Eşodaklı Işık Sac Mikroskobu ile Tüm Fare Brain mikron çaplı Çözünürlük Optik Tomografi
Summary
Bu yazıda yüksek çözünürlüklü, floresan etiketli fare beyinleri ince beyin anatomisi ile, yeniden tam deneysel prosedürü açıklar. Açıklanan protokol numune hazırlama ve temizleme, görüntüleme, veri post-processing ve çok ölçekli görselleştirme için montaj örneği içerir.
Abstract
Tek hücreli çözünürlükte memeli beyin mimarisini anlama nörobilim önemli konulardan biridir. Ancak, bütün beyin boyunca nöronal soma ve projeksiyonları haritalama hala görüntüleme ve veri yönetimi teknolojileri için zordur. Gerçekten de, makroskopik hacimleri Terabyte aralığında veri setleri üreten, makul bir süre içinde, yüksek çözünürlük ve kontrast ile yeniden inşa edilmesi gerekiyor. Biz son zamanlarda bir optik yöntem gelişmiş yeşil flüoresan protein (EGFP) ile etiketlenmiş tüm fare beyinleri mikron ölçekli imar elde edebilen (konfokal ışık levha mikroskopi, CLSM) gösterdi. Işık sac aydınlatma ve konfokal algılama birleştirerek, CLSM yüksek kontrast ve hız ile makroskopik temizledi örneklerin içinde derin görüntüleme sağlar. Burada floresan proteinleri ile etiketlenmiş tüm fare beyinleri kapsamlı ve okunabilir görüntüler elde etmek için tam deneysel boru hattını tarif. Takas ve montaj procedures birlikte bir çok paralel komşu yığınları alarak onun bütün hacmi üzerindeki bir optik tomografisi gerçekleştirmek için adımlar ile tarif edilmiştir. Biz birden fazla yığınları ve çok çözünürlüklü veri navigasyon dikilmesini sağlayan açık kaynak ısmarlama yazılım araçları kullanımını gösterdi. Tüm Purkinje hücreleri seçici olarak etiketlenmiş edildiği bir L7-GFP transgenik fare, ve rastgele seyrek nöronal etiketleme ile karakterize edilen bir thy1-GFP-M fare gelen bütün beyin beyincik: Son olarak, beyin haritalarının bir örneği tasvir.
Introduction
Moleküler ve hücresel mekanizmaları altta yatan beyin fonksiyonlarının anlayışımıza göre, ince nöroanatomi bilgimiz henüz emekleme 1 hala görünüyor. Aslında, biz hala beyin boyunca nöronal somata veya uzun menzilli çıkıntıların konumuna kapsamlı haritalar eksikliği. Aslında, birçok teknolojik çabalar mikroskobik çözünürlükte fare beyin yeniden adadık. Reçine gömülü numunelerinin seri kısımlara göre optik yöntemler Bıçak kenar tarama mikroskobu (KESM) halinde 2, Mikro-Optik Bölünmesi tomografi (ÇOK) ve floresan 3-EN (fMOST) 4, alt-mikron üç boyutlu çözünürlüğü sağlayabilir Tüm fare beyinleri görüntüleme. Ancak, tek bir numune hazırlanması ve görüntüleme için gerekli olan toplam zaman bu yöntemlerin sınırlayıcı pratik uygulama, birkaç hafta düzeyindedir. Seri kesit dayalı başka bir tekniktir (ama reçine gömme olmadan), Seri İki-Foton tomografi (STP) 5, yüksek çözünürlüklü üç boyutlu görüntüleme sağlar. Ancak, bu teknik 1 bölümü her 50 mikron 5 toplama, sadece çok seyrek örnekleme ile tüm fare beyinlerinde kanıtlanmıştır, ve bizim bilgilerimize STP henüz bir fare beyninin tam örnekleme yeniden üretemiyor.
Yüksek hızda üç boyutlu olarak tüm örneklerin yeniden bir üstün optik yöntem hafif levha mikroskobu 6'dır. Bu optik şemada örnek bir ışık ince bir tabaka ile aydınlatıldığında ve floresan emisyonu aydınlatma düzlemine dik olan bir eksen boyunca toplanır. Bu sayede sadece odak flüoroforlar heyecanlı ve yüksek çerçeve hızlarını garanti, geniş alan konfigürasyon optik bölümlendirilmeleri elde etmek mümkündür. Bir kırılma indeks uyumlu sıvı 7 su ile ikame göre temizleme protokolleri bağlanmış olduğunda, ışık mikroskobu tabaka uygulanmıştırFare beyinleri bütün olarak 8 makroskopik örnekleri,. Ancak, elde edilen görüntü bulanıklık genel ekler out-of-odak Flüoroforlann uyarılmaya neden ışık tabakası düşürür, hatta temizlendikten örnekleri etkiler ışık saçılması, numune kaynaklı.
Seçici sadece odak fotonları toplamak için, son zamanlarda bir konfokal algılama düzeni 9 ışık sac aydınlatma birleştiğinde. Konfokal ışık levha mikroskobu (CLSM) in, out-of-odak ve dağınık fotonlar lineer uzaysal filtre (yarık) öncesinde algılama (Şekil 1) tarafından reddedilir. Işık tabaka mimarisinde konfokal işlemi elde etmek için, bir aydınlatma tarama hattı vasıtasıyla üretilen ve algılama yolunda bir de-tarama sistemi yarığın konumunda uyarma tarama çizgisinin bir statik bir görüntü oluşturur. Üçüncü bir tarama sistemi kamera sensör üzerinde iki boyutlu bir görüntü yeniden yapılandırır. CLSM temizlenir fare% 100 kontrastlanma tanıyorKonvansiyonel ışık levha mikroskobu ile ilgili beyin, bir 10 Hz kare hızını korurken. CLSM sayesinde Z 2 XY um ve 9 um çözünürlüğü ile tüm fare beyinleri yeniden ve tek bir floresan etiketli nöronlar ayırt etmek için yeterli kontrast mümkündür.
Bu maddede biz CLSM ile bir fare beyni yeniden deneysel boru hattı açıklar. Aldehit sabit fare beyinleri peroksit içermeyen tetrahidrofuran serileri içinde suyu alınır ve daha sonra Becker et al. 10 temizlenir numune tarafından geliştirilen protokol izlenerek, peroksitsiz dibenzil eter (Şekil 2) temizlenmiş sonra dikkatli bir şekilde monte edilir uçlu plaka ve bir ısmarlama konfokal ışık levha mikroskop görüntüleme odasında konumlandırılmış. Alternatif olarak temizlenir agaroz jel bir disk (şekil üzerinde yapıştırılmış olabilir, örnek, doğrudan plaka (Şekil 3a) bir ucu üzerine dalma ile monte edilebilir3b) ya da temizlenmiş agaroz jeli (Şekil 3c) yapılmış bir beherin boşluğuna yerleştirilir. Birçok paralel komşu yığınları tüm beyin hacmi (Şekil 4) kapsayacak şekilde edinilen gibi tüm beyin bir optik tomografi, sonra yapılır. Örnek konum ve şekil kaba bir ilk üreten bir ön tomografi örnekleme, görüntüleme sadece örnek tarafından işgal edilen hacim içinde olduğunu garanti eder. Tomografi yığınlar sonradan ısmarlama yazılım ile birlikte dikişli ve bir çok çözünürlüklü hiyerarşik düzeni 11 kaydedilir. Fare beyinleri sonunda Prototypal çoklu-çözünürlüklü Google Maps gibi görselleştirme yazılımları ile keşfedilebilir. Her iki yazılım araçları açık kaynak platformu Vaa3D 12 eklentileri olarak entegre edilmiştir.
Biz nihayet ince kemirgen neuroanatom okuyan açıklanan deneysel boru hattının yeteneklerini göstermek için fare beyinleri temsili görüntülerini göstermeky.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kimyasal temizlenmesi ile birleştiğinde CLSM floresan probları, proteinler ya da sentetik boyalarla işaretlenmiş tüm fare beyinleri nöroanatomisini incelemek için güçlü bir araç temsil eder. Odak düzlemi dışında yayılan ışık fiziksel mekansal filtre tarafından engellenen beri hafif levha mimarisinin tipik yüksek çerçeve hızlarını korurken, yüksek kontrastlı görüntüleme, kalın kesitlerle da mümkündür.
Açıklanan yöntemler kullanılarak zaman başa ana konu kontrast maksimizasyonu olduğunu. Aslında, mevcut sinyal kimyasal ve optik faktörler tarafından her iki düşürülür. Bakış kimyasal açıdan bakıldığında, bir organik çözücü göre temizleme işlemleri floresan protein ve diğer floresan boyalar 7 emisyon söndürülmesi olabilir. Becker et al., 10 tarafından tarif edildiği gibi çözücünün süzülmesi, peroksitleri çıkarmak için, solvent-temizlenmiş dokularda da floresan iyi bir düzeyde muhafaza sağlar. YayınlamakTüm kemirgen beyinleri ile uğraşırken ed su bazlı temizleme yöntemleri 14 en azından doğrusal optik teknikleri ile, floresan verimliliğini azaltır, ancak yoksul şeffaflık yol açmaz.
Diğer yandan, şu anda, yüksek kırılma indeksi (n ≈ 1.56) kullanılan çözümler temizleme için düzeltilmiş uzun çalışma mesafesi olan ticari amaçlar vardır. Bu durumda, numune içine gömülmüş olduğu orta ve objektif tasarımında bir kırılma endeksi arasındaki uyumsuzluk güçlü küresel sapmaları yol açmaktadır. Mikroskobun çözünürlüğünü azaltarak yanı sıra, bu tür sapmaları ışığı daha geniş bir alana yayılmış olduğundan, görüntü yoğunluğu ve kontrast bir düşüşe neden. Bu konuya Yapılabilecekler uyarlanabilir optik 15 ve / veya statik asferik düzelticisi kullanımını içerir.
Daha kısa bir görüntü kontrast Başlangıcı ve yoğunluk herhangi bir gelişme, hali hazırda, aynı zamanda görüntüleme hızını etkilergörüntü başına tegration zaman seçilebilir. Şu anda CLSM 100 msn 9 bir kamera maruz kalma süresi ile, yaklaşık 10 um 6 3 / sn 'lik bir görüntüleme hızı gelemez. Bu hızda bu numune boyutuna bağlı olarak 1-3 gün görüntüye bütün bir fare beyin alır. Görüntü kalitesinde önemli bir bozulma çünkü çoğunlukla hafif sac aydınlatma 6 içsel düşük ağartmanın böyle uzun görüntüleme oturumu boyunca görülmekle birlikte, uzun süre tek bir fare beyin pratikte CLSM uygulanabilirliğini azaltabilecek görüntü gerekiyordu. Tespiti için yüksek hızlı kameranın kullanımı ile birlikte sistem verimliliği bir 10-kat artış, tarif edilen protokol rutin bir kullanımına izin veren, bir kaç saat için bir görüntüleme zamanı azaltacaktır.
Tüm yukarıda belirtilen sınırlamalara rağmen, az bir de mikron çaplı bir çözünürlüğe sahip tüm fare beyinleri yeniden dokular izinlerinin kimyasal açıklığa birleştiğinde CLSM görüntülemehafta. Tüm beyin görüntüleme için diğer optik yöntemler CLSM daha yüksek çözünürlüğe göze, ancak daha uzun hazırlık ve / veya görüntüleme süresi 2-4 fiyata, ya da seyrek z örnekleme 5.
Bu makalede açıklanan yöntemler floresan etiketlemesi için farklı stratejiler ile kombinasyon halinde kullanılabilir: transgenik hayvanlar, vb seçilmiş nöron alt gruplarının, viral transfeksiyonu, intraparenkimal boya enjeksiyon, floresan proteinleri ifade Uygulamada, hayvan kurban önceki tüm boyama stratejileri CLSM uyumludur . , Boyama bu tür yakın gelecekte mümkün olurdu neyse, CLSM ile yeniden olabilir örneklerin sayısı daha fazla olur, aslında, tüm fare beyinleri otopsi floresan etiketleme bugüne kadar ortaya konmamıştır potansiyel olarak insan beyin dokusu da dahil olmak üzere.
Sonuç olarak, konfokal mikroskopi ışık tabaka TBS ile birlikte kullanılırsue takas ve çok çözünürlüklü veri yönetimi araştırmacılar çoğu laboratuarların elinde iyi olan teknolojik çabaları ile, mikron ölçeğinde çözünürlüğe sahip makroskopik örnekleri yeniden ve analiz etmek için izin verebilir. CLSM potansiyel uygulamaları nörobilim sınırlı değildir elbette, ama 16,17 ve küçük hayvanların 18 anatomisini embryogenesis olarak, hafif levha mikroskobu zaten kullanılmış olan tüm araştırma alanları kapsar.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu sonuçlara yol açan araştırma n hibe anlaşmaları kapsamında Avrupa Birliği Yedinci Çerçeve Programı (FP7/2007-2013) fon aldı. 228334 ve 241526. Bu araştırma projesi, aynı zamanda İnsan Frontier Bilim Programı araştırma bursu (RGP0027/2009) tarafından desteklenen ve olmuştur Flagship Proje Nanomax çerçevesinde Eğitim, Üniversite ve Araştırma İtalyan Bakanlığı tarafından ve çerçevesinde İtalyan Sağlık Bakanlığı tarafından "Kök Hücreler Teklif Çağrısı". Bu araştırma, "Ente Cassa di risparmio di Firenze" tarafından desteklenen ICON vakıf araştırma faaliyetlerinin çerçevesinde yürütülmüştür.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline Tablets | Sigma-Aldrich | P4417_100TAB | |
| Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1018 | |
| Peroxide-free Tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 186562 | |
| Aluminum oxide activated, basic, Brockmann I | Sigma-Aldrich | 199443 | |
| Dibenzyl ether | Sigma-Aldrich | 108014 | |
| Butylated hydroxytoluene | Sigma-Aldrich | W218405 | |
| Agarose Type III-A, High EEO | Sigma-Aldrich | A9793 | |
| Acrylic glue | Bostik | D2498 | |
| Vaa3D software | open source | freely downloadable from http://www.vaa3d.org/ |
References
- Lichtman, J. W., Denk, W. The big and the small: challenges of imaging the brain’s circuits. Science. 334, 618-623 (2011).
- Mayerich, D., Abbott, L., McCormick, B. Knife-edge scanning microscopy for imaging and reconstruction of three-dimensional anatomical structures of the mouse brain. J. Microsc. 231, 134-143 (2008).
- Li, A., et al. Micro-optical sectioning tomography to obtain a high-resolution atlas of the mouse brain. Science. 330, 1404-1408 (2010).
- Gong, H., et al. Continuously tracing brain-wide long-distance axonal projections in mice at a one-micron voxel resolution. Neuroimage. 74, 87-98 (2013).
- Ragan, T., et al. Serial two-photon tomography for automated ex vivo mouse brain imaging. Nat. Methods. 9, 255-258 (2012).
- Keller, P. J., Dodt, H. U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Curr. Opin. Neurobiol. 22, 138-143 (2012).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat. Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat. Methods. 4, 331-336 (2007).
- Silvestri, L., Bria, A., Sacconi, L., Iannello, G., Pavone, F. S. Confocal light sheet microscopy: micron-scale neuroanatomy of the entire mouse brain. Opt. Express. 20, 20582-20598 (2012).
- Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PLoS One. 7, e33916 (2012).
- Bria, A., Iannello, G. TeraStitcher – A Tool for Fast Automatic 3D-Stitching of Teravoxel-Sized Microscopy Images. BMC Bioinformatics. 13, 316 (2012).
- Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets. Nat. Biotechnol. 28, 348-353 (2010).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Booth, M. J., Neil, M. A. A., Wilson, T. Aberration correction for confocal imaging in refractive-index-mismatched media. J. Microsc. 192, 90-98 (1998).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305, 1007-1009 (2004).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
- Jahrling, N., Becker, K., Schonbauer, C., Schnorrer, F., Dodt, H. U. Three-dimensional reconstruction and segmentation of intact Drosophila by ultramicroscopy. Front Syst. Neurosci. 4, 1 (2010).
