Dissection et montage latéral embryons de poisson zèbre: Analyse de la moelle épinière développement

Lorsque la compréhension des mécanismes qui sous-tendent divers événements de développement tels que la structuration cellulaire, la différenciation et le guidage axonal, il est important d'être en mesure de visualiser les cellules dans le contexte de leur tissu. Défauts dorso-ventral de motifs généralement présents comme un changement ventrale ou dorsale dans le domaine de l'expression des facteurs de transcription dans la pax, NKX, ou familles dbx 4. Parfois, les changements peuvent être subtils, comprenant seulement quelques diamètres de cellules 4. Analyse transversale permet ce type d'analyse. Toutefois, des réactifs avec des signaux plus faibles, ou des sections transversales qui ne sont pas perpendiculaires à l'axe AP peuvent limiter l'interprétation. En outre, une analyse transversale ne facilement prend pas en compte le fait que les changements persistent dans l'axe AP, et repose sur la disponibilité d'un cryostat. Cette limitation est contournée par des vues latérales de la moelle épinière. Comme on le voit sur ​​la figure 2B, Nkx6.1 ARNm est distributed à peu près la moitié ventrale de la moelle épinière à 24 h après la fécondation (HPF), dans le domaine de l'ancêtre. Les cellules progénitrices peuvent être distinguées des cellules post mitotiques en raison de la présence de la plaque de fond, qui se trouve dans la partie médiane de la moelle épinière. Vu avec optique DIC, les cellules individuelles sont nettement distinctes et une limite définie entre l'expression et nonexpressing cellules est évidente. sortie du cycle de cellules progénitrices est accompagné par des changements dans l'expression génique. Par exemple, tous les neurones post-mitotiques expriment HuC / D qui est détectable par immunohistochimie 1,5. sondes d'ARNm de l'îlot, gata, et les familles de VSX étiqueter les neurones post-mitotiques spécifiques de la position constante et le nombre de chaque cordon hemisegment moelle 6. En outre, les récepteurs de guidage axonal, tels que ceux de la famille de robo sont exprimés dans les populations de neurones post-mitotiques restreintes (Figure 2C) <sup> 2,7,8. Montage latéral d'embryons permet des comptages précis de neurones post-mitotiques. De même, les progéniteurs qui continuent à diviser peuvent être quantifiés avec anti-phospho-histone 3 immunocytochimie ainsi que marquage BrdU. De plus, la mort cellulaire peut être évaluée par marquage TUNEL 6.4. À 24 HPF, les axones des neurones post-mitotiques suivantes peuvent être visualisées avec différentes méthodes, et se distinguent au niveau de la cellule unique: Dorsale latéral ascendant (LRPC), Commissural Croissant primaire (COPA), Commissural secondaire croissant (CSR), ventrale longitudinale décroissant (plaine), Kolmer-Agdur (KA), Commissural bifurcation / longitudinales (CoB / L), circonférentielle Croissant (CIA), circonférentielle Descendant (CID), et unipolaire Commissural Descendant (UCOD), Rohon-Barbe (RB), les motoneurones ( M) 9. Axones s'étendent de ces neurones dans la dorsale, ventrale, antérieure et postérieure directions. Ils branche, croisent la ligne médiane, et sortent à la fois la dorsaleet la moelle épinière ventrale. Lorsqu'il est couplé avec la microscopie confocale à balayage laser, ces comportements cellulaires variées sont évidents dans les embryons montés latéralement, en utilisant des protéines fluorescentes et immunocytochimie codés génétiquement telles que GFP 2. Dans la figure 2D, ZNP-1 immunocytochimie a été utilisé pour étiqueter les motoneurones en développement. Motoneurones quittent la moelle épinière ventrale pour innerver les muscles entourant le développement. Figure 1. Dissection et latéral monter des embryons de poisson zèbre. (A) Après le traitement pour l'immunofluorescence, hybridation in situ, etc, les embryons sont placés dans une boîte de Petri 35 mm rempli de PBT (PBS avec 0,5% de Triton X-100) ou PTW (PBS avec 0,1% de Tween-20). Le jaune d'oeufballe (YB) est évident. (B) Le jaune est éliminé par fixation de la tête de l'embryon suivie par dissection minutieuse. (C) Un poker d'embryon (la ligne de pêche collé sur une pipette Pasteur) est utilisé pour séparer les embryons et les débris de jaune d'oeuf (D). Embryons nettoyés sont déposés à la pipette sur une lame de microscope (E) et alignés (F). Gelée (G) des hydrocarbures est appliquée sur les coins de la lamelle couvre-objet. (H) La lamelle est placée légèrement au-dessus des embryons dans un milieu de montage. (I) Le vernis à ongles est utilisé pour sceller les bords de la lamelle. Cliquez ici pour agrandir l'image . < strong> Figure 2. L'analyse des profils d'expression des gènes et des axones en monté latéralement embryons de poisson zèbre. (A) Dessin d'un embryon de poisson zèbre à 24 HPF. En BD, environ quatre hemisegments-dessus de la prolongation de la vésicule ombilicale sont visualisées (zone encadrée). (B) Nkx6.1 est exprimé dans la moelle épinière ventrale, y compris la plaque de base (FP). (C) ROBO3 est exprimé dans les neurones post-mitotiques (PMN). La zone de la plaque de sol et progénitrices n'est pas évidente dans ce plan focal plus latérale. En B, C, la moelle épinière est délimitée par un support sur ​​le côté gauche de l'image. (D) La microscopie confocale a été utilisée pour l'image ZNP-1 immunofluorescence, qui marque les axones moteurs qui sortent de la moelle épinière ventrale. Dans toutes les images, est antérieure à la gauche et dorsale est écoulé. Une longue distance de travail 40X, immersion dans l'eau (NA 0,8) lentille a été utilisé (3,3 mm).oad/50703/50703fig2highres.jpg "target =" _blank "> Cliquez ici pour agrandir l'image.