Eine experimentelle Modell zum Studium Tuberkulose-Koinfektion auf Natur Malaria Übertragung von Mycobacterium tuberculosis Und Plasmodium berghei</i

Sicherheitsmaßnahmen und Ethikerklärung Die vorgestellten Studien hier Arbeit einzubeziehen mit dem menschlichen Erreger Mtb und der Nagetier-Malaria-Parasiten Plasmodium berghei (P. berghei). Experimente mit Mtb (Stamm H37Rv) und P. berghei müssen unter den entsprechenden Bedingungen der biologischen Sicherheit durchgeführt werden. Biosicherheitsstufe (BSL) 2 Labors sind für Nager Malaria-Parasiten wie P. erforderlich berghei und BSL 3 für Mtb und damit für alle Koinfektion Studien hierin beschrieben. HINWEIS: Mäuse, die mit Mtb nicht infiziert, die Infektion auf andere Mäuse in unmittelbarer Nähe zu verbreiten (eigene Beobachtung). Verteilt auf den Experimentator kann daher nicht ausgeschlossen werden, aber entsprechende Schutzkleidung muss in der BSL 3 Labor jederzeit getragen werden. Nach unseren Regeln, Experimentatoren tragen chirurgische Peelings, Haarnetze, Einweg-Atemschutzmasken und zwei Paar Handschuhe, von denen der äußere verworfen wird jederzeit eineeff aus dem Schrank herausgezogen. Neue werden auf, bevor sie in den Schrank wieder setzen. Zwei Container, eines mit 2% Buraton (HINWEIS: genehmigt, um andere Mtb inaktivieren Desinfektionsmittel können in der zugelassenen Konzentration verwendet werden) für flüssige und infektiösen Abfällen und eine für Oberflächenkontamination, sind vor dem Experiment vorbereitet und in den Schrank gelegt. Darüber hinaus werden Kunststoffbeutel für feste Abfälle noninfectious verwendet werden. Nach deutschen Regeln, die alle Arbeiten, die den Umgang und die Verarbeitung von Mtb Kulturen oder Gewebe von infizierten Mäusen abgeleitet Mtb muss in einem Klasse-2-Biosicherheitswerkbank in einem BSL3 Labor durchgeführt werden. Beim Umgang mit Mycobakterien, müssen Maßnahmen ergriffen werden, um die Erzeugung von Aerosolen zu vermeiden. Weibliche C57BL / 6 Mäuse (Charles River) zwischen 6-8 Wochen gealtert wurden für alle Experimente verwendet Koinfektion und unter bestimmten Bedingungen in Barriere BSL 3 Anlagen gehalten. Tierpflege und Experimente waren pein Übereinstimmung mit den Protokollen von der Ethikkommission für Tierversuche des Ministeriums für Landwirtschaft, Umwelt und ländliche Räume des Landes Schleswig-Holstein genehmigt rformed Zur Gewinnung von Malaria-Mücke Stufen wurden NMRI-Mäuse von Charles River Laboratory, Sulzfeld, Deutschland gekauft und unter spezifischen Pathogen-freien Bedingungen innerhalb der Universität Heidelberg Tiereinrichtung (IBF) gehalten. Alle Tierversuche wurden entsprechend den europäischen Vorschriften durchgeführt und von den staatlichen Behörden des Landes Baden-Württemberg (Regierungspräsidium Karlsruhe) zugelassen. 1. Aerosol-Infektion von Mäusen mit Mtb mit einem Glas-Col Aerosolkammer Der beste Weg, um die Aerosol-Infektion von Versuchstieren mit Mtb Standardisierung ist es, Mykobakterien aus gefrorenen Beständen mit bekannten CFU-Titer zu verwenden. Um Stammkulturen vorzubereiten, Kultur Mtb in Middlebrook 7H9-Bouillon mit OADC (Oleic ergänztSäure, Albumin, Dextrose, Catalase) Anreicherungsmedium und 0,05% Tween 80, eine Kohlenstoffquelle für Mykobakterien und messen, um bakterielle Verklumpung in der gleichen Zeit zu vermeiden. Kulturen sollte eine OD ≤ 1 haben zum Zeitpunkt der Ernte. Bei höheren OD, bakterielle Verklumpung Steigerungen und Rentabilität sinkt. Shop 1 ml Aliquots bei -80 ° C Bestimmung der Zahl der lebensfähigen koloniebildenden Einheiten (CFU) in gefrorenem Bestände durch Plattieren eine Reihe von 10-fachen Verdünnungen von drei unabhängigen Fläschchen auf 7H11-Agarplatten mit 0,5% Glycerin, 1 g / l Asparagin supplementiert, und OADC und aufzuzählen Kolonien nach 4 Wochen Inkubation bei 37 ° C. Führen Aerosol-Infektion, wie nachstehend beschrieben. Tauwetter Mtb Aktien von bekannten CFU-Titer und vorsichtig mischen die Suspension fünf Mal, um Bakterienklumpen zu zerstreuen mit einer 1-ml-Spritze mit einer 27 G-Nadel ausgestattet. Vermeiden Sie die Produktion von Aerosolen. Abhängig von der gewünschten Infektionsdosis, übertragen Sie die erforderliche Volumen des Aktien Mykobakterien inEin 50 ml-Röhrchen mit sterilem PBS. Das Endvolumen beträgt 6 ml. Hinweis: Durch Variieren der Anzahl der Mikroorganismen in dieser Suspension der Anteil der tragenden Bakterien Aerosoltröpfchen variiert. Wir streben in der Regel einer Aufnahme von 100 lebensfähigen Bazillen pro Lunge (Niedrigdosis-Infektion). Nach unserer Erfahrung erfordert dies etwa 1-2 x 10 6 MTB / ml in einem Gesamtvolumen von 6 ml davon 5,5 ml vernebelt werden (siehe unten). Es wird empfohlen, eine Reihe von Versuchsaerosol Herausforderungen mit verschiedenen Konzentrationen von Bakterien zu tun, um die idealen Bedingungen für Ihre Infektion zu finden. Während Hochdosis-Infektionen mit bis zu 5.000 Mykobakterien kann getan werden, um die Geschwindigkeit des Infektionsprozesses, so wenig wie 5 Bakterien verwendet, um Mäuse zu infizieren erfolgreich durch Aerosol werden. Die Infektionsrate ist in der Regel 100%. Entfernen einer ausreichenden Menge (über Endvolumen erforderlich hergestellt) für die Beschichtung um das Inokulum Titer zu bestimmen, haben wir normalerweise entfernen 500 ul technischer Triplikaten plattieren. Zeigen Tiere inein Fächergitterkorb (eine Maus pro Korb) innerhalb der kreisförmigen Aerosolkammer und schließen Sie den Deckel der Aerosolkammer. HINWEIS: Andere Modelle sind mit einem tortenförmigen Korb von fünf Einzelfächer, die jeweils 20 Mäusen zusammenzubringen ausgestattet. Befestigen Sie den Venturi-Vernebler Einheit zu den drei Edelstahl-Kugelgelenke. Entfernen der mykobakteriellen Suspension aus dem 50-ml-Röhrchen mit einer 10-ml-Spritze mit einer 18 G Nadel stumpf angebracht und tragen die Spritze in der Aerosolkammer in eine geschlossene Transportbox. Entfernen Sie den Schraubverschluss des Zerstäubers Einheit und sorgfältig spritzen die Mykobakterien Suspension in den Vernebler. Vermeiden Sie die Entstehung von Aerosolen. Entsorgen Sie die Spritze in einen Behälter für scharfe Gegenstände, die 2% Buraton. Verschließen Sie den Vernebler mit dem Schraubverschluss. Schalten Sie den Hauptnetzschalter und der UV-Lampe. Die Anzeige auf der Steuertafel zeigt "Glas-Col Apparat Co". Drehen Sie den Programmschalter auf. Das Display wirdShow "ist der Zerstäuber bereit?" "Ist der Korb eingelegt?" Drücken Sie die Eingabetaste, wenn Sie fertig. " Drücken Sie die Eingabetaste. Das Display zeigt "Enter rmen Zeit 900", das bedeutet, die Vorheizzeit für die Verbrennungsanlage (die die Abluft dekontaminiert) beträgt 900 Sekunden. Drücken Sie die Eingabetaste. Das Display zeigt "Enter Vernebelungszeit 1800", das heißt, die Zeit, Vernebeln 1.800 Sek. als Standard eingestellt ist. Um die Vernebelungszeit zu verlängern, geben Sie "2400", und drücken Sie die Eingabetaste. HINWEIS: Während der Vernebelungszyklus, Druckluft zerstäubt die Aufhängung, wodurch kleine Aerosoltröpfchen Mykobakterien enthalten. Mit dem Hauptluftstrom, werden diese Tröpfchen (etwa 2-5 um Grße) in die Aerosolkammer durchgeführt. Das Display zeigt "Enter CD-Zeit 1800", das bedeutet, dass der Zerfall Zyklus dauert 1,800 Sekunden. Auf "2400", und drücken Sie die Eingabetaste. HINWEIS: Während dieses Zyklus, Die Wolke, die gebaut wurde up in der Aerosolkammer während der Vernebelungszyklus kann zerfallen. Die kleinen Tröpfchen werden durch die Versuchstiere eingeatmet. Das Display zeigt "Enter Dezember Zeit 900", das bedeutet, dass das UV-Licht Dekontaminationszyklus 900 Sekunden dauern. Drücken Sie die Eingabetaste. Die Maschine startet Radfahren durch Vorwärmen, Vernebeln, Cloud-Zerfall und UV-Dekontamination. ACHTUNG: Die Vakuum-Durchflussmesser sollte anzeigen, 60 Kubikmeter / h (zu überprüfen, wenn Vorheizzyklus beginnt; anzupassen Unterdrucksteuerventil, wenn nötig) und die Druckluft-Durchflussmesser 10 Kubikmeter / h (zu überprüfen, wenn Vernebelungszyklus beginnt, entsprechend anzupassen Luftsteuerventil ). Wenn der Zyklus abgeschlossen ist, wird das Tastenfeld zeigen "Process Complete – entfernen Specimen". Schalten Sie das Programm, UV-und Hauptstromschalter. Prüfen Sie, ob die Mykobakterien Suspension wurde komplett vernebelt worden, und wenn nicht, notieren Sie die verbleibende Volumen durch vorsichtiges Entfernen der Suspension mit einer entsprechenden Spritze mit eingebauteine 18 G stumpfen Nadel. Das Restvolumen ist nicht mehr als 1 ml betragen. Nehmen Sie den Zerstäuber aus den Fugen und legen Sie sie in einer Pfanne mit 2% Buraton für mindestens 2 Stunden, ist in der Regel Desinfektions O / N. getan Anschließend übertragen Sie den Zerstäuber zu einem frischen Pfanne und gründlich mit Wasser abspülen. Lassen Vernebler an der Luft trocknen. Öffnen Sie die Aerosolkammer und Rück Tiere in ihre Käfige. Tasche die Körbe in Autoklaven Taschen und Autoklaven. Wischen Sie die Oberflächen der Innenseite der Aerosolkammer mit 2% Buraton. HINWEIS: Aus Sicherheitsgründen sollte ein Gebläsefiltergerät während dieser Prozedur getragen werden. Mit den verbleibenden 500 ul der Mykobakterien-Suspension (siehe Schritt 1.3) Platte 10-fach Verdünnungen eines technischen dreifacher Ausfertigung (3 x 100 ul) auf 7H11-Agar-Platten. 2. Stellen Sie sicher, Aufnahme von Wunsch CFU in Lunge Einen Tag nach der Aerosol-Infektion von Versuchstieren festzustellen, die bakterielle loAnzeige in den Lungen der Kontrolltiere bezeichnet, um die Aufnahme des gewünschten CFU zu überprüfen. HINWEIS: Wir bezeichnen in der Regel eine zusätzliche Gruppe von 3-5 Mäusen für Tag 1 CFU Bestimmung. Um den Verlauf der Mtb-Infektion im Laufe der Zeit zu überwachen, kann der Mykobakterien Gewebebelastung durch Plattierung serielle Verdünnungen der ganzen Organhomogenaten für CFU Bestimmung untersucht werden. Die Lunge ist der primäre Ort für Krankheitsmanifestation bei Tuberkulose jedoch Milz, der Leber und der Lymphknoten in der Regel entsprechend ausgewertet. Die Verdünnungen plattiert werden, hängt von der erwarteten mykobakteriellen Belastung in den Organen, die von der anfänglichen Inokulum (niedrige Dosis gegen hohe Dosis), die Erhöhung der Gewebe sowie auf das Organ und dem Zeitpunkt zu erhalten, um verschiedene bakterielle Belastungen hängen analysiert werden. Bei niedriger Dosierung Infektionen, die bakterielle Belastung von Mtb H37Rv in der Lunge der Regel erreicht ein Plateau zwischen Tag 25-30. Zeigen eingeschläfert Tiere (Euthanasie: CO 2-Erstickung oderTerminal Anästhesie) auf saugfähigem Papier auf einem Seziertisch Bord in einer Klasse II Biosicherheitswerkbank und desinfizieren Mäuse mit 70% Ethanol. HINWEIS: 70% Alkohol ist nur für Oberflächenkontamination und wird nicht Mtb töten. Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Mitte des Bauches und Einfahren der Maus Haut über dem Kopf. Öffnen Sie den Bauch und den Brustkorb mit chirurgischer Schere und entfernen Sie die Brustwand, so dass die Lunge zugänglich sind. Entfernen Sie die Lungen und übertragen in einen 15-ml-Tube mit Homogenisationspuffer (steriles Wasser / 1% v / v Tween 80/1% w / v Albumin). Verwendung der Kolben einer 5 ml Spritze Stamm Lunge durch 100-um-Sieben in eine kleine Petrischale. Flush Sieben mehrmals mit einer 1 ml-Pipette mit einer Barriere ausgestattet Spitze und verteilen Sie die Lungenhomogenat unter 8-Agar-Platten (ca. 250 ul / Platte;. Sicherzustellen, dass sie eine gut getrocknete Oberfläche haben). Sorgfältig mit Einweg Treuer, die in 2% verworfen Platte der ProbenBuraton. Lassen Agar-Platten im Schrank, um zu trocknen. Verschließen Sie jede einzelne Platte mit Parafilm, in Alufolie wickeln und Inkubation aufrecht bei 37 ° C für mindestens 4 Wochen. 3. Bau von Escape-Beweis Moskitokäfige Nager Plasmodium-Stämme sind nicht schädlich für den Menschen. Da jedoch Mtb-infizierten Mäusen sind die Empfänger des Parasiten und die Arbeit wird unter BSL 3 Bedingungen erfolgen, sind Maßnahmen erforderlich, um die Mücken aus ihren Käfigen entkommen zu verhindern. Abhängig von der geplanten Infektion Regime, autoklavierbar und wiederverwendbare Metallrahmen Käfigen oder selbstgemachte Einwegkäfige verwendet werden. Letztere sind zu empfehlen, wenn von Biss Infektion von Versuchstieren erforderlich ist, um durch eine definierte Anzahl von Mücken pro Maus durchgeführt werden. Wenn selbstgemachte Käfige benötigt werden, vorzubereiten Käfige genauen Spezifikationen wie die Gesundheit der Mücken und die Sicherheit des Labor hängt von ihrer sound Bau (Abbildung 2). Nehmen Sie einen Karton, wie eine halbe Portion Eis Karton oder Papier, Kaffeetasse (Abbildung 2). Schneiden Sie eine kleine Öffnung in die Seite des Kartons und decken mit einer Doppelschicht aus Latex mit einem Schlitz in jedem Stück geschnitten, um einen sicheren Eingang für die Moskitos zu schaffen. HINWEIS: Die Öffnung hat eine Gesamtgröße von 2 cm x 2 cm, ist der Schlauch (Saugvorrichtung), die wir nutzen, um in zu bringen und / oder Take-out Mücken eine modifizierte 15 ml Falcon-Röhrchen mit einer Vakuumpumpe angeschlossen und dient somit als eine Saugvorrichtung mit einem Durchmesser von 1,5 cm. Kleben Sie ein Stück Filterpapier auf der Innenseite Boden des Kartons zu tanken tropft. Verschließen Sie Eisbecher mit Netz (Doppelschicht aus Nylon-Mesh-Größe 1 mm x 1 mm) und zu beheben, um den Karton mit Klebeband und Gummiband. Für Infektionsversuche, bei denen definierte Anzahl von Mücken pro Maus erforderlich sind, bereiten Käfige mit 10-15 infizierten Mücken, enthält jede von denen idealerweise einen avschnittlich 10.000 Wildtyp-Speicheldrüse P. berghei Sporozoiten. Idealerweise verhungern Mücken für 24 Stunden vor der Durchführung der Blutmahlzeit. 4. Malaria-Infektion von Mäusen durch Mückenstich Das Nagetier Malaria-Parasiten hier verwendet, ist P. berghei jedoch andere Nager Plasmodium-Stamm von Interesse verwendet werden. Um Infektions Mücken erhalten für Sporozoiten-Übertragung der gesamte Lebenszyklus des Parasiten ist in beiden Wirbeltierwirt (Maus) und der Mücke erhalten. Parasite Wartung wird in einem Insektarium durchgeführt. Für natürliche Übertragungsversuche, sollte die minimale Anzahl von Sporozoiten pro Speicheldrüse nicht weniger als 10.000 sein. Für detaillierte Protokolle über Parasiten Wartung verweisen wir auf Methoden in der Malaria-Forschung von Moll et al. 2013. Betäuben naiven Mäusen oder Tieren 40 Tage preinfected mit MTB mit Ketamin (100 mg / kg)und Xylazin (7 mg / kg)-Lösung durch intraperitoneale Injektion (200 &mgr; l / Maus). HINWEIS: Die Zeit zwischen Mtb und Plasmodium-Infektion kann in Abhängigkeit von der zugrunde liegenden Fragestellung angepasst werden. Ebenso kann die Reihenfolge der Erreger Herausforderungen umgekehrt werden kann, dh Mäuse, um Infektionsmückenstich vor Mtb-Infektion ausgesetzt werden. Zeigen betäubt Mäuse auf die Verrechnung der Moskitokäfige (eine Maus pro Käfig für Moskito definiert Moskito Maus-Verhältnis) und damit die Mücken durch die Membran für 10-15 min zu ernähren. HINWEIS: Die Anwesenheit von Blut in den Moskito Mut bedeutet, Fütterung und somit Sporozoiten-Übertragung. Übertragen Mäuse wieder in ihre Käfige und überwachen ständig, bis sie aus der Narkose aufwachen. HINWEIS: Platz Mäuse auf Papiertuch und nicht auf Einstreu (Erstickungsgefahr) und warm halten (Ort eng zusammen und decken Körper mit Papiertuch). Töte die Moskitos durch Besprühen mit 70% Ethanol oder andere Desinfektionsmittel durch die nettoten des Käfigs. Autoklav Käfige und verwerfen, wenn Einweg diejenigen eingesetzt wurden. 5. Überwachung Parasitämie Puncture Schwanzvenen ganz am Ende mit einer Nadel und sammeln ein Tropfen Blut an jedem Ende der Rutsche. Verwenden Sie eine andere Folie, um einen Tropfen Blut mehr als die Hälfte der Länge des Objektträgers zu ziehen. Flip über dem Spreizer, um die andere Kante zum zweiten Abstrich zu verwenden. Die Objektträger an der Luft trocknen. Giemsa-Färbung Legen Sie Folien in der Folienhalter und fixieren die Blutausstriche durch kurzes Eintauchen in absolutem Methanol. HINWEIS: Da die Verwendung von Glaswaren sollten mindestens in der BSL 3 gehalten wir Polypropylen Küvetten für alle Lösungen werden. Tauchen Sie die Abstriche in Giemsa (1:10 in VE-Wasser). Nach 10 Minuten tauchen die Folien in die und aus der Färbung Küvetten mit VE-Wasser ein paar Mal gefüllt zu spülen die überschüssige Fleck. Schließlich Luft trocknen Folien in einer senkrechten Position. ALTERNATIVE FLECK: Wright & #180; s Fleck Auflösen Wright-Färbung bei einer Konzentration von 1 mg / ml in Methanol. Filter durch Faltenfilter vor der Verwendung. Tauchen Sie die Blutausstriche in Farblösung und Inkubation für 4 min (HINWEIS: Methanol-Fixierung von Abstrichen ist nicht notwendig, da die Farblösung Methanol basiert). Durch Spülen Dias waschen in VE-Wasser, wie oben beschrieben und lassen gleitet an der Luft trocknen. Sobald Giemsa / Wright-Färbung abgeschlossen ist, übertragen Sie leicht alle in eine Buraton haltigen Verfügung Topf verwendeten Reagenzien. Blutausstrich-Analyse Analysieren gefärbten Blutausstrichen durch Lichtmikroskopie bei einer 100-fachen Vergrößerung mit Ölimmersion. Graf nicht infizierten und infizierten Erythrozyten in einem Bereich des Blutabstrich, wo Erythrozyten werden in einer Monoschicht angeordnet. Um eine gut definierte Parasitämie zu erreichen, zählen mindestens 10 verschiedene Sichtfelder Anzeige eines Erythrozyten-Monoschicht. Calculaß die relative Parasitämie (in%) durch Dividieren der Anzahl der parasitierten Erythrozyten durch die Anzahl der Erythrozyten und mit 100 multipliziert.