ميكرون على نطاق بصري القرار المقطعي من أدمغة فئران كاملة مع متحد البؤر المجهري الخفيفة ورقة
Summary
في هذه المادة ونحن تصف الإجراء التجريبي الكامل لإعادة بناء، مع ارتفاع القرار، وتشريح الدماغ غرامة من أدمغة فئران fluorescently المسمى. ويشمل البروتوكول وصف إعداد العينات وتبادل المعلومات، وعينة تصاعد التصوير، وبعد تجهيز البيانات والتصور متعددة النطاق.
Abstract
فهم بنية الدماغ في الثدييات في القرار وحيدة الخلية هي واحدة من القضايا الرئيسية في علم الأعصاب. ومع ذلك، ورسم خرائط سوما الخلايا العصبية والتوقعات في جميع أنحاء الدماغ كله لا يزال تحديا لتقنيات التصوير وإدارة البيانات. في الواقع، تحتاج كميات العيانية من أجل إعادة بنائها مع ارتفاع القرار والتباين في فترة زمنية معقولة، وإنتاج قواعد البيانات في نطاق تيرابايت. أثبتنا في الآونة الأخيرة أسلوب البصرية (متحد البؤر المجهري ورقة ضوء، CLSM) قادرة على الحصول على إعادة الإعمار ميكرون النطاق من أدمغة فئران بأكمله المسمى مع بروتين الفلورية الخضراء المعززة (EGFP). الجمع بين الإضاءة ورقة الضوء والكشف متحد البؤر، CLSM يسمح التصوير في عمق عينات مسح العيانية مع التباين العالي والسرعة. نحن هنا وصف خط أنابيب تجريبية كاملة للحصول على صور شاملة وقابلة للقراءة الإنسان من أدمغة فئران بأكمله المسمى مع البروتينات الفلورية. المقاصة وع المتصاعدةموصوفة rocedures، جنبا إلى جنب مع خطوات لإجراء التصوير المقطعي البصري على حجمه كله من خلال الحصول على العديد من مداخن المجاورة موازية. أظهرنا استخدام المصدر المفتوح حسب الطلب أدوات البرمجيات تمكين خياطة من مداخن متعددة وبيانات الملاحة متعدد القرار. وأخيرا، فإننا يتضح بعض الأمثلة على خرائط الدماغ: المخيخ من الماوس L7-GFP المعدلة وراثيا، والتي كل الخلايا العصبية وصفت بشكل انتقائي، والدماغ كله من الماوس thy1-GFP-M، تتميز عشوائي لوضع العلامات العصبية متفرق.
Introduction
بالمقارنة مع فهمنا للآليات الجزيئية والخلوية وظيفة الدماغ الأساسية، معرفتنا التشريح العصبي غرامة يبدو لا تزال في مهدها 1. في الواقع، ونحن لا تزال تفتقر إلى خرائط شاملة للموقف somata العصبية أو من التوقعات طويلة المدى في جميع أنحاء الدماغ. في الواقع، وتكرس الكثير من الجهود لإعادة بناء التكنولوجية مخ الفأر لقرار المجهرية. وسائل بصرية على أساس باجتزاء المسلسل العينات جزءا لا يتجزأ من الراتنج، والسكين الضوئي المجهري (KESM) 2، مايكرو الضوئية باجتزاء التصوير المقطعي (MOST) 3 ومضان معظم (fMOST) 4، ويمكن أن توفر الفرعية ميكرون القرار ثلاثية الأبعاد تصوير أدمغة فئران بأكمله. ومع ذلك، فإن إجمالي الوقت اللازم لإعداد والتصوير من عينة واحدة هو من أجل من عدة أسابيع، مما يحد من التطبيق العملي لمثل هذه الأساليب. أسلوب آخر يعتمد على باجتزاء المسلسل (ولكن دون الراتنج التضمين)، المسلسل من غرفتيالفوتون التصوير المقطعي (STP) 5، ويسمح عالية الدقة ثلاثية الأبعاد التصوير. ومع ذلك، فقد ثبت هذا الأسلوب في أدمغة فئران كاملة فقط مع عينة ضئيلة جدا، وجمع كل قسم 1 5 50 ميكرومتر، وعلى حد علمنا STP لم تؤد بعد إعادة بناء كامل أخذ العينات من دماغ الفئران.
وهناك طريقة البصرية المتطورة لإعادة العينات كلها في ثلاثة أبعاد بسرعة عالية هو ضوء ورقة المجهري 6. في هذا المخطط الضوئية مضاءة العينة مع ورقة رقيقة من الضوء ويتم جمع الانبعاثات مضان على طول محور عمودي على الطائرة الإضاءة. بهذه الطريقة فقط في التركيز fluorophores متحمسون وأنه من الممكن لتحقيق باجتزاء البصرية في تكوين حقل واسع، وضمان ارتفاع معدلات الإطار. عندما يقترن لتطهير البروتوكولات القائمة على استبدال المياه مع الانكسار السائل مؤشر مطابقة 7، وقد تم تطبيق المجهري ورقة الضوء لالعينات العيانية، كما أدمغة فئران كاملة 8. ومع ذلك، العينة التي يسببها تشتت الضوء، الأمر الذي يؤثر العينات حتى تطهيرها، ويتحلل ورقة ضوء مما يؤدي إلى إثارة خارج التركيز fluorophores الذي يضيف الشاملة وضوح للصور المكتسبة.
لجمع انتقائي فقط في التركيز الفوتونات، ونحن إلى جانب مؤخرا إضاءة ضوء ورقة إلى نظام الكشف مبائر 9. في ورقة متحد البؤر المجهر الضوئي (CLSM)، ورفضت الخروج من التركيز والفوتونات متناثرة من قبل مرشح المكاني الخطي (شق) قبل الكشف (الشكل 1). لتحقيق عملية متحد البؤر في الهندسة المعمارية ورقة ضوء، يتم إنتاج الإضاءة عن طريق خط المسح الضوئي، ونظام دي المسح في مسار الكشف يخلق صورة ثابتة من خط المسح الإثارة في موقع الشق. وهناك نظام المسح الثالث يعيد بناء صورة ثنائية الأبعاد على مستشعر الكاميرا. CLSM يتيح لتعزيز النقيض 100٪ في الماوس تطهيرهاالعقول فيما يتعلق التقليدية المجهري ورقة خفيفة، مع المحافظة على معدل 10 إطار هرتز. مع CLSM فمن الممكن لإعادة بناء أدمغة فئران كامل مع قرار من 2 ميكرومتر في XY و 9 ميكرومتر في Z، ومع تباين كافية لتمييز الخلايا العصبية واحد fluorescently المسمى.
في هذه المادة ونحن تصف خط أنابيب التجريبية لإعادة بناء دماغ الفأر مع CLSM. العقول الثابتة ألدهيد الماوس هي المجففة في سلسلة متدرجة من خالية من بيروكسيد رباعي هيدرو الفوران وتطهيرها في وقت لاحق في خالية من بيروكسيد dibenzyl الأثير (الشكل 2)، بعد بروتوكول ضعتها بيكر وآخرون 10 عينة مسح ثم يتم تركيبه بعناية على الرؤوس لوحة وضعه في غرفة التصوير من متحد البؤر المجهر رقة ضوء مصنوعة خصيصا. العينة يمكن تركيبها مباشرة عن طريق اغراق على معلومات سرية من لوحة (الشكل 3A)؛ بدلا من ذلك يمكن لصقها على قرص من مسح agarose هلام (الشكل3B) أو وضعها في تجويف كوب مصنوع من مسح agarose هلام (الشكل 3C). ثم يتم إجراء التصوير المقطعي البصري من الدماغ بأكمله، كما يتم الحصول على العديد من مداخن المجاورة موازية لتغطية جميع حجم المخ (الشكل 4). وأخذ العينات قبل التصوير المقطعي، والذي ينتج خريطة تقريبية للموقف العينة والشكل، ويضمن أن يتم تنفيذ التصوير فقط في حجم العينة التي تحتلها. يتم لاحقا مخيط مداخن التصوير المقطعي جنبا إلى جنب مع البرامج حسب الطلب وحفظها في نظام متعدد القرار الهرمي 11. يمكن في نهاية المطاف أن تستكشف أدمغة الفأر مع نموذجي البرمجيات متعددة الدقة مثل خرائط جوجل التصور. يتم دمج كلا الصكين برامج هذه الإضافات كما في منصة مفتوحة المصدر Vaa3D 12.
وتبين لنا أخيرا الصور ممثل أدمغة فئران لإثبات قدرات خط أنابيب التجريبية وصفها في دراسة الفئران neuroanatom غرامةذ.
Protocol
Representative Results
Discussion
CLSM إلى جانب تبادل المعلومات الكيميائية تمثل أداة قوية لدراسة التشريح العصبي من أدمغة فئران بأكمله المسمى مع تحقيقات الفلورسنت، وإما البروتينات أو الأصباغ الاصطناعية. منذ الضوء المنبعث خارج البؤري يتم حظره من قبل مرشح المكانية المادية، والتصوير عالية التباين الممكن أيضا في عينات سميكة، مع الحفاظ على ارتفاع معدلات الإطار نموذجي للعمارة ورقة الخفيفة.
القضية الرئيسية للتعامل مع عند استخدام الأساليب المذكورة هو تعظيم التباين. في الواقع، يتم تقليل إشارة المتاحة سواء عن طريق العوامل الكيميائية والبصرية. من وجهة نظر كيميائية، وإجراءات تبادل المعلومات على أساس المذيبات العضوية يشفي الانبعاثات من البروتينات الفلورية والأصباغ الفلورية الأخرى 7. الترشيح للالمذيبات لإزالة البيروكسيدات، كما وصفها بيكر وآخرون 10، يسمح بالحفاظ على مستوى جيد من مضان أيضا في الأنسجة المذيبات تطهيرها. نشرإد المياه القائمة على أساليب المقاصة 14 لا تقلل كفاءة مضان، ولكن النتيجة في أكثر فقرا الشفافية عند التعامل مع أدمغة الفئران بأكمله، على الأقل مع التقنيات البصرية الخطية.
من ناحية أخرى، في هذه اللحظة لا توجد أهداف تجارية مع مسافة العمل الطويلة تصحيح للارتفاع الرقم القياسي الانكسار (ن ≈ 1.56) المقاصة الحلول المستخدمة. وبالتالي، فإن مؤشر الانكسار عدم تطابق بين المتوسطة التي تغمر العينة وتصميم واحد من الهدف يؤدي إلى الانحرافات كروية قوية. إلى جانب الحد من قرار المجهر، مثل الانحرافات يؤدي إلى انخفاض كثافة الصورة والتباين، حيث يتم نشر الضوء على مساحة أوسع. وتشمل الحلول الممكنة لهذه المسألة استخدام البصريات التكيفية 15 و / أو المصححين شبه كروي ثابت.
أي تحسن في تباين الصورة وشدة يؤثر بسهولة أيضا سرعة التصوير، لأن أقصر فيالوقت tegration في الصورة ويمكن اختيار. في لحظة يمكن CLSM تحمل سرعة التصوير من حوالي 10 ميكرومتر 6 3 / ثانية، مع زمن التعرض الكاميرا من 100 ميللي ثانية 9. في هذه السرعة يستغرق 1-3 أيام لصورة دماغ الفأر بأكمله، وهذا يتوقف على حجم العينة. على الرغم من أن أي تدهور كبير في جودة الصورة ويلاحظ طوال هذه الدورة التصوير الطويلة، ومعظمهم بسبب photobleaching من الذاتية المنخفضة ورقة إضاءة ضوء 6، وقتا طويلا اللازمة لصورة يمكن أن دماغ الفأر واحد في الممارسة لحد من انطباق CLSM. زيادة 10 أضعاف في كفاءة النظام، إلى جانب استخدام كاميرا عالية السرعة لكشف، من شأنه أن يقلل وقت التصوير لعدة ساعات، والسماح لاستخدام الروتيني للبروتوكول وصفها.
على الرغم من كل القيود المذكورة أعلاه، CLSM التصوير إلى جانب لتبادل المعلومات الكيميائية تصاريح لإعادة بناء أنسجة أدمغة فئران كامل لقرار ميكرون النطاق في أقل منالأسبوع. وسائل بصرية أخرى للتصوير الدماغ كله تحمل دقة أعلى من CLSM، ولكن بسعر إعداد أطول و / أو وقت التصوير 2-4، أو من أخذ العينات متفرق ض 5.
الطرق الموضحة في هذه المقالة يمكن استخدامها في تركيبة مع استراتيجيات مختلفة لوضع العلامات الفلورية: الحيوانات المعدلة وراثيا معربا عن البروتينات الفلورية في مجموعات فرعية مختارة العصبية، ترنسفكأيشن الفيروسية، وحقن صبغة intraparenchymal، الخ في الواقع كل الاستراتيجيات السابقة تلطيخ التضحية الحيوانية متوافقة مع CLSM . في الواقع، لم يثبت بعد الوفاة وضع العلامات الفلورية من أدمغة فئران كامل حتى الآن؛ على أي حال، إذا كان هذا النوع من تلطيخ سيكون من الممكن في المستقبل القريب، وعدد العينات التي يمكن بناؤها مع CLSM سوف تصبح أكبر من ذلك بكثير، يحتمل أن تكون بما في ذلك أنسجة المخ البشري.
في الختام، متحد البؤر المجهري ورقة الخفيفة المستخدمة في تركيبة مع تيسالمقاصة مقاضاة وإدارة البيانات متعددة القرار قد تسمح للباحثين لإعادة بناء وتحليل العينات العيانية مع القرار في نطاق ميكرون، مع الجهود التكنولوجية التي هي أيضا على يد معظم المختبرات. التطبيقات المحتملة من CLSM بالطبع لا تقتصر على الأعصاب، ولكن يمتد كل المجالات البحثية التي تم بالفعل استخدام المجهر الضوئي ورقة، ومرحلة التطور الجنيني و16،17 تشريح الحيوانات الصغيرة 18.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تلقت البحوث التي تؤدي إلى هذه النتائج على تمويل من البرنامج الإطاري السابع للاتحاد الأوروبي (FP7/2007-2013) بموجب اتفاقات المنح ن. 228334 241526 و. وقد تم دعم هذا المشروع البحثي أيضا من قبل برنامج العلوم الحدودي الإنسان منحة بحثية (RGP0027/2009)، والإيطالية من قبل وزارة التعليم والجامعات والبحوث في إطار البرنامج الرئيسي المشروع Nanomax وزارة الصحة الإيطالية في إطار "الخلايا الجذعية دعوة لتقديم مقترحات". وقد تم تنفيذ هذا البحث في إطار الأنشطة البحثية التأسيس ICON بدعم من "كاسا دي Risparmio التر دي فلورنسا".
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline Tablets | Sigma-Aldrich | P4417_100TAB | |
| Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1018 | |
| Peroxide-free Tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 186562 | |
| Aluminum oxide activated, basic, Brockmann I | Sigma-Aldrich | 199443 | |
| Dibenzyl ether | Sigma-Aldrich | 108014 | |
| Butylated hydroxytoluene | Sigma-Aldrich | W218405 | |
| Agarose Type III-A, High EEO | Sigma-Aldrich | A9793 | |
| Acrylic glue | Bostik | D2498 | |
| Vaa3D software | open source | freely downloadable from http://www.vaa3d.org/ |
References
- Lichtman, J. W., Denk, W. The big and the small: challenges of imaging the brain’s circuits. Science. 334, 618-623 (2011).
- Mayerich, D., Abbott, L., McCormick, B. Knife-edge scanning microscopy for imaging and reconstruction of three-dimensional anatomical structures of the mouse brain. J. Microsc. 231, 134-143 (2008).
- Li, A., et al. Micro-optical sectioning tomography to obtain a high-resolution atlas of the mouse brain. Science. 330, 1404-1408 (2010).
- Gong, H., et al. Continuously tracing brain-wide long-distance axonal projections in mice at a one-micron voxel resolution. Neuroimage. 74, 87-98 (2013).
- Ragan, T., et al. Serial two-photon tomography for automated ex vivo mouse brain imaging. Nat. Methods. 9, 255-258 (2012).
- Keller, P. J., Dodt, H. U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Curr. Opin. Neurobiol. 22, 138-143 (2012).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat. Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat. Methods. 4, 331-336 (2007).
- Silvestri, L., Bria, A., Sacconi, L., Iannello, G., Pavone, F. S. Confocal light sheet microscopy: micron-scale neuroanatomy of the entire mouse brain. Opt. Express. 20, 20582-20598 (2012).
- Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PLoS One. 7, e33916 (2012).
- Bria, A., Iannello, G. TeraStitcher – A Tool for Fast Automatic 3D-Stitching of Teravoxel-Sized Microscopy Images. BMC Bioinformatics. 13, 316 (2012).
- Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets. Nat. Biotechnol. 28, 348-353 (2010).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Booth, M. J., Neil, M. A. A., Wilson, T. Aberration correction for confocal imaging in refractive-index-mismatched media. J. Microsc. 192, 90-98 (1998).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305, 1007-1009 (2004).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
- Jahrling, N., Becker, K., Schonbauer, C., Schnorrer, F., Dodt, H. U. Three-dimensional reconstruction and segmentation of intact Drosophila by ultramicroscopy. Front Syst. Neurosci. 4, 1 (2010).
