasone therapy in a new model for malaria-associated acute respiratory distress syndrome. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 181, 957-968 (2010).
