מיקרון בקנה מידת רזולוציה אופטית טומוגרפיה של מוח עכבר השלם עם מיקרוסקופית גיליון Confocal אור
Summary
במאמר זה אנו מתארים את ההליך ניסיוני המלא לשחזר, עם רזולוציה גבוהה, האנטומיה מוח הקנס של מוח עכבר שכותרתו fluorescently. הפרוטוקול המתואר כולל הכנת מדגם וסליקה, דגימת הרכבה עבור הדמיה, שלאחר עיבוד נתונים והדמיה רב היקף.
Abstract
הבנת הארכיטקטורה של מוח של יונקים ברזולוציה תא בודד היא אחד הנושאים המרכזיים של מדעי המוח. עם זאת, מיפוי סומה ותחזיות עצביות לאורך כל המוח הוא עדיין מאתגר בטכנולוגיות הדמיה וניהול נתונים. ואכן, כרכים מקרוסקופית צריכים להיות משוחזרים עם רזולוציה גבוהה ולעומת זאת בפרק זמן סביר, ייצור מערכי נתונים בטווח הטרה. לאחרונה הפגינו שיטה אופטית (מיקרוסקופיה confocal אור הגיליון, CLSM) מסוגלת קבלת שיקום מיקרון בקנה מידה של מוח עכבר השלם שכותרתו עם חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (EGFP). שילוב של תאורת גיליון אור וגילוי confocal, CLSM מאפשר הדמיה עמוקה בתוך דגימות פינו מקרוסקופית עם ניגודיות גבוהה ומהירות. כאן אנו מתארים את הצינור הניסיוני השלם כדי להשיג תמונות מקיפות וקריאות של מוח עכבר השלם שכותרתו עם חלבוני ניאון. הסליקה וp ההרכבהrocedures מתוארים, יחד עם הצעדים כדי לבצע טומוגרפיה אופטית בנפח כולה על ידי רכישה רבות ערימות סמוכות מקבילות. אנחנו הראיתי את השימוש בכלי תוכנה בקוד פתוח מותאמות אישית המאפשרים לתפרים של הערימות מרובות וניווט נתונים רב ברזולוציה. לבסוף, הדגמנו כמה דוגמא של מפות מוח: המוח הקטן מעכבר L7-GFP מהונדס, שבו כל תאי פורקינג' מסומנים באופן סלקטיבי, וכל המוח של עכבר Thy1-GFP-M, המתאפיין בתיוג עצבי דליל אקראי.
Introduction
בהשוואה להבנה של תפקוד המוח הבסיסי מנגנונים מולקולריים והתאיים שלנו, הידע של neuroanatomy קנס שלנו נראה עדיין בחיתוליו 1. למעשה, אנחנו עדיין חסרים מפות מקיפות של עמדת somata העצבי או מתחזיות לטווח ארוך בכל רחבי המוח. למעשה, רבים מאמצים טכנולוגיים מוקדשים לשחזר את מוח העכבר עם רזולוציה מיקרוסקופית. שיטות אופטיות המבוססות על חתך סידורי של דגימות מוטבעות שרף, כסכין קצה סריקה מיקרוסקופית (KESM) 2, מיקרו האופטי חתך טומוגרפיה (MOST) 3 והקרינה-ביותר (fMOST) 4, יכול לספק רזולוציה תלת ממדים תת מיקרון הדמיה של מוח עכבר כולו. עם זאת, את הזמן הכולל הדרוש לעריכה ולהדמיה של מדגם יחיד הוא בסדר גודל של מספר שבועות, המגביל את היישום המעשי של שיטות כאלה. טכניקה נוספת המבוססת על חתך סדרתי (אבל בלי הטבעת שרף), טורי דוטומוגרפיה הפוטון (STP) 5, מאפשרת הדמיה תלת ממדית ברזולוציה גבוהה. עם זאת, טכניקה זו הודגמה במוח עכבר כולו אך ורק בדגימה דלילה מאוד, איסוף סעיף 1 כל 50 מיקרומטר 5, ואת הידע שלנו STP לא הניב עדיין שחזור מלא דגימה של מוח עכברי.
שיטה אופטית חדשנית לשחזר כל דגימות בשלושה ממדים במהירות גבוהה היא מיקרוסקופית אור גיליון 6. בערכה אופטית זה המדגם הוא מואר בסדין דק של אור ופליטת הקרינה שנאסף לאורך ציר בניצב למישור התאורה. בדרך זו רק fluorophores בפוקוס נרגש וזה אפשרי להשיג חתך אופטי בתצורת שדה רחבה, המבטיח את מסגרת חליפין גבוהות. כאשר מצמידים את ניקוי פרוטוקולים מבוססים על ההחלפה של מים עם נוזל תואם מקדם שבירה 7, מיקרוסקופיה גיליון האור הוחלדגימות מאקרוסקופי, כמו מוח עכבר כולו 8. עם זאת, דגימה-induced פיזור אור, אשר משפיע על דגימות אפילו פינו, מדרדרת את גיליון האור מוביל לעירור של fluorophores מחוץ לפוקוס אשר מוסיף כוללת טשטוש לתמונות שנרכשו.
לאסוף באופן סלקטיבי רק פוטונים בפוקוס, לאחרונה בשילוב תאורת גיליון אור לערכת זיהוי confocal 9. במיקרוסקופיה גיליון אור confocal (CLSM), מחוץ לפוקוס ופוטונים מפוזרים נדחים על ידי מסנן ליניארי מרחבית (חריץ) לפני זיהוי (איור 1). כדי להשיג פעולת confocal באדריכלות גיליון אור, התאורה מופקת באמצעות קו סריקה, ומערכת דה לסריקת בדרך הגילוי יוצרת תמונה סטטית של קו סריקת עירור במיקום של החריץ. מערכת סריקה שלישית משחזרת תמונה דו ממדית על חיישן המצלמה. CLSM מאפשר 100% שיפור לעומת בעכבר פינהמוח ביחס למיקרוסקופיה גיליון אור הקונבנציונלית, תוך שמירה על שיעור 10 מסגרת הרץ. עם CLSM זה אפשרי לשחזר את המוח של עכבר כולו עם רזולוציה של 2 מיקרומטר בXY ו 9 מיקרומטר ב-Z, ועם ניגודיות מספיקה כדי להבחין בנוירונים בודדים שכותרתו fluorescently.
במאמר זה אנו מתארים את הצינור הניסיוני לשחזר מוח עכבר עם CLSM. המוח של עכבר קבוע אלדהיד מיובש בסדרה מדורגת של tetrahydrofuran נטול חמצן ופינה לאחר מכן באתר dibenzyl נטול חמצן (איור 2), בעקבות הפרוטוקול שפותח על ידי בקר ואח'. 10 הדגימה פינתה מותקן אז בזהירות על הטה צלחת ואת מיקומו בחדר ההדמיה של מיקרוסקופ אור confocal מחוייט גיליון. המדגם יכול להיות מותקן ישירות על ידי צולל אותו על קצה של הצלחת (איור 3 א), או לחלופין הוא יכול להיות מודבק על דיסק של agarose ג'ל פינה (איור3 ב) או להציב בחלל של כוס עשויה מג'ל פינה agarose (איור 3c). טומוגרפיה אופטית של המוח כולו לאחר מכן ביצעה, כפי שרבי ערימות סמוכות מקבילות נרכשות כדי לכסות את כל נפח המוח (איור 4). דגימה טרום טומוגרפיה, אשר מייצרת מפה גסה של מיקום הדגימה וצורה, מבטיחה כי הדמיה מתבצעת רק בנפח תפוס על ידי המדגם. ערימות טומוגרפיה לאחר מכן מאוחות עם תוכנה מותאמת אישית ונשמרו בתכנית היררכית רב ברזולוציה 11. סופו של דבר יכול להיות חוקר מוח עכבר עם תוכנת הדמיה כמו מפות גוגל רבת ברזולוציה prototypal. שני מכשירים אלה תוכנה משולבים כתוספים בפלטפורמת הקוד הפתוח 12 Vaa3D.
אנחנו סוף סוף להראות תמונות מייצגות של מוח עכבר כדי להדגים את היכולות של הצינור הניסיוני המתואר בלומדים הנוירו העכברי בסדרy.
Protocol
Representative Results
Discussion
CLSM יחד עם סליקה כימית מייצג כלי רב עוצמה כדי לחקור neuroanatomy של מוח עכבר השלם שכותרתו עם בדיקות ניאון, או חלבונים או צבעים סינטטיים. מאז האור הנפלט מחוץ למישור המוקד חסום על ידי מסנן מרחבי פיזי, הדמיה ניגודיות גבוהה אפשרית גם בדגימות עבות, תוך שמירה על המסגרת החליפין הגבוהה הטיפוסית של אדריכלות גיליון אור.
הבעיה העיקרית להתמודד עם בעת שימוש בשיטות שתוארו היא מקסום של הניגוד. למעשה, את האות זמינה מופחתת הן על ידי גורמים כימיים ואופטיים. מנקודת המבט הכימית, נהלי הסליקה מבוססים על ממס אורגני יכולים להרוות את הפליטה מחלבונים ניאון וצבעי ניאון אחרים 7. הסינון של הממס להסרת תחמוצות, כפי שתואר על ידי בקר ואח'. 10, מאפשר שמירה על רמה טובה של הקרינה גם ברקמות-פינה ממס. לפרסםשיטות ניקוי על בסיס מים ed 14 לא להפחית את יעילות הקרינה, אבל לגרום לשקיפות עניות יותר כאשר מדוברים במוחות עכבריים כולו, לפחות בשיטות אופטיות ליניארי.
מצד השני, ברגע שאין מטרות מסחריות עם מרחק עבודה ארוך המתוקנת למדד הגבוה השבירה (n ≈ 1.56) ניקוי פתרונות בשימוש. לפיכך, חוסר התאמת מקדם השבירה בין המדיום שבו המדגם הוא שקוע והעיצוב אחד האובייקטיבי מולידה סטיות כדוריות חזקות. מלבד הפחתה ברזולוציה של מיקרוסקופ, סטיות כאלה לגרום לירידה של עוצמת תמונה ולעומת זאת, מאז האור משתרע על שטח רחב יותר. דרכים לעקיפת אפשריות לסוגיה זו כוללות את השימוש של אופטיקה אדפטיבית 15 ו / או מתקן אספריים סטטי.
כל שיפור בניגוד תמונה ועוצמה בקלות משפיע גם מהירות הדמיה, שכן קצר יותר בניתן לבחור בזמן שילוב מחדש לכל תמונה. כרגע CLSM יכול להרשות מהירות הדמיה של כ 10 6 מיקרומטר 3 / sec, עם זמן חשיפת מצלמה של 100 msec 9. במהירות זו שלוקח מ1-3 ימים לתמונה במוח עכבר כולו, תלוי בגודל מדגם. למרות השפלה לא משמעותי באיכות תמונה הוא ציין ברחבי מושב כזה ארוך הדמיה, בעיקר בגלל photobleaching הנמוך המהותי של תאורת גיליון אור 6, זמן דרוש לתמונה במוח עכבר בודד יכול בפועל לצמצם את תחולתו של CLSM. גידול של פי 10 ביעילות מערכת, בשילוב עם השימוש במצלמה במהירות גבוהה לצורך זיהוי, הייתי להפחית את זמן הדמיה לכמה שעות, מה שמאפשר שימוש שיגרתי של הפרוטוקול המתואר.
למרות כל המגבלות הנ"ל, ההדמיה CLSM מצמידים את הסליקה כימית של היתרי רקמות לשחזר מוח עכבר כולו עם רזולוציה בקנה מידה מיקרון בפחות משבוע. שיטות אופטיות אחרות להדמית המוח כולו להרשות לעצמו ברזולוציה גבוהה יותר מאשר CLSM, אבל במחיר של הכנה ארוכה יותר ו / או זמן הדמיה 2-4, או של דגימת z דלילה 5.
השיטות מתוארות במאמר זה יכול לשמש בשילוב עם אסטרטגיות שונות לניאון תיוג: בעלי חיים מהונדסים מבטא חלבוני ניאון בתת נבחר עצביים, transfection הנגיפי, הזרקת צבע intraparenchymal, וכו 'בפועל, כל האסטרטגיות מכתים קדמו הקרבת בעלי חיים בקנה אחד עם CLSM . למעשה, תיוג ניאון שלאחר המוות של מוח עכבר כולו לא הפגין עד עכשיו; בכל מקרה, אם סוג כזה של צביעה יהיה אפשרי בעתיד הקרוב, את מספר הדגימות שניתן לשחזר עם CLSM יהיה הרבה יותר גדול, פוטנציאלי, כולל רקמת מוח אנושית.
לסיכום, מיקרוסקופיה גיליון אור confocal בשילוב עם TISסליקה לתבוע וניהול נתונים רב ברזולוציה עשויה לאפשר לחוקרים לשחזר ולנתח דגימות מקרוסקופית עם רזולוציה בקנה מידת מיקרון, עם מאמצים טכנולוגיים הנמצאים גם ביד של רוב המעבדות. יישומים אפשריים של CLSM הם כמובן לא רק למדעי המוח, אבל משתרע על פני כל תחומי המחקר שבו כבר נעשה שימוש במיקרוסקופ גיליון אור, כעובר 16,17 ואנטומיה של בעלי חיים קטנים 18.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחקר שהוביל לתוצאות הללו קיבל מימון מתכנית המסגרת השביעית של האיחוד האירופי (FP7/2007-2013) במסגרת הסכמי מענק n. 228,334 ו241,526. פרויקט מחקר זה נתמך גם על ידי מענק Frontier אנוש תכנית מדע מחקר (RGP0027/2009), ועל ידי המשרד האיטלקי לחינוך, אוניברסיטות ומחקר במסגרת פרויקט הדגל Nanomax ועל ידי משרד בריאות איטלקי במסגרת "תאי גזע קריאה להצעות". מחקר זה בוצע במסגרת פעילות המחקר של קרן ICON נתמכת על ידי "Ente Cassa di Risparmio די פירנצה".
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline Tablets | Sigma-Aldrich | P4417_100TAB | |
| Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1018 | |
| Peroxide-free Tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 186562 | |
| Aluminum oxide activated, basic, Brockmann I | Sigma-Aldrich | 199443 | |
| Dibenzyl ether | Sigma-Aldrich | 108014 | |
| Butylated hydroxytoluene | Sigma-Aldrich | W218405 | |
| Agarose Type III-A, High EEO | Sigma-Aldrich | A9793 | |
| Acrylic glue | Bostik | D2498 | |
| Vaa3D software | open source | freely downloadable from http://www.vaa3d.org/ |
References
- Lichtman, J. W., Denk, W. The big and the small: challenges of imaging the brain’s circuits. Science. 334, 618-623 (2011).
- Mayerich, D., Abbott, L., McCormick, B. Knife-edge scanning microscopy for imaging and reconstruction of three-dimensional anatomical structures of the mouse brain. J. Microsc. 231, 134-143 (2008).
- Li, A., et al. Micro-optical sectioning tomography to obtain a high-resolution atlas of the mouse brain. Science. 330, 1404-1408 (2010).
- Gong, H., et al. Continuously tracing brain-wide long-distance axonal projections in mice at a one-micron voxel resolution. Neuroimage. 74, 87-98 (2013).
- Ragan, T., et al. Serial two-photon tomography for automated ex vivo mouse brain imaging. Nat. Methods. 9, 255-258 (2012).
- Keller, P. J., Dodt, H. U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Curr. Opin. Neurobiol. 22, 138-143 (2012).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat. Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat. Methods. 4, 331-336 (2007).
- Silvestri, L., Bria, A., Sacconi, L., Iannello, G., Pavone, F. S. Confocal light sheet microscopy: micron-scale neuroanatomy of the entire mouse brain. Opt. Express. 20, 20582-20598 (2012).
- Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PLoS One. 7, e33916 (2012).
- Bria, A., Iannello, G. TeraStitcher – A Tool for Fast Automatic 3D-Stitching of Teravoxel-Sized Microscopy Images. BMC Bioinformatics. 13, 316 (2012).
- Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets. Nat. Biotechnol. 28, 348-353 (2010).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Booth, M. J., Neil, M. A. A., Wilson, T. Aberration correction for confocal imaging in refractive-index-mismatched media. J. Microsc. 192, 90-98 (1998).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305, 1007-1009 (2004).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
- Jahrling, N., Becker, K., Schonbauer, C., Schnorrer, F., Dodt, H. U. Three-dimensional reconstruction and segmentation of intact Drosophila by ultramicroscopy. Front Syst. Neurosci. 4, 1 (2010).
