解剖やゼブラフィッシュ胚の横方向の取付：脊髄発達の解析
Summary
このような増殖、パターニング、分化、および軸索ガイダンスとして発生プロセスを容易にゼブラフィッシュ脊髄でモデル化することができる。この記事では、これらのイベントの可視化を最適化した、ゼブラフィッシュ胚の取付け手順を説明します。
Abstract
ゼブラフィッシュ脊髄はいくつかの理由で、神経系の研究のための効果的な調査モデルです。まず、遺伝子、遺伝子導入および遺伝子ノックダウンのアプローチは、神経系の発達の根底にある分子機序を調べるために利用することができる。第二に、発達上同期した胚の大クラッチは、大きな実験試料サイズを提供します。第三に、ゼブラフィッシュ胚の光学的透明度は、前駆細胞、グリアおよびニューロン集団を視覚化するために研究者を可能にします。ゼブラフィッシュ胚が透明であるが、試料厚さは、効果的な顕微鏡的視覚化を妨げることができます。この理由の一つは、脊髄体節組織とその上のタンデム開発である。もう一つの理由は、まだ初期の神経発生の期間中に存在する大規模な卵黄のボール、である。本稿では、マイクロダイセクションと周囲の体節組織を維持しながら微細な可視化を可能にする固定胚における卵黄の除去を実証する。私たちALSOゼブラフィッシュ胚の半永久的な取り付けを示しています。それは、組織の三次元性を保持し、これは、背腹方向および前後軸における神経発達の観察を可能にする。
Introduction
ゼブラフィッシュにおける脊髄の可視化は、多くの要因によって阻害される。原因の上にある体節の厚さや脊髄の内部の場所に、かなり長い作動距離は、高解像度の携帯に必要です。 （神経発生の初期段階で依然として存在している）卵黄球は、さらに、必要な作動距離を増加させ、容易にカバースリップからの圧力によって損傷される。また、損傷した卵黄からの破片は、組織の明確な可視化を禁止しています。背腹（DV）軸での断面が可能であるが、それらは容易に前後（AP）軸1に同時可視化を許可していません。
これらの障害を克服するために、胚を切開し、スライド上に搭載されている。この手順では、いくつかの利点があります。まず、ゼブラフィッシュ胚は容易にAP軸の可視化を容易にする、上に向けて側面に位置する。卵黄BALの第二、除去lは、必要な作動距離が減少し、デブリを制限する。第三に、この取り付け手順では、蛍光灯や明視野顕微鏡の両方を可能にします。第四に、マウントされた胚は、長時間の試料の可視化を可能にし、4℃で数ヶ月のために安定している。最後に、開発の進行は、セグメントは、後方のセグメントよりも成熟していることを、前方で発生します。上演一致脊髄hemisegmentsは胚との間で比較されることを保証するためには、上にある体節組織がガイドとして使用されている。例えば、第十最も後方体節は、ステージをマッチさせた胚における発生的に同等である第十脊髄hemisegmentを覆っている。完全な胚のこの取り付け手順では、体節を容易に識別することができます。
我々は発展途上の脊髄に軸索ガイダンスのメカニズムを研究するために遺伝学と遺伝子ノックダウン技術を使用しています。特に、我々はrobo2、robo3、およびDCCが交連一次ASCEのために必要とされることを決定したnding（COPA）軸索経路探索。ここで説明する取り付け手順を使用して、我々は腹側成長、正中線交差、交連幅、背側と前側の成長2,3を調べることができました。この取り付け手順は、DVまたは脊髄のAPパターニングに適用することができる。私たちは、脊髄のDVパターニング下流のWntエフェクターの異なる役割を決定するために、この手順を使用している。この実装を使用して、我々は単一細胞レベルでDVマーカーの解像度を取得し、変更されたWntシグナル受信4,5の結果として微細なパターニングシフトを決定することができた。この取り付け手順では、抗ホスホヒストン3またはBrdU標識（前駆増殖）分化5を通して分裂指数の計算が可能になります。
Protocol
Representative Results
Discussion
脊髄開発の固定ゼブラフィッシュ胚のエイズの可視化の横方向の取り付け。卵黄球の除去を介して、例外的な顕微鏡イメージングに必要なワーキングディスタンスが小さくなる。我々の代表的な結果は24ゼブラ段階に限られていた以前の胚による胚の大きさおよび組織の脆弱性に解剖するのがより困難であるものの、しかしながら、この技術は、早ければ18ゼブラとして使用することができる。この技術は、ゼブラ24歳以上の胚にも適用可能である。胚ゼブラフィッシュの光学的透明性、逆遺伝学、フォワード遺伝子スクリーニングを実行する機能、およびトランスジェニックアプローチに助けられ、いくつかの発生過程を調べることができる。これはBrdUおよび抗リン酸化ヒストン3 4-6とPAX、NKXと、dbx、およびoligファミリーをニューロンとグリア前駆マーカーの発現を通じてパターニングのようなマーカーを用いた神経細胞の前駆細胞の有糸分裂指数が含まれていS 1,4-6。グリアおよび（例えば、グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）およびHUC / Dなど）、ニューロンの判定を報告1,4,5,10の試薬 を使用することができる。神経細胞サブタイプへの分化は、 島、VSX、エングレイルド 、およびGATA遺伝子 1,4-6の発現を介して分析することができます。そして最後に、軸索ガイダンスの分析は、抗アセチル化チューブリン、3A10のような抗体を介して可能であり、ZNP-1 2,11,12。他の脊椎動物モデル系（マウスやヒヨコ）が脊髄の発達を研究するために使用されているが、唯一のゼブラフィッシュは、無傷の胚内のすべての発達の軸を同時に見ることを可能にします。
この方法の明らかな制限は、ライブイメージングを排除する、胚が固定されていることである。実際に、迅速な胚の死卵黄結果（または損傷）の除去は、このように、この技術を用いて、ライブ胚における作動距離を低減することができない。しかし、高倍率脊髄CO生きた胚における番目のイメージングが可能である。ライブイメージング中に卵黄を保持するために、胚を試料とカバーガラスの間に大きな空間を提供する窪みスライドに配置することができる。代わりに、いくつかの22ミリメートル×22ミリメートルのカバースリップは、顕微鏡のスライドのX 1中3のいずれかのスライドに接着することができる。カバーガラスを覆っているカバーガラスのための「ブリッジ」としての役割を果たす。胚は18ゼブラよりも古い場合には、トリカインは、移動を防止するために、胚を麻酔するために使用される。 0.288ミリメートルの作動距離は24 HPFでdeyolked胚に必要ですが、アガロースに埋め込んだライブ胚を扱う場合、無傷の黄身で、3.3ミリメートルの作動距離を持つ微細なレンズで十分です。あるいは、deyolked胚に由来する外植片培養物は、血漿クロット固定化技術13を用いて可視化することができる。細胞の様々な集団は、GFP、mCherry、または光導などの遺伝的にコード化された蛍光タンパク質を利用して観察することができますvertible染料楓（数名）です。さらに、キメラ胚の中、蛍光標識された細胞はまた、このアプローチ14で表示することができます。
ヶ月間安定で一貫性のある実装技術が発達し、細胞生物学者のための重要なツールです。この簡単な技術は、異なる実験試験間比較が容易にできるように、再現性がある。さらに、行の胚の位置合わせが容易に後の分析のために、特定胚の識別を可能にします。
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
スキッドモアファカルティ·ディベロップメント·グラントは、この原稿の作成と出版に資金を供給した。
Materials
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Petri dishes 35mm X 10mm |
VWR |
25373-041 |
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Dumont Forceps #3 |
Fisher Scientific |
NC9839169 |
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Cover glass |
Fisher Scientific |
12-541-B22X22-1.5 |
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Slides |
Fisher Scientific |
12-550-343 |
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SlowFade Gold |
Fisher Scientific |
S36936 |
|
ProLong Gold |
Life Technologies |
P36934 |
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Petroleum Jelly |
Any grocery store |
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Loop Holders |
VWR |
80094-482 |
|
Insect Pins |
Fine Science Tools |
26002-10 |
|
Nickel Plated Pin Holders |
Fine Science Tools |
26016-12
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Name of Equipment |
Company |
Catalog number |
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Olympus Stereo microscope |
Olympus |
SZ61 |
References
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