Dissecção e montagem lateral de embriões Zebrafish: Análise de Desenvolvimento da Medula Espinhal
Summary
Processos de desenvolvimento, tais como a proliferação, a modelagem, diferenciação, e a orientação do axónio pode ser facilmente modelada na medula espinal do peixe-zebra. Neste artigo, nós descrevemos um procedimento de montagem para os embriões de peixe-zebra, que otimiza a visualização destes eventos.
Abstract
A medula espinhal peixe-zebra é um modelo de investigação eficaz para investigação do sistema nervoso por várias razões. Primeiro, genética, transgénicos e de genes abordagens de knockdown pode ser utilizado para examinar os mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento do sistema nervoso. Em segundo lugar, as grandes garras de embriões developmentally sincronizados fornecem grandes amostras experimentais. Em terceiro lugar, a claridade óptica do embrião zebrafish permite aos pesquisadores visualizar progenitor, glial, e as populações neuronais. Apesar de embriões de peixe-zebra são transparentes, espessura da amostra pode impedir a visualização microscópica eficaz. Uma razão para isso é o desenvolvimento conjunto do tecido da medula espinal e somito sobrejacente. Outra razão é a grande bola de gema, que ainda está presente durante os períodos de neurogênese cedo. Neste artigo, demonstramos microdissecção e remoção da gema em embriões fixos, que permite a visualização microscópica do tecido circundante, preservando somito. Nós also demonstrar montagem semipermanente de embriões de peixe-zebra. Isto permite a observação de neurodesenvolvimento nos eixos dorso-ventral e ântero-posterior, uma vez que preserva a tridimensionalidade do tecido.
Introduction
A visualização da medula espinal no peixe-zebra é inibida por um número de factores. Devido à espessura de somitos sobrepostas e o local interno da medula espinal, a uma distância consideravelmente longo trabalho é necessário para alta resolução celular. A bola gema (que ainda está presente durante os primeiros estágios de neurogênese) aumenta ainda mais a distância de trabalho necessário, e é facilmente danificado pela pressão de uma lamela. Além disso, os restos de gema danificada proíbe clara visualização do tecido. Embora sejam possíveis cortes transversais no eixo dorso-ventral (DV), eles não são facilmente permitir a visualização simultânea no ântero-posterior (AP) Eixo 1.
Para superar esses obstáculos, os embriões são dissecados e montados em lâminas. Este procedimento proporciona vários benefícios. Primeiro, os embriões de peixe-zebra prontamente se deitar com a lateral voltada para cima, o que facilita a visualização do eixo AP. Em segundo lugar, a remoção da gema ball diminui a distância de trabalho necessário, e limita detritos. Em terceiro lugar, este processo de montagem permite tanto fluorescente e a microscopia de campo claro. Em quarto lugar, os embriões montados são estáveis durante meses a 4 ° C, permitindo a visualização exemplar prolongada. Finalmente, a progressão do desenvolvimento ocorre em que segmentos anteriores são mais maduros do que os segmentos posteriores. A fim de assegurar que encenadas hemisegments espinhais combinados são comparados entre os embriões, que recobre tecido somito é utilizado como um guia. Por exemplo, a décima somito mais posterior sobrepõe hemisegmento espinal décimo, o que é equivalente desenvolvente em embriões combinado da fase. Este procedimento de montagem de embriões intactos permite uma fácil identificação de somitos.
Usamos genética e genes tecnologias knock-down para estudar os mecanismos de orientação do axônio na medula espinhal em desenvolvimento. Em particular, nós determinamos que robo2, robo3, e DCC são necessários para comissural primária Ascending (COPA) pathfinding axônio. Usando o procedimento de montagem descrito aqui, fomos capazes de examinar o crescimento ventral, cruzamento da linha média, a largura da comissura, dorsal e 2,3 crescimento anterior. Este processo de montagem pode também ser aplicado para DV ou AP padronização da medula espinhal. Temos utilizado este procedimento para determinar os papéis díspares de efetores Wnt a jusante padronização DV da medula espinhal. Usando esta montagem, fomos capazes de obter resolução de marcadores DV no nível da célula única, e determinar mudanças padronização minutos como resultado da alteração da recepção do sinal Wnt 4,5. Este procedimento também permite a montagem para o cálculo do índice mitótico através de anti-phosphohistone 3 ou rotulagem BrdU (proliferação progenitor) diferenciação 5.
Protocol
Representative Results
Discussion
Montagem lateral de embriões Zebrafish auxiliares de visualização fixa de desenvolvimento da medula espinhal. Através da remoção da gema de bola, a distância de trabalho necessária para a imagem microscópica excepcional é reduzida. Os resultados representativos foram limitados à fase 24 hpf, no entanto, esta técnica pode ser usado tão cedo quanto 18 hpf, embora embriões precoces são mais difíceis de dissecar devido ao tamanho do embrião e a fragilidade do tecido. Esta técnica é também aplicável aos embriões mais velhos do que 24 hpf. Ajudado pela claridade óptica do peixe-zebra embrionário, a capacidade de executar telas genéticos para a frente, a genética reversa e abordagens transgênicas, vários processos de desenvolvimento podem ser investigadas. Isto inclui os índices de mitose de células progenitoras neuronais com marcadores como BrdU e anti-fosfo-histona 04-06 março e padronização através da expressão de marcadores progenitoras neuronais e gliais do pax, NKX, dbx, e oligo families 1,4-6. Reagentes que relatam determinação glial e neuronal (tal como a proteína glial fibrilar ácida (GFAP) e HuC / D) 1,4,5,10 pode ser usado. Subtipo diferenciação neuronal pode ser analisado através da expressão da ilhota, VSX, engrailed e genes gata 1,4-6. E, finalmente, a análise de orientação axónio é possível por meio de anticorpos, tais como anti-tubulina acetilada, 3A10, e ZNP-1 2,11,12. Embora outros sistemas modelo de vertebrados (mouse e galinha) são usados para estudar o desenvolvimento da medula espinhal, apenas o peixe-zebra permite a visualização simultânea de todos os eixos de desenvolvimento do embrião intacto.
A limitação óbvia para esta abordagem é que os embriões são fixas, que se opõe a uma imagem ao vivo. De facto, a remoção do (ou dano para) os resultados de gema de morte embrionária rápida, pelo que não é possível reduzir a distância de trabalho em embriões vivos utilizando esta técnica. No entanto, a alta ampliação co espinhalrd imagem em embriões vivos é possível. A fim de preservar a gema durante a imagem ao vivo, os embriões podem ser colocados em lâminas de depressão, que proporcionam um espaço maior entre a amostra e a lamela. Alternativamente, vários 22 milímetros x 22 milímetros lamelas podem ser colados ou deslizamento de um 3 em x 1 em lâminas microscópicas. As lamelas servir como uma "ponte" para a lamela sobrejacente. Se os embriões são mais velhos do que 18 hpf, tricaina é usada para anestesiar os embriões para evitar o movimento. Enquanto uma distância de trabalho de 0,288 milímetros é necessário para embriões deyolked em 24 hpf, quando se trabalha com embriões vivos incorporados em agarose, com gema intacta, uma lente microscópica com uma distância de trabalho de 3,3 mm é suficiente. Alternativamente, culturas de explantes derivados de embriões deyolked pode ser visualizada utilizando uma técnica de imobilização de coágulo de plasma 13. Várias populações de células podem ser observados através da utilização de proteínas fluorescentes codificados geneticamente, tais como a GFP, mCherry, ou o photoconcorante convertíveis Kaede (para citar alguns). Além disso, as células marcadas com fluorescência dentro embriões quiméricos também pode ser visto com esta abordagem 14.
A técnica de montagem consistente que é estável durante meses é uma ferramenta fundamental para os biólogos do desenvolvimento e celulares. Esta técnica simples é reprodutível, permitindo uma fácil comparação entre diferentes ensaios experimentais. Além disso, o alinhamento dos embriões em linhas prontamente permitir a identificação de embriões específicos para análise posterior.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Skidmore Faculdade Desenvolvimento Grant financiou a elaboração e publicação deste manuscrito.
Materials
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Petri dishes 35mm X 10mm |
VWR |
25373-041 |
|
Dumont Forceps #3 |
Fisher Scientific |
NC9839169 |
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Cover glass |
Fisher Scientific |
12-541-B22X22-1.5 |
|
Slides |
Fisher Scientific |
12-550-343 |
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SlowFade Gold |
Fisher Scientific |
S36936 |
|
ProLong Gold |
Life Technologies |
P36934 |
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Petroleum Jelly |
Any grocery store |
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Loop Holders |
VWR |
80094-482 |
|
Insect Pins |
Fine Science Tools |
26002-10 |
|
Nickel Plated Pin Holders |
Fine Science Tools |
26016-12
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Name of Equipment |
Company |
Catalog number |
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Olympus Stereo microscope |
Olympus |
SZ61 |
References
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