Микронного масштаба Разрешение оптической томографии целых мозг мышей с конфокальной Light Sheet микроскопии
Summary
В этой статье мы расскажем полную экспериментальную процедуру восстановления, с высоким разрешением, тонкой анатомии мозга флуоресцентно меченых мозгах мыши. Описанный протокол включает подготовку образца и очистки, образец монтажные для изображений, данных постобработки и многомасштабной визуализации.
Abstract
Понимание архитектуры мозга млекопитающих при разрешении одноклеточных является одним из ключевых вопросов неврологии. Тем не менее, отображение нейронов сому и прогнозы на протяжении всего мозга по-прежнему сложным для работы с изображениями и управления данными технологиями. Действительно, макроскопические объемы должны быть реконструированы с высоким разрешением и контрастностью в разумные сроки, производя наборы данных в диапазоне TeraByte. Мы недавно продемонстрировали оптический метод (конфокальной свет лист микроскопии, CLSM) с возможностью получения микронных масштабную реконструкцию целых мозгах мыши, меченных расширенной зеленого флуоресцентного белка (EGFP). Сочетание света освещение листа и конфокальной обнаружения, CLSM позволяет глубоко изображений внутри макроскопических очищенных образцов с высокой контрастностью и скоростью. Здесь мы опишем полную экспериментальную трубопровод для получения полных и читаемые образы целых мозгах мыши, меченных флуоресцентными белками. Очистка и монтаж рrocedures описаны, вместе с шагами, чтобы выполнить оптическое томографии на всем объеме, приобретая множество параллельных смежных стеки. Мы показали использование с открытым исходным кодом заказных программных средств, позволяющих шить из нескольких стеков и навигации данных мульти-разрешением. Наконец, мы показано несколько примеров карт мозга: мозжечок из трансгенной мыши L7-GFP, в котором все клетки Пуркинье селективно меченых и весь мозг от Thy1-GFP-М мыши, характеризуется случайной редкой нейронов маркировки.
Introduction
По сравнению с нашим пониманием молекулярные и клеточные механизмы, лежащие функции мозга, наше знание о тонкой нейроанатомии выглядит еще в зачаточном состоянии 1. На самом деле, мы все еще не подробные карты позиции нейронов somata или долгосрочных прогнозов по всему мозгу. На самом деле, многие технологические усилия посвящены реконструировать мозг мыши с микроскопическим разрешением. Оптические методы, основанные на последовательной срезов смоляных встраиваемый образцов, а ножа сканирующей микроскопии (KESM) 2, Micro-оптический Секционирование томография (МОСТ) 3 и флуоресценции-МОСТ (fMOST) 4, может обеспечить субмикронных трехмерных резолюцию томография целых мозгах мыши. Тем не менее, общее время, необходимое для подготовки и визуализации одного образца составляет порядка нескольких недель, ограничивая практическое применение таких методов. Другой метод основан на последовательной срезов (но без смолы вложения), Серийный Два-Фотон томография (STP) 5, позволяет с высокой трехмерное разрешение изображения. Тем не менее, эта техника была продемонстрирована в целом мозг мыши только с очень редкой выборки, сбора 1 раздел каждые 50 мкм 5, и, насколько нам известно STP пока не привели в полный дискретизации реконструкцию мышиной мозга.
Передовые оптический метод реконструировать целые экземпляры в трех измерениях на высокой скорости легкий лист микроскопии 6. В этой оптической схемы освещения образца с тонким листом света и флуоресценции собирают вдоль оси, перпендикулярной к плоскости освещения. Таким образом только в фокусе флуорофоры рады и можно добиться оптического секционирования в конфигурации широкого поля, гарантируя высокую частоту кадров. В сочетании с очистки протоколы, основанные на подмене воды с показателем преломления соответствующий жидкости 7, свет лист микроскопия была применена кмакроскопические образцы, как целые мозгах мыши 8. Тем не менее, образец-индуцированной рассеяние света, который влияет даже очищенные образцы, ухудшает света лист, ведущие к возбуждению из собственного внимания флуорофорами который добавляет общая размытости получаемых изображений.
Чтобы выборочно собирать только в фокусе фотоны, недавно мы вместе света листового освещение в конфокальной схемы обнаружения 9. В конфокальной света листового микроскопии (CLSM), вне фокуса и рассеянных фотонов отвергаются линейного пространственного фильтра (щель) до обнаружения (рис. 1). Для достижения операцию конфокальной в легкой листовой архитектуры, освещение производится с помощью линии сканирования, а система де-сканирование на пути обнаружения создает статическое изображение сканирующего возбуждения линии в месте расположения щели. Третья система сканирования реконструирует двумерное изображение на датчике камеры. CLSM дает 100% повышение контрастности в очищенной мышимозги в отношении обычного света листового микроскопии, при сохранении скорости 10 Гц кадров. С CLSM можно реконструировать целые мозги мыши с разрешением 2 мкм в XY и 9 мкм Z, и с достаточной отличие различить один флуоресцентно меченных нейронов.
В этой статье мы расскажем экспериментальную трубопровода на реконструкцию мозг мыши с CLSM. Мозги альдегидов фиксированной мыши являются дегидратировали в серии перекиси без тетрагидрофурана, а затем очищается в перекиси без дибензилового эфира (рис. 2), согласно протоколу, разработанному по Беккер и др. 10. Очищается образца затем тщательно установлен на наконечником пластины и позиционируется в визуализации камере заказ конфокальной света листового микроскопом. Образец может быть установлен непосредственно путем погружения его на кончике пластины (рис. 3); альтернативно он может быть приклеен на диске очищенной агарозном геле (фиг.3б) или размещены в полости химический стакан изготовлен из очищенной агарозном геле (фиг.3С). Оптическая томография всего мозга Затем выполняется, так как многие параллельные смежные стеки приобретаются покрыть всю объем мозга (рис. 4). Отбор проб предварительно томография, который производит грубую карту положении образца и формы, гарантирует, что изображения выполняется только в объеме, занимаемом образца. В томография стеки впоследствии сшиты вместе с программного обеспечения на заказ и сохраняются в иерархической схеме 11 в разных разрешениях. Мозги мыши в конечном итоге могут быть изучены с прототипных программного обеспечения нескольких разрешений Google Maps, как визуализации. Обе эти программные инструменты интегрированы с помощью плагинов, в с открытым исходным кодом платформы Vaa3D 12.
Мы, наконец, показать представительства образы мозг мыши, чтобы продемонстрировать возможности описанной экспериментальной трубопровода в изучении тонкой мышиный neuroanatomу.
Protocol
Representative Results
Discussion
CLSM в сочетании с химической очистки представляют собой мощный инструмент для изучения нейроанатомию целых мозгах мыши, меченных флуоресцентными зондами, либо белков или синтетических красителей. Поскольку свет, излучаемый вне фокальной плоскости заблокирован физической пространственный фильтр, высококонтрастный изображений можно также в толстых образцов, сохраняя при этом высокую частоту кадров, характерные для легкой листовой архитектуры.
Главный вопрос, чтобы иметь дело с при использовании описанных методов является максимизация отличие. В самом деле, доступный сигнала уменьшается как за счет химических и оптических факторов. С химической точки зрения, процедуры клиринга на основе органического растворителя может погасить излучение флуоресцирующих белков и других флуоресцентных красителей 7. Фильтрование растворитель для удаления перекиси, как описано Becker и др.. 10, позволяет поддерживать хороший уровень флуоресценции также в растворителей очищен тканей. Публиковатьизд на водной основе методов клиринговые 14 не снижают эффективность флуоресценции, но приводит к ухудшению прозрачности при работе с целых мышиных мозга, по крайней мере с линейными оптическими методами.
С другой стороны, на данный момент нет никаких коммерческих целей с большим рабочим расстоянием, исправленные за высоким показателем преломления (п ≈ 1,56) клирингового решения, используемые. Таким образом, показатель преломления несоответствие между средой, в которой образец погружают и конструкции одной из целей приводит к сильным сферических аберраций. Помимо снижения разрешение микроскопа, такие аберрации привести к падению интенсивности и контрастность изображения, так как свет распространяется на более широкую область. Возможные обходные пути к этому вопросу относятся использование адаптивной оптики 15 и / или статических асферических корректоров.
Любое улучшение контрастности изображения и интенсивности труда влияет также изображений скорость, так корочеВремя интегрирования за изображения можно выбрать. На данный момент CLSM может позволить себе скорость визуализации около 10 6 мкм 3 / с, при времени экспозиции камеры 100 мс 9. На такой скорости он принимает от 1-3 дней к изображению целую мозг мыши, в зависимости от размера выборки. Хотя ни значительное ухудшение качества изображения не наблюдается на протяжении такого долгого сессии изображений, по большей части из-за собственной низкой фотообесцвечивания света листового освещения 6, долго время, необходимое для изображения одного мозга мыши могли на практике снизить применимость CLSM. Увеличение в 10 раз в эффективности системы, в сочетании с использованием высокоскоростной камерой для обнаружения, позволит сократить время формирования изображения до нескольких часов, позволяя рутинное применение описанного протокола.
Несмотря на все вышеуказанных ограничений, CLSM изображений в сочетании с химической очистки тканей разрешений реконструировать целые мозги мыши с разрешением микронного масштаба менее чемнеделю. Другие оптические методы всей визуализации головного мозга позволить себе высокое разрешение, чем CLSM, но по цене более подготовки и / или времени съемки 2-4, или из проб разреженных г 5.
Методы, описанные в этой статье, могут быть использованы в сочетании с различных стратегий для флуоресцентного мечения: трансгенных животных экспрессирующих флуоресцентные белки в отдельных нейронных подмножеств, вирусной трансфекции инъекции интрапаренхимальные красителя, и т.д. На практике все предшествующие стратегии окрашивания жертву животных совместимы с CLSM . На самом деле, некропсический люминесцентные маркировка целых мозгах мыши не была продемонстрирована до сих, во всяком случае, если такой вид окрашивания будет возможно в ближайшее время, количество образцов, которые могут быть реконструированы с CLSM станет гораздо больше, потенциально включая человеческую ткань мозга.
В заключение конфокальной свет лист микроскопия используется в сочетании с тисСью клиринга и управления данными нескольких разрешений может позволить исследователям воссоздать и проанализировать макроскопические образцы с разрешением в микронных размеров, с технологическими усилиями, которые хорошо в руке большинстве лабораторий. Потенциальные применения CLSM, конечно, не ограничивается неврологии, но охватывает все научно-исследовательские области, в которых уже используются свет лист микроскопия, как эмбриогенеза 16,17 и анатомию мелких животных 18.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследование приводит к этим результатам получил финансирование от Седьмой рамочной программе Европейского союза (FP7/2007-2013) под грантовых соглашений н. 228334 и 241526. Этот исследовательский проект был также поддержан программы Human Frontier Science исследовательского гранта (RGP0027/2009), и итальянским министерством по делам образования, университетов и исследований в рамках флагманского проекта Nanomax и Министерства здравоохранения Италии в рамках "Стволовые клетки Прием заявок". Это исследование было проведено в рамках научно-исследовательской деятельности ICON основания, поддерживаемых "Ente Cassa ди Risparmio ди Фиренце".
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline Tablets | Sigma-Aldrich | P4417_100TAB | |
| Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1018 | |
| Peroxide-free Tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 186562 | |
| Aluminum oxide activated, basic, Brockmann I | Sigma-Aldrich | 199443 | |
| Dibenzyl ether | Sigma-Aldrich | 108014 | |
| Butylated hydroxytoluene | Sigma-Aldrich | W218405 | |
| Agarose Type III-A, High EEO | Sigma-Aldrich | A9793 | |
| Acrylic glue | Bostik | D2498 | |
| Vaa3D software | open source | freely downloadable from http://www.vaa3d.org/ |
References
- Lichtman, J. W., Denk, W. The big and the small: challenges of imaging the brain’s circuits. Science. 334, 618-623 (2011).
- Mayerich, D., Abbott, L., McCormick, B. Knife-edge scanning microscopy for imaging and reconstruction of three-dimensional anatomical structures of the mouse brain. J. Microsc. 231, 134-143 (2008).
- Li, A., et al. Micro-optical sectioning tomography to obtain a high-resolution atlas of the mouse brain. Science. 330, 1404-1408 (2010).
- Gong, H., et al. Continuously tracing brain-wide long-distance axonal projections in mice at a one-micron voxel resolution. Neuroimage. 74, 87-98 (2013).
- Ragan, T., et al. Serial two-photon tomography for automated ex vivo mouse brain imaging. Nat. Methods. 9, 255-258 (2012).
- Keller, P. J., Dodt, H. U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Curr. Opin. Neurobiol. 22, 138-143 (2012).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat. Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat. Methods. 4, 331-336 (2007).
- Silvestri, L., Bria, A., Sacconi, L., Iannello, G., Pavone, F. S. Confocal light sheet microscopy: micron-scale neuroanatomy of the entire mouse brain. Opt. Express. 20, 20582-20598 (2012).
- Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PLoS One. 7, e33916 (2012).
- Bria, A., Iannello, G. TeraStitcher – A Tool for Fast Automatic 3D-Stitching of Teravoxel-Sized Microscopy Images. BMC Bioinformatics. 13, 316 (2012).
- Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets. Nat. Biotechnol. 28, 348-353 (2010).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Booth, M. J., Neil, M. A. A., Wilson, T. Aberration correction for confocal imaging in refractive-index-mismatched media. J. Microsc. 192, 90-98 (1998).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305, 1007-1009 (2004).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
- Jahrling, N., Becker, K., Schonbauer, C., Schnorrer, F., Dodt, H. U. Three-dimensional reconstruction and segmentation of intact Drosophila by ultramicroscopy. Front Syst. Neurosci. 4, 1 (2010).
