Dissezione e laterale Montaggio di embrioni di zebrafish: analisi dello sviluppo del midollo spinale
Summary
Processi di sviluppo quali la proliferazione, il modello, la differenziazione, e la guida degli assoni possono essere facilmente modellati nel midollo spinale zebrafish. In questo articolo, si descrive una procedura di montaggio per gli embrioni di zebrafish, che ottimizza la visualizzazione di questi eventi.
Abstract
Il midollo spinale zebrafish è un modello di indagine efficace per la ricerca del sistema nervoso per diverse ragioni. In primo luogo, gli approcci atterramento genetica, transgenici e geni possono essere utilizzati per esaminare i meccanismi molecolari alla base dello sviluppo del sistema nervoso. In secondo luogo, i grandi innesti di embrioni evolutivamente sincronizzati prevedono grandi misure sperimentali del campione. In terzo luogo, la chiarezza ottica dell'embrione zebrafish permette ai ricercatori di visualizzare progenitore, gliali e popolazioni neuronali. Anche se embrioni di zebrafish sono trasparenti, spessore del provino può impedire efficace visualizzazione microscopica. Una ragione di ciò è lo sviluppo tandem del midollo spinale e tessuto somite sovrastante. Un altro motivo è la grande palla tuorlo, che è ancora presente durante i periodi di precoce neurogenesi. In questo articolo, dimostriamo microdissezione e la rimozione del tuorlo di embrioni fisse, che permette la visualizzazione microscopica preservando il tessuto circostante somite. Noi also dimostrare montaggio semipermanente di embrioni di zebrafish. Questo permette l'osservazione dei neurodevelopment negli assi dorso-ventrale e antero-posteriore, in quanto conserva la tridimensionalità del tessuto.
Introduction
Visualizzazione del midollo spinale in zebrafish è inibita da una serie di fattori. Grazie allo spessore dei somiti sovrastanti e la posizione interna del midollo spinale, una distanza considerevolmente lungo lavoro è necessaria per alta risoluzione cellulare. La palla tuorlo (che è ancora presente durante le prime fasi di neurogenesi) aumenta ulteriormente la distanza di lavoro richiesto, ed è facilmente danneggiata da pressione da un vetrino. Inoltre, i detriti dal tuorlo danneggiato vieta chiara visualizzazione dei tessuti. Sebbene sezioni trasversali nelle (DV) asse dorso-ventrale sono possibili, non facilmente consentono la visualizzazione simultanea in antero-posteriore (AP) asse 1.
Per superare questi ostacoli, embrioni vengono sezionati e montate su vetrini. Questa procedura offre diversi vantaggi. In primo luogo, embrioni di zebrafish facilmente si trovano con la parte laterale rivolta verso l'alto, che facilita la visualizzazione asse AP. In secondo luogo, la rimozione del BAL tuorlol diminuisce la distanza di lavoro desiderata, e limita detriti. In terzo luogo, la procedura di montaggio consente sia a fluorescenza e microscopia in campo chiaro. Quarto, embrioni montati sono stabili per mesi a 4 ° C, consentendo la visualizzazione campione prolungato. Infine, la progressione di sviluppo si verifica in quanto segmenti anteriori sono più maturo di segmenti posteriori. Al fine di garantire che allestite hemisegments spinali abbinati sono confrontati tra embrioni, sovrastante tessuto somite viene utilizzato come guida. Ad esempio, il decimo somite più posteriore sovrappone il hemisegment midollo decimo, che è evolutivamente equivalente in embrioni fase corrispondenza. Questa procedura di montaggio degli embrioni intatti permette una facile identificazione dei somiti.
Usiamo la genetica e le tecnologie gene knock-basso per studiare i meccanismi di orientamento degli assoni in via di sviluppo midollo spinale. In particolare, abbiamo determinato che robo2, ROBO3 e DCC sono necessari per commissurale primaria Asceending (COPA) assone pathfinding. Utilizzando la procedura di montaggio descritta qui, siamo stati in grado di esaminare la crescita ventrale, attraversamento linea mediana, larghezza commissure, dorsale ed anteriore 2,3 crescita. Questa procedura di montaggio può essere applicata anche a DV o AP patterning del midollo spinale. Abbiamo utilizzato questa procedura per determinare ruoli disparati valle effettori Wnt in DV patterning del midollo spinale. Usando questo montaggio, siamo riusciti a ottenere la risoluzione di marcatori DV a livello di singola cellula, e determinare spostamenti patterning minute a seguito della ricezione del segnale alterato Wnt 4,5. Questa procedura di montaggio consente anche di calcolo dell'indice mitotico attraverso anti-phosphohistone 3 o etichettatura BrdU (progenitore proliferazione) differenziamento 5.
Protocol
Representative Results
Discussion
Montaggio laterale di zebrafish embrioni aiuti visualizzazione fisso di sviluppo del midollo spinale. Attraverso la rimozione del pallone tuorlo, la distanza di lavoro richiesto per eccezionali immagini microscopiche è ridotta. I nostri risultati rappresentativi sono stati limitati alla fase 24 HPF, tuttavia, questa tecnica può essere usato già 18 HPF, sebbene embrioni anteriori sono più difficili da sezionare a causa delle dimensioni dell'embrione e la fragilità del tessuto. Questa tecnica è applicabile agli embrioni di età superiore a 24 HPF anche. Aiutato dalla chiarezza ottica della zebrafish embrionale, la capacità di eseguire esami genetici avanti, genetica inversa, e gli approcci transgenici, diversi processi di sviluppo possano essere istruite. Questo include gli indici mitotici di progenitori neuronali con marcatori come BrdU e anti-fosfo-istone marzo 4-6 e patterning attraverso l'espressione di marcatori progenitrici neuronali e gliali nella pax, NKX, dbx, e olig families 1,4-6. Reattivi che riportano la determinazione gliali e neuroni (come proteina gliale fibrillare acida (GFAP) e Huc / D) 1,4,5,10 può essere utilizzato. Differenziazione sottotipo neuronale può essere analizzata attraverso l'espressione di isolotto, VSX, engrailed, ei geni gata 1,4-6. E, infine, l'analisi di guida degli assoni è possibile attraverso anticorpi come tubulina anti-acetilata, 3A10, e ZNP-1 2,11,12. Anche se altri sistemi modello vertebrato (mouse e pulcino) vengono utilizzati per studiare lo sviluppo del midollo spinale, solo il permesso di zebrafish visualizzazione simultanea di tutti gli assi di sviluppo nell'embrione intatto.
La limitazione evidente di questo approccio è che gli embrioni sono fissi, che esclude l'imaging dal vivo. Infatti, la rimozione di (o danni) i risultati tuorlo in rapida morte embrionale, quindi non è possibile ridurre la distanza di lavoro in embrioni vivi con questa tecnica. Tuttavia, alto ingrandimento co spinalerd immagini in embrioni vivi è possibile. Per conservare il tuorlo durante l'imaging in tempo reale, gli embrioni possono essere posizionati in diapositive depressione, che forniscono uno spazio più grande tra il campione e il coprioggetto. In alternativa, più 22 mm x 22 millimetri coprioggetto possono essere incollati su entrambi diapositiva di un 3 x 1 in preparati al microscopio. I coprioggetti servono come "ponte" per il coprioggetto sovrastante. Se gli embrioni sono più vecchi di 18 HPF, tricaine viene utilizzato per anestetizzare gli embrioni per impedire il movimento. Mentre è necessaria una distanza di lavoro di 0,288 millimetri per embrioni deyolked a 24 HPF, quando si lavora con embrioni vivi incorporati in agarosio, con tuorli intatti, una lente microscopica con una distanza di lavoro di 3,3 mm sono sufficienti. In alternativa, le culture espianto derivate da embrioni deyolked possono essere visualizzati con un coagulo di plasma tecnica di immobilizzazione 13. Varie popolazioni di cellule possono essere osservati attraverso l'uso di proteine fluorescenti geneticamente codificate come GFP, mCherry, o il photoconcolorante convertibili Kaede (per citarne alcuni). Inoltre, le cellule fluorescente all'interno embrioni chimerici possono essere visualizzati anche con questo approccio 14.
Una tecnica di montaggio coerente e stabile per mesi, è uno strumento fondamentale per i biologi dello sviluppo e cellulari. Questa tecnica semplice è riproducibile, che permette un facile confronto tra le diverse prove sperimentali. Inoltre, l'allineamento di embrioni in righe permette facilmente l'identificazione di embrioni specifici per una successiva analisi.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Skidmore Faculty Development Grant ha finanziato la preparazione e la pubblicazione di questo manoscritto.
Materials
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Petri dishes 35mm X 10mm |
VWR |
25373-041 |
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Dumont Forceps #3 |
Fisher Scientific |
NC9839169 |
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Cover glass |
Fisher Scientific |
12-541-B22X22-1.5 |
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Slides |
Fisher Scientific |
12-550-343 |
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SlowFade Gold |
Fisher Scientific |
S36936 |
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ProLong Gold |
Life Technologies |
P36934 |
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Petroleum Jelly |
Any grocery store |
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Loop Holders |
VWR |
80094-482 |
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Insect Pins |
Fine Science Tools |
26002-10 |
|
Nickel Plated Pin Holders |
Fine Science Tools |
26016-12
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Name of Equipment |
Company |
Catalog number |
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Olympus Stereo microscope |
Olympus |
SZ61 |
References
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