La disección y de montaje lateral de embriones de pez cebra: Análisis para el Desarrollo de la médula espinal

Cuando elucidar los mecanismos que subyacen a diversos eventos de desarrollo tales como patrón celular, la diferenciación, y guía de axones, es importante ser capaz de visualizar las células en el contexto de su tejido. Defectos dorsoventral de modelado típicamente se presentan como un desplazamiento ventral o dorsal en el dominio de la expresión de factores de transcripción en el pax, nkx o familias dbx 4. A veces, los cambios pueden ser sutiles, que comprende sólo unos diámetros celulares 4. Análisis de corte transversal permite este tipo de análisis. Sin embargo, reactivos con las señales más débiles, o secciones transversales que no son perpendiculares al eje de AP pueden limitar la interpretación. Además, el análisis de la sección transversal no toma en cuenta fácilmente si los cambios persisten en el eje AP, y se basa en la disponibilidad de un criostato. Esta limitación se elude mediante vistas laterales de la médula espinal. Como se observa en la Figura 2B, Nkx6.1 ARNm es dISTRIBUIDO en aproximadamente la mitad ventral de la médula espinal en 24 horas después de la fecundación (HPF), dentro del dominio progenitora. Las células progenitoras son distinguibles de las células mitóticas mensaje debido a la presencia de la placa de piso, que se encuentra en la parte medial de la médula espinal. Visto con la óptica DIC, las células individuales son claramente distinguibles, y un límite definido entre la expresión y nonexpressing células es evidente. La salida del ciclo de células progenitoras se acompaña de cambios en la expresión génica. Por ejemplo, todas las neuronas post-mitóticas expresan HuC / D, que es detectable con 1,5 inmunocitoquímica. sondas de ARNm para los islotes, gata, y la familia VSX etiquetar las neuronas post-mitóticas específicos de posición coherente y número dentro de cada hemisegment médula espinal 6. Además, los receptores de orientación axón tales como los de la familia de robo se expresan en poblaciones restringidas de neuronas postmitóticas (Figura 2C) <sup> 2,7,8. Montaje lateral de embriones permite conteos precisos de las neuronas post-mitóticas. Del mismo modo, los progenitores que continúan dividiendo pueden cuantificarse con anti-fosfato histona 3 inmunocitoquímica, así como el etiquetado BrdU. Además, la muerte celular se puede evaluar con TUNEL etiquetado 4-6. A las 24 HPF, los axones de las neuronas siguientes postmitóticas pueden visualizarse con varios métodos, y se distinguen en el único nivel celular: Dorsal Lateral Ascendente (Dola), comisurales Primaria ascendente (COPA), comisurales Secondary ascendente (COSA), ventral longitudinal Descendente (Veld), Kolmer-Agdur (KA), comisurales bifurcar / longitudinales (COB / L), circunferencial Ascendente (CIA), circunferencial Descendente (CID), y Unipolar comisural Descendente (CM subyacente), Rohon-Barba (RB), las neuronas motoras ( M) 9. Los axones se extienden desde estas neuronas en la parte dorsal, ventral, anterior y posterior direcciones. Ellos rama, cruzan la línea media, y salen tanto de la dorsaly ventral de la médula espinal. Cuando se combina con microscopía confocal de barrido láser, estos diversos comportamientos celulares son evidentes en los embriones montados lateralmente, usando inmunocitoquímica y proteínas fluorescentes codificadas genéticamente, tales como GFP 2. En la Figura 2D, se utilizó ZNP-1 inmunocitoquímica para etiquetar motoneuronas en desarrollo. Motoneuronas salen de la médula espinal ventral para inervar la musculatura que rodea el desarrollo. Figura 1. La disección y lateral de montaje de embriones de pez cebra. (A) Después del procesamiento para inmunofluorescencia, hibridación in situ, etc, los embriones se colocan en un plato de Petri de 35 mm llena de PBT (PBS con 0,5% de Triton X-100) o PTW (PBS con 0,1% de Tween-20). La yemabola (YB) es evidente. (B) La yema se separa por asegurar la cabeza del embrión seguida de disección cuidadosa. (C) Un póquer embrión (línea de pesca pegado a una pipeta Pasteur) se utiliza para embriones separados y escombros yema de (D). Embriones limpiados se pipetean sobre un portaobjetos de microscopio (E) y alineados (F). Jalea (G) Petróleo se aplica a las esquinas de la cubreobjetos. (H) El cubreobjetos se coloca suavemente en la parte superior de los embriones en medio de montaje. Polaco (I) Nail se utiliza para sellar los bordes del cubreobjetos. Haga clic aquí para ver la imagen más grande . < strong> Figura 2. Análisis de los patrones de expresión de genes y axón pathfinding en montado lateralmente embriones de pez cebra. (A) Dibujo de un embrión de pez cebra en 24 HPF. En BD, aproximadamente cuatro hemisegments por encima de la extensión del saco vitelino se visualizan (área del recuadro). (B) Nkx6.1 se expresa en la médula espinal ventral, incluyendo la placa de piso (FP). (C) ROBO3 se expresa en las neuronas postmitóticas (PMN). La placa de suelo y progenitor zona no es evidente en este plano focal más lateral. En B, C, la médula espinal está delimitado por un soporte en la parte izquierda de la imagen. (D) microscopía confocal se utilizó para la imagen ZNP-1 de inmunofluorescencia, que las etiquetas de los axones motores que salen de la médula espinal ventral. En todas las imágenes, es anterior a la izquierda y dorsal es hacia arriba. A larga distancia de trabajo 40x, la inmersión en agua (NA 0.8) lente se utilizó (3,3 mm).oad/50703/50703fig2highres.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver la imagen más grande.