Вскрытие и боковая навеска из эмбрионов данио рерио: Анализ спинномозговой развития шнура
Summary
С развитием процессы, такие как пролиферация, структурирование, дифференциации и аксонов может быть легко смоделированы в данио спинного мозга. В этой статье мы опишем монтажный порядок эмбрионов рыбок данио, которая оптимизирует визуализацию этих событий.
Abstract
Данио спинного мозга является эффективным следственная модель для исследования нервной системы по нескольким причинам. Во-первых, генетический, трансгенные и Нокдаун гена подходы могут быть использованы для изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе развития нервной системы. Во-вторых, крупные кладки умственно синхронизированных эмбрионов обеспечить большие экспериментальные размеры выборки. В-третьих, оптическая прозрачность из рыбок данио эмбриона позволяет исследователям визуализировать прародителя, глиальных и популяции нейронов. Хотя эмбрионы рыбок данио прозрачны, толщина образца может препятствовать эффективной микроскопический визуализации. Одной из причин этого является разработка тандем спинного мозга и вышележащих сомитов ткани. Другой причиной является большая желток мяч, который по-прежнему присутствует в периоды раннего нейрогенеза. В этой статье мы покажем, микродиссекции и удаление желтка в основной эмбрионов, что позволяет микроскопический визуализацию при сохранении окружающей сомитов ткани. Мы ALSо демонстрируют полупостоянные монтаж эмбрионов рыбок данио. Это позволяет наблюдать развитие нервной системы в спинно-вентральной и передне-задней оси, как он сохраняет трехмерность ткани.
Introduction
Визуализация спинного мозга у данио ингибируется от ряда факторов. Из-за толщины вышележащих сомитов и внутренней расположения спинного мозга, значительно длиннее расстояние требуется для высокой клеточной разрешении. Желток мяч (который по-прежнему присутствует на ранних стадиях нейрогенеза) еще больше увеличивает рабочее расстояние, необходимое, и легко повреждается давлением со стороны покровного стекла. Кроме того, мусор из поврежденного желтка запрещает четкую визуализацию тканей. Хотя сечения в спинно-вентральной (DV) оси возможны, они не всегда допускают одновременной визуализации в передне-задней (AP) оси 1.
Для преодоления этих препятствий, эмбрионы расчленены и установлен на слайдах. Эта процедура обеспечивает несколько преимуществ. Во-первых, эмбрионы рыбок данио легко лечь с боковой стороной вверх, что облегчает AP оси визуализации. Во-вторых, удаление желтка балл уменьшается необходимое рабочее расстояние, и ограничивает мусора. В-третьих, эта монтажная процедура позволяет люминесцентными лампами и микроскопии по методу светлого. В-четвертых, установлены эмбрионы являются стабильными в течение нескольких месяцев при 4 ° С, что позволяет длительное образец визуализации. Наконец, прогрессирование развития происходит в том, что передних сегментах являются более зрелыми, чем задних сегментах. Для того, чтобы гарантировать, что в постановке подобранные спинного hemisegments сравниваются между эмбрионов, перекрывающих сомит ткани используется в качестве ориентира. Например, десятым самым задней сомит перекрывает десятую спинного hemisegment, который является развитием эквивалент в эмбрионов на стадии соответствием. Это монтажа процедура интактных эмбрионов позволяет легко идентифицировать сомитах.
Мы используем генетики и генной нокдаун технологии для изучения механизмов аксонов в развивающихся спинного мозга. В частности, мы определили, что Robo2, Robo3 и ДКК необходимы для комиссуральных первичной ASCEнахождении (Кубок) Аксон поиска пути. Используя монтажный процедуру, описанную здесь, мы смогли изучить вентральной рост, средней линии пересечения, ширина спайки, спинной и переднюю 2,3 роста. Это монтажа процедура также может быть применен к DV или AP паттерна спинного мозга. Мы использовали эту процедуру, чтобы определить, разрозненные роли вниз по течению Wnt эффекторов в DV паттерна спинного мозга. Используя эту установку, мы смогли получить разрешение DV маркеров на уровне одной клетки, и определить мельчайшие структурирование сдвиги в результате измененного Wnt приема сигнала 4,5. Это монтажа процедура также позволяет расчета индекса митотический через анти-phosphohistone 3 или BrdU маркировки (пролиферация предшественников) дифференцирования 5.
Protocol
Representative Results
Discussion
Боковой монтаж основного эмбрионов данио вспомогательной визуализации развития спинного мозга. Через удаления желтка мяч, рабочее расстояние, необходимое для исключительного микроскопических изображений снижается. Наши репрезентативные результаты были ограничены до стадии 24 HPF, однако, этот метод может быть использован в начале 18 часов после оплодотворения, хотя ранее эмбрионы более трудно анализировать из-за размера эмбриона и хрупкости ткани. Этот метод также применим к эмбрионов старше 24 часов после оплодотворения. При содействии оптической ясности эмбрионального рыбок данио, способности выполнять вперед генетические экраны, обратной генетики, и трансгенных подходов, несколько процессов развития могут быть исследованы. Это включает в себя митотических индексов нейронных клеток-предшественников с маркерами, как BrdU и анти-фосфо-гистона 3 4-6 и структурирование через выражение нейронных и глиальных маркеров предшественников в чел, NKX, DBX и Olig Familieс 1,4-6. Реагенты, которые сообщают глиальных и нейронов определение (например, глиальных белков фибриллярные кислоты (GFAP) и HUC / D) 1,4,5,10 может быть использован. Дифференцировку нейронов подтип могут быть проанализированы с помощью выражения островок, VSX, engrailed и генов-Гата 1,4-6. И, наконец, анализ аксонов можно через антител, таких как анти-ацетилированного тубулина, 3A10, и ZnP-1 2,11,12. Хотя другие позвоночных модельных систем (мыши и цыпленок) используются для изучения развития спинного мозга, только рыбок данио позволяет одновременно просматривать всех осей развития в неповрежденной эмбриона.
Очевидным ограничением этого подхода является то, что эмбрионы фиксируются, что исключает живого изображения. В самом деле, удаление (или повреждения) результатов желтка в быстром эмбриональной смерти, таким образом, это не возможно, чтобы уменьшить рабочее расстояние в живых эмбрионов с помощью этой техники. Тем не менее, с большим увеличением спинного сой томография в живых эмбрионов можно. Для того чтобы сохранить желток в течение живого изображения, эмбрионы могут быть помещены в депрессии слайдов, которые обеспечивают большее пространство между образцом и покровное. Кроме того, несколько 22 мм х 22 мм покровные можно приклеить на любой слайд в 3 х 1 в предметное стекло. Покровные стекла служить «мостом» для вышележащих покровное. Если эмбрионы старше 18 оплодотворения, Tricaine используется для обезболивания эмбрионов, чтобы предотвратить движение. В то время как рабочее расстояние 0,288 мм требуется для deyolked эмбрионов на 24 часов после оплодотворения, при работе с живых эмбрионов, внедренных в агарозы, с неповрежденными желтков, микроскопический объектив с рабочим расстоянием 3,3 мм достаточно. Кроме того, эксплантов культуры, полученные из эмбрионов deyolked могут быть визуализированы с помощью метода иммобилизации плазма сгустка 13. Различные популяции клеток можно наблюдать с использованием генетически кодируемых флуоресцирующих белков, таких как GFP, mCherry, или фотопроводимостиконвертируемых краситель Kaede (назвать несколько). Кроме того, флуоресцентно меченые клетки в пределах химерных эмбрионов можно также рассматривать с таким подходом 14.
Последовательное монтажа техника, которая является стабильной в течение нескольких месяцев является важным инструментом для развития и клеточных биологов. Этот простой метод является воспроизводимым, что позволяет легко сравнивать различные экспериментальных испытаний. Кроме того, выравнивание эмбрионов в строках легко позволяет идентифицировать конкретные эмбрионов для последующего анализа.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Skidmore факультет Грант развития финансировал подготовку и публикацию этой рукописи.
Materials
|
Petri dishes 35mm X 10mm |
VWR |
25373-041 |
|
Dumont Forceps #3 |
Fisher Scientific |
NC9839169 |
|
Cover glass |
Fisher Scientific |
12-541-B22X22-1.5 |
|
Slides |
Fisher Scientific |
12-550-343 |
|
SlowFade Gold |
Fisher Scientific |
S36936 |
|
ProLong Gold |
Life Technologies |
P36934 |
|
Petroleum Jelly |
Any grocery store |
|
|
Loop Holders |
VWR |
80094-482 |
|
Insect Pins |
Fine Science Tools |
26002-10 |
|
Nickel Plated Pin Holders |
Fine Science Tools |
26016-12
|
|
Name of Equipment |
Company |
Catalog number |
|
Olympus Stereo microscope |
Olympus |
SZ61 |
References
- Gribble, S. L., Nikolaus, O. B., Dorsky, R. I. Regulation and function of Dbx genes in the zebrafish spinal. Dev. Dyn. 236 (12), 3472-3483 (2007).
- Bonner, J., et al. Midline crossing is not required for subsequent pathfinding decisions in commissural neurons. Neural Dev. 7 (1), 18 (2012).
- Ross, A. B. J. Activation of Wnt signaling using Lithium Chloride: Inquiry-Based Undergraduate Laboratory Exercises. Zebrafish. , (2012).
- Bonner, J., et al. Proliferation and patterning are mediated independently in the dorsal spinal cord downstream of canonical Wnt signaling. Dev. Biol. 313 (1), 398-407 (2008).
- Gribble, S. L., et al. Tcf3 inhibits spinal cord neurogenesis by regulating sox4a expression. Development. 136 (5), 781-789 (2009).
- England, S., et al. Roles of Hedgehog pathway components and retinoic acid signalling in specifying zebrafish ventral spinal cord neurons. Development. 138 (23), 5121-5134 (2011).
- Challa, A. K., Beattie, C. E., Seeger, M. A. Identification and characterization of roundabout orthologs in zebrafish. Mech Dev. (1-2), 101-101 (2001).
- Lee, J. S., Ray, R., Chien, C. B. Cloning and expression of three zebrafish roundabout homologs suggest roles in axon guidance and cell. 221 (2), 216-230 (2001).
- Downes, G. B., Waterbury, J. A., Granato, M. Rapid in vivo labeling of identified zebrafish neurons. Genesis. 34 (3), 196-202 (2002).
- Kim, H., et al. Notch-regulated oligodendrocyte specification from radial glia in the spinal cord of zebrafish embryos. Dev. Dyn. 237 (8), 2081-2089 (2008).
- Sylvain, N. J., Brewster, D. L., Ali, D. W. Zebrafish embryos exposed to alcohol undergo abnormal development of motor neurons and muscle fibers. Neurotoxicol. Teratol. 32 (4), 472-480 (2010).
- de Soysa, T. Y., et al. Macondo crude oil from the Deepwater Horizon oil spill disrupts specific developmental processes during zebrafish embryogenesis. BMC Biol. 10 (40), (2012).
- Langenberg, T., Brand, M., Cooper, M. S. Imaging brain development and organogenesis in zebrafish using immobilized embryonic explants. Dev Dyn. 228 (3), 464-474 (2003).
- Deschene, E. R., Barresi, M. J. Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation. J. Vis. Exp. (31), (2009).
