この記事では、高分解能、蛍光標識したマウスの脳の微細脳解剖と、再構築するための完全な実験手順について説明します。説明されたプロトコルは、試料調製及び清算、画像化、データ後処理およびマルチスケール視覚化のための取付片を備えている。
単一セルの解像度で、哺乳類の脳のアーキテクチャを理解することは、神経科学の重要な課題の一つである。しかし、脳全体を通して神経細胞の細胞体および突起部をマッピングすること、まだ画像およびデータ管理テクノロジの挑戦である。確かに、巨視的ボリュームはテラバイトの範囲内のデータセットを生成する、妥当な時間で高解像度とコントラストで再構築される必要がある。我々は最近、強化緑色蛍光タンパク質(EGFP)で標識したマウスの脳全体のミクロンスケールの再構成を得ることが可能な光学的方法(共焦点光シート顕微鏡、CLSM)を示した。シート光照明と共焦点検出を組み合わせ、CLSMは、高コントラスト、高速で巨視的クリア標本の奥深くイメージングを可能にする。ここでは、蛍光タンパク質で標識された全体のマウスの脳の包括的かつ人間が読める画像を得るために、完全な実験的なパイプラインを説明します。清算および取付けProceduresは、一緒に多くの並列隣接するスタックを取得することにより、その全体積に光トモグラフィを実行するための手順を記載されている。我々は、複数のスタックとマルチ解像度データナビゲーションのステッチングを可能にするオープンソースのカスタムメイドのソフトウェアツールの使用法を示した。すべてのプルキンエ細胞が選択的に標識されたL7-GFPトランスジェニックマウス、および不規則スパース神経細胞を標識することを特徴とTHY1-GFP-Mマウスからの全脳から小脳:最後に、我々は脳のマップのいくつかの例を示す。
脳機能の基礎となる分子·細胞メカニズムの理解と比較すると、細かい神経解剖学の知識は、まだ初期段階1のままに見えます。実際に、我々はまだ、脳全体のニューロン細胞体または長距離突起の位置の包括的なマップを欠いている。実際に、多くの技術的努力が、顕微鏡の分解能でマウスの脳を再構築するために専念している。ナイフエッジ走査顕微鏡(KESM)2、マイクロ光学切片トモグラフィー(MOST)3および蛍光一番(fMOST)4等の樹脂包埋サンプルの連続切片に基づいて光学的方法は、サブミクロン3次元分解能を提供することができます全体マウス脳のイメージング。しかし、単一の試料の調製およびイメージングのために必要な総時間は、このような方法の実用化を制限する、数週間程度である。連続切片に基づいて別の技術(ただし、樹脂包埋なし)、連続2フォトン断層撮影(STP)5は 、高3次元分解能イメージングを可能にします。しかし、この技術は、1セクションごとに50ミクロン5を集め、非常にまばらなサンプリングに全マウスの脳で実証されており、我々の知る限り、STPはまだネズミの脳のフルサンプリング復興を生産していない。
高速で3次元で全体の標本を再構築する最先端の光学的な方法は、光シート顕微鏡6である。この光方式では、サンプルは、光の薄いシートで照射され、蛍光発光は、照明平面に垂直な軸に沿って収集される。このようにして唯一の合焦フルオロフォアは励起され、高いフレームレートを保証し、広視野構成の光学切片を実現することができる。屈折率整合液7と水との置換に基づくプロトコルをクリアに結合されたときに、光シート顕微鏡に適用されている全マウスの脳8などの巨視的な標本。しかし、クリア標本に影響を与えた試料に誘導される光の散乱は、取得した画像にぼかし総合追加ピンボケ蛍光体の励起につながる光シートを劣化させる。
のみを選択的焦点の合った光子を収集するために、我々は最近、共焦点検出スキーム9にシート光照明を結合さ。共焦点光シート顕微鏡(CLSM)で、アウト·オブ·フォーカスと散乱光子は検出前に、線形空間フィルタ(スリット)( 図1)によって拒否されます。光シートアーキテクチャの共焦点動作を達成するために、照明を走査線によって生成され、検出経路における脱走査システムは、スリットの位置で励起走査線の静止画像が作成される。第3走査システムは、カメラセンサ上の二次元画像を再構成する。 CLSMはクリアマウスでは100%のコントラスト強調を与える従来の光シート顕微鏡に対して脳、10Hzのフレームレートを維持する。 CLSMで、それはZがX-Yでの2ミクロンと9ミクロンの分解能で全体のマウスの脳を再構築するために、単一の蛍光標識された神経細胞を識別するのに十分なコントラストで可能です。
この記事では、CLSMでマウス脳を再構築するための実験のパイプラインについて説明します。アルデヒドで固定し、マウス脳は過酸化物を含まテトラヒドロフラン一連の段階的に脱水し、その後Becker ら。10クリア試料によって開発されたプロトコルに従って、過酸化物を含まないジベンジルエーテル( 図2)をクリアする慎重な先端に取り付けられているプレートとカスタムメイドの共焦点光シート顕微鏡のイメージングチャンバー内に配置。試料を直接プレート(図3a)の先端上に沈めることによって取り付けることができる、あるいは、それがクリアアガロースゲル( 図の円板上に接着することができる図3(b))またはクリアアガロースゲル( 図3c)で作られたビーカーのキャビティ内に配置。多くの平行に隣接するスタックは、すべての脳容積( 図4)を覆うように取得されるように、脳全体の光断層画像は、その後、実行される。試料位置及び形状の大まかなマップを生成するプリトモサンプリングは、撮像のみ試料が占める体積で行われることを保証する。トモ·スタックは、その後、カスタムメイドのソフトウェアによって縫合し、多重解像度の階層スキーム11に保存されます。マウスの脳では、最終的には原型多重解像度Googleマップのような視覚化ソフトウェアを使用して検討することができます。これらの両方のソフトウェア·インストゥルメントは、オープンソースのプラットフォームVaa3D 12内のプラグインとして統合されています。
我々は最終的に細かいマウスneuroanatomを研究に記載された実験のパイプラインの能力を実証するために、マウスの脳の代表的な画像を表示するY。
化学クリアと相まってCLSMは、蛍光プローブ、タンパク質のいずれかまたは合成色素で標識した全体のマウスの脳の神経解剖学を研究するための強力なツールを表しています。焦点面の外側に放射される光は、物理的空間フィルタにより遮断されるので、光学シートアーキテクチャの典型的な高フレームレートを維持しつつ、高コントラストイメージングは、厚い標本でも可能である。
記載された方法を使用した場合に対処する主な問題は、コントラストの最大化である。実際には、利用可能な信号が化学的および光学的要因の両方によって低減される。化学的観点から、有機溶剤に基づいて、清算手続きは、蛍光タンパク質および他の蛍光色素7からの発光を消光してもよい。ベッカーら 10によって記載されるように、溶媒の濾過は、過酸化物を除去し、溶媒をクリア組織においても、蛍光の良好なレベルを維持することができる。パブリッシュマウスの脳全体を扱うときエド水系クリアリング方法14は、少なくとも非線形光学技術を用いて、蛍光効率が低下するが、透明性が劣るをもたらさない。
一方、現時点では、高屈折率(n≈1.56)を使用したソリューションをクリアするために補正長作動距離との商用目的はありません。したがって、試料が浸漬される媒体と対物レンズの設計つとの間の屈折率不整合は、強力な球面収差を生じさせる。顕微鏡の分解能を低下させる他に、そのような収差は、光が広い領域に広がっているので、画像強度とコントラストの低下をもたらす。この問題の回避策が補償光学15および/ または静的な非球面補正器の使用を含む。
短いため、画像のコントラストや強度の任意の改善が容易に、また、イメージング速度に影響画像毎tegration時間を選択することができる。現時点ではCLSMは、100ミリ秒9のカメラの露出時間で、約106μmの3 /秒の撮影速度を得ることができます。この速度では、試料のサイズに応じて、1〜3日から画像全体のマウス脳をとる。画質の大幅な劣化が主な原因シート光照明6の本質的な低光退色のような長いイメージングセッション全体に観察されないが、長い間、単一のマウスの脳は、実際には、CLSMの適用可能性を減らすことができる画像する必要がありました。検出のための高速カメラを用いて結合されたシステム効率の10倍の増加は、記載されたプロトコルの日常的な使用を可能にする、数時間に撮像時間を減少させるであろう。
すべての上記の制限があるにもかかわらず、未満でミクロンスケールの分解能で全体のマウスの脳を再構築するために、組織が許すの化学クリアに結合されたCLSMイメージング週。全脳イメージングのための他の光学的方法は、CLSMよりも高い解像度を与えるが、より長い準備及び/または撮像時間2-4の価格で、またはスパースZサンプリング5。
この資料に記載された方法は、蛍光標識するための様々な戦略と組み合わせて使用することができます。実際には等を選択した神経細胞のサブセット、ウイルス性トランスフェクション、実質内色素注入、蛍光タンパク質を発現するトランスジェニック動物は、動物の犠牲の前にすべての染色戦略はCLSMと互換性があります。実際に、全体のマウス脳の死後蛍光標識は、現在までに実証されていない、染色のような種類が近い将来に可能である場合には、とにかく、CLSMによって再構築することができる検体数ははるかに大きくなり、潜在的にヒトの脳組織を含む。
結論として、共焦点光シート顕微鏡TISと組み合わせて使用スー清算および多重解像度のデータ管理は、研究者は、ほとんどの研究室の手元によくある技術的な努力で、ミクロンスケールの分解能で巨視的検体を再構築し、分析することを可能にすることができる。 CLSMの潜在的なアプリケーションでは、神経科学に限定されるものではなく、もちろんですが、16,17や小動物18の解剖学的構造を、胚発生、光シート顕微鏡が既に使用された全ての研究分野にまたがる。
The authors have nothing to disclose.
これらの結果につながる研究は、N助成契約の下で、欧州連合(EU)セブンス枠組み計画(FP7/2007-2013)から資金提供を受けています。 228334と241526。の枠組みの中で、この研究プロジェクトにもヒューマン·フロンティア·サイエンス·プログラムの研究助成金(RGP0027/2009)によって支えられてきた、とイタリアの教育省、大学·研究により、フラッグシップ·プロジェクトNanomaxの枠組みの中で、健康のイタリア省「幹細胞は、提案募集」。この研究は、「エンテカッサディ·ディ·フィレンツェRisparmio」でサポートされているのICON財団の研究活動の枠組みの中で行われている。
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Phosphate Buffered Saline Tablets | Sigma-Aldrich | P4417_100TAB | |
Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1018 | |
Peroxide-free Tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 186562 | |
Aluminum oxide activated, basic, Brockmann I | Sigma-Aldrich | 199443 | |
Dibenzyl ether | Sigma-Aldrich | 108014 | |
Butylated hydroxytoluene | Sigma-Aldrich | W218405 | |
Agarose Type III-A, High EEO | Sigma-Aldrich | A9793 | |
Acrylic glue | Bostik | D2498 | |
Vaa3D software | open source | freely downloadable from http://www.vaa3d.org/ |