Dissection und seitlicher Anbau von Zebrafisch-Embryonen: Analyse der Rückenmarksentwicklung
Summary
Entwicklungsprozesse wie Proliferation, Strukturieren, Differenzierung und Axon Führung leicht im Zebrafisch Rückenmark modelliert werden. In diesem Artikel beschreiben wir ein Verfahren zur Montage Zebrafisch-Embryonen, die Visualisierung dieser Ereignisse optimiert.
Abstract
Der Zebrafisch Rückenmark ist eine effektive Untersuchungsmodell für Systemforschung Nerven aus mehreren Gründen. Erstens kann genetische, transgene und Gen-Knockdown Ansätze genutzt werden, um die molekularen Mechanismen, die der Entwicklung des Nervensystems zu untersuchen. Zweitens großen Fängen der entwicklungs synchronisiert Embryonen bieten großen Versuchsprobengrößen. Drittens, die optische Klarheit des Zebrafischembryos erlaubt Forschern Vorläufer, glialen und neuronalen Populationen zu visualisieren. Obwohl Zebrafischembryonen transparent sind, können Probendicke wirksam mikroskopische Visualisierung behindern. Ein Grund dafür ist die Entwicklung von Tandem-Rückenmark und darüberliegenden Gewebe Somiten. Ein weiterer Grund ist die große Dotterkugel, die noch in Zeiten der frühen Neurogenese vorliegt. In diesem Artikel zeigen wir, Mikrodissektion und die Entfernung der Dotter in festen Embryonen, die mikroskopische Visualisierung ermöglicht es, während das umliegende Gewebe Somiten. Wir ALSo zeigen, semipermanente Befestigung von Zebrafischembryonen. Dies ermöglicht eine Beobachtung der Entwicklung des Nervensystems in den dorso-ventralen und anterior-posterioren Achsen, da sie die Dreidimensionalität des Gewebes bewahrt.
Introduction
Visualisierung des Rückenmarks im Zebrafisch ist durch eine Anzahl von Faktoren gehemmt. Aufgrund der Dicke der darüberliegenden Somiten und der inneren Lage des Rückenmarks ist eine beträchtlich lange Arbeitsabstand für Hochzellauflösung erforderlich. Der Dotterkugel (die noch während der frühen Stadien der Neurogenese vorhanden ist) erhöht weiter die erforderlichen Arbeitsabstand und ist leicht durch Druck von einem Deckglas beschädigt. Außerdem Trümmer von beschädigten Eigelb verbietet klare Visualisierung von Geweben. Obwohl Querschnitte in den dorso-ventralen (DV) Achse möglich sind, sie nicht leicht eine gleichzeitige Visualisierung in der anterior-posterior (AP) Achse 1.
Um diese Hindernisse zu überwinden, werden Embryonen präpariert und auf Objektträger aufgebracht. Dieses Verfahren bietet mehrere Vorteile. Erstens liegen Zebrafischembryonen leicht mit der lateralen Seite nach oben, die AP-Achse Visualisierung erleichtert. Zweitens die Entfernung des Eigelbs ball verringert die erforderlichen Arbeitsabstand und begrenzt Schutt. Drittens erlaubt sowohl für Fluoreszenz-und Hellfeldmikroskopie das Montageverfahren zu. Viertens sind montiert Embryonen Monate stabil bei 4 ° C, wodurch längere Probe Visualisierung. Schließlich, daß vorderen Segmente auftritt Fortschreiten der Entwicklung sind reifer als Zahnbereich. Um sicherzustellen, dass inszeniert abgestimmt Rücken hemisegments zwischen Embryonen verglichen wird, wird überlagert Somitengewebe als Richtlinie. Zum Beispiel liegt über der zehnte hintersten Somiten den zehnten Rücken hemisegment, die entwicklungs Äquivalent in der Stufe abgestimmt Embryonen ist. Dieses Montageverfahren von intakten Embryonen ermöglicht die einfache Identifizierung von Somiten.
Wir verwenden Genetik und Gen-Knock-down-Technologien, um die Mechanismen der Axon-Führung in der Entwicklung des Rückenmarks zu studieren. Insbesondere haben wir festgestellt, dass robo2, robo3 und DCC für Commissural Primär Asce erforderlichNding (COPA) Axon-Wegfindung. Mit der hier beschriebenen Montageverfahren, waren wir in der Lage, ventralen Wachstum, Mittellinienüberfahrt, commissure Breite, Rücken-und Vorder Wachstum 2,3 zu untersuchen. Dieses Montageverfahren kann auch auf DV-oder AP-Musterbildung des Rückenmarks eingesetzt werden. Wir haben dieses Verfahren verwendet, um unterschiedlichen Rollen von Wnt nachgeschalteten Effektoren in DV Strukturierung des Rückenmarks zu bestimmen. Mit dieser Montage, waren wir in der Lage, DV-Auflösung von Markern auf Einzelzellebene zu erhalten, und zu bestimmen, Minute Musterverschiebungen als Folge der veränderten Wnt-Signalempfang 4,5. Dieses Montageverfahren ermöglicht auch mitotische Indexberechnung durch anti-phosphohistone 3 oder BrdU-Markierung (Vorläufer Proliferation) 5 Differenzierung.
Protocol
Representative Results
Discussion
Seitlicher Anbau von festen Zebrafischembryonen Hilfen Visualisierung von Rückenmark-Entwicklung. Durch die Entfernung des Dotterkugel, wird der für außergewöhnliche mikroskopische Bildgebung erforderlich Arbeitsabstand reduziert. Unsere repräsentative Ergebnisse wurden mit der 24 hpf Stufe begrenzt, jedoch kann diese Technik schon HPF 18 verwendet werden, obwohl früher Embryonen sind schwieriger aufgrund der Größe des Embryos und der Zerbrechlichkeit des Gewebes zu sezieren. Diese Technik ist auch anwendbar auf Embryonen, die älter als 24 HPF. Durch die optische Klarheit des embryonalen Zebrafisch, der Fähigkeit, zukunfts genetischen Screens durchführen, Reverse Genetik und transgene Ansätze unterstützt, kann mehrere Entwicklungsprozesse untersucht werden. Dies beinhaltet Mitoseindices der neuronalen Vorläuferzellen mit Markierungen wie BrdU-und Anti-Phospho-Histon-März 4-06 und Strukturierung durch Expression von neuronalen und glialen Vorläufer Marker in der pax, nkx, dbx, und olig families 1,4-6. Reagenzien, Gliazellen und neuronale Bestimmung (wie gliafibrilläres-Protein (GFAP) und HuC / D) berichten 1,4,5,10 verwendet werden können. Neuronale Differenzierung Subtyp kann durch Expression von Insel, VSX, engrailed und gata 1,4-6 Gene analysiert werden. Und schließlich ist die Analyse der Axon Führung durch Antikörper, wie anti-acetyliertes Tubulin, 3A10 und ZNP-1 2,11,12 möglich. Obwohl andere Wirbeltiermodellsysteme (Maus und Küken) werden verwendet, um das Rückenmark Entwicklung zu studieren, nur der Zebrafisch erlaubt den gleichzeitigen Empfang von allen Entwicklungs Achsen in der intakten Embryo.
Die offensichtliche Einschränkung dieses Ansatzes ist, dass die Embryonen festgelegt sind, die die Live-Darstellung ausschließt. Tatsächlich Entfernen (oder Beschädigung) der Dotter führt zu einem schnellen Tod des Embryos, ist es somit nicht möglich, den Arbeitsabstand in lebenden Embryos unter Verwendung dieser Technik zu reduzieren. Allerdings hoher Vergrößerung Rücken Cord Bildgebung in lebenden Embryonen möglich ist. Um das Eigelb bei Live-Bildgebung zu erhalten, können Embryonen in Depression Dias, die einen größeren Abstand zwischen der Probe und dem Deckglas bieten platziert werden. Alternativ können mehrere 22 mm x 22 mm Deckgläsern auf beiden Schlitten in einer 3 x 1 in Objektträger geklebt werden. Die Deckgläser dienen als "Brücke" für die darüberliegenden Deckglas. Wenn Embryonen sind älter als 18 hpf ist Tricaine verwendet, um Embryonen zu betäuben, um die Bewegung zu verhindern. Während ein Arbeitsabstand von 0,288 mm für deyolked Embryonen bei 24 hpf erforderlich, wenn mit lebenden Embryonen in Agarose eingebettet, mit intakten Eidotter, eine Mikroskoplinse mit einem Arbeitsabstand von 3,3 mm ausreichend. Alternativ kann Explantatkulturen deyolked aus Embryonen gewonnen mittels eines Plasmagerinnsel Immobilisierungstechnik 13 visualisiert werden. Verschiedene Populationen von Zellen durch die Verwendung von genetisch kodierte fluoreszierende Proteine wie GFP, mCherry oder der photo beachtenWandel Kaede Farbstoff (um nur einige zu nennen). Ferner kann fluoreszenzmarkierten Zellen in chimären Embryonen auch mit diesem Ansatz 14 gesehen werden.
Eine konsequente Montagetechnik, die für Monate stabil ist, ist ein wichtiges Werkzeug für Zell-und Entwicklungsbiologen. Diese einfache Technik ist reproduzierbar, was eine einfache Vergleich zwischen verschiedenen experimentellen Studien. Ferner wird die Ausrichtung der Embryonen in Reihen leicht ermöglicht Identifizierung spezifischer Embryonen für eine spätere Analyse.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Skidmore Fakultät Entwicklungszuschuss finanziert die Erstellung und Veröffentlichung des Manuskripts.
Materials
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Petri dishes 35mm X 10mm |
VWR |
25373-041 |
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Dumont Forceps #3 |
Fisher Scientific |
NC9839169 |
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Cover glass |
Fisher Scientific |
12-541-B22X22-1.5 |
|
Slides |
Fisher Scientific |
12-550-343 |
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SlowFade Gold |
Fisher Scientific |
S36936 |
|
ProLong Gold |
Life Technologies |
P36934 |
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Petroleum Jelly |
Any grocery store |
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Loop Holders |
VWR |
80094-482 |
|
Insect Pins |
Fine Science Tools |
26002-10 |
|
Nickel Plated Pin Holders |
Fine Science Tools |
26016-12
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Name of Equipment |
Company |
Catalog number |
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Olympus Stereo microscope |
Olympus |
SZ61 |
References
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