Biopolímeros Nano basados ​​en ácido polimálico de Focalización de múltiples Marcadores tumorales: una oportunidad para la medicina personalizada?

La inhibición del cáncer de mama HER2-positivo humano silenciando la expresión del receptor HER2 y el bloqueo de la señalización de HER2-12 Estrategia Entre las diferentes formas de cáncer de mama humano, los tumores HER2-positivos tienen el peor resultado clínico. Se presenta el tratamiento exitoso del cáncer de mama con sobreexpresión de HER2 humana en el modelo de ratón desnudo. La estrategia consiste en el fármaco activo tanto en el silenciamiento inmediata de la vía de señalización de HER2 empleando Herceptin y HER2-específica AON para el bloqueo de la síntesis depende de HER2-ARNm del receptor (Figura 1) nano. El conjugado nano plomo, que contiene Herceptin y anti-HER2 AON se muestra en la Figura 3, junto con dos controles que carecen de cualquiera de Herceptin o AON. El principal compuesto contenía anti-MsTfRmAb lograr extravasación activa de transcitosis through unión endotelial TfR de los vasos tumorales. Mucho menos la captación en el tumor se observó en ausencia del anticuerpo y se atribuyó a un tumor efecto EPR ​​dependiente 13. Versiones fluorescentes de los conjugados que contienen nano Alexa Fluor 680 fueron sintetizados por los estudios de imagen. . Figura 1 Mecanismo de entrega AON en células de cáncer de mama HER2-positivo y la inhibición del crecimiento tumoral Esquina superior izquierda:. Nano conjugado una adaptación de la figura 3. Esquina inferior izquierda: vasos tumorales de ratón que expresan TfR en la superficie. El fármaco de nano se une al receptor y entra en el tumor por transcitosis. Además, cierto grado de acceso al tumor es posible a través de las capas endoteliales desordenados que participan en el tumor incremento de la absorción y retenti dependienteen (EPR) 13. A continuación, el nanodroga se une a HER2 expresado en las células de cáncer humano y internaliza en los endosomas tempranos. Encuadernación bloques también HER2 vía de señalización. Después de la maduración de los endosomas y su acidificación, se activa el mecanismo de escape del endosoma del fármaco de nano. Nanodroga de entrar en el citoplasma se libera de la plataforma de nano por escisión reductora del disulfuro de espaciador y se une a HER2-ARNm de bloqueo de HER2-síntesis. El bloqueo de la síntesis se extiende el bloqueo de la señalización de HER2-e induce la inhibición del crecimiento tumoral. La producción microbiana de la plataforma ácido polimálico La plataforma conjugado nano, ácido polimálico (PMLA), fue producido por microplasmodia culta de Physarum polycephalum y purificado del caldo como se describe en el Protocolo y se representa en la figura 2. Producción y purificación eran lisas y reproducible. Era importante para cont tiempo de rol, el pH y la temperatura para evitar la división espontánea del polímero. Se recomienda el lavado cuidadoso y la elución de DEAE-columna con el fin de eliminar el ADN, los carbohidratos, las toxinas y material de color. Extrema pureza se obtuvo después de disolver en acetona anhidra y la eliminación de material insoluble. Importe total del producido PMLA fue de 5 ± 1 g por campaña. Las cantidades de 1,5 ± 0,5 g altamente purificados PMPLA de M w 80.000-100.000 se lograron reproducible cuando se usa el biorreactor de 10 l. Perfiles de elución Sec-HPLC eran simétricos. Análisis de dispersión de luz dinámica de acuerdo con la distribución número indicaba un solo pico correspondiente a un diámetro hidrodinámico de 8 ± 1 nm y un índice de polidispersidad de PDI = 0,10 ± 0,02, calculado por el software del instrumento para partículas esféricas asumidos. Potencial Zeta fue de -22 ± 2 mV (pH 7,5). / 50668/50668fig2highres.jpg "width =" 500 "/> Figura 2. Producción y purificación de ácido polimálico desde cultivadas plasmodios micro de Physarum polycephalum (adaptado de Lee et al. 9). Ácido polimálico (MPLA) se produce a partir de plasmodios de Physarum polycephalum en un biorreactor y se recogió del sobrenadante de cultivo mediante la unión de intercambiador de aniones (DEAE). El eluyente se precipitó-etanol como sal de calcio. Soluciones de la sal de calcio son Mw fraccionaron sobre Sephadex-G25-. Fracciones que contienen PMLA se convierten de la Ca-sal en el ácido sobre Amberlite IR-120H +. La libre PMLA finalmente se liofilizó para dar un polvo blanco seco. La síntesis química del conjugado nano plomo P / mPEG 5000 (5%) / Loet (40%) / AON (2,5%) / Herceptin (0,2%) / una nti-MsTfRmAb (0,2%) Las estructuras esquemáticas de la droga nano plomo y de dos conjugados nano precursor se muestran en la Fig. 3 Ure. El cable contiene todos los constituyentes, mientras que los precursores fueron diseñados para carecer de cualquiera de AON HER2 o el anticuerpo Herceptin. Además de AON y mAb, los compuestos que contiene polietilenglicol, MPEG 5000, para minimizar la unión a las proteínas plasmáticas, el aclaramiento a través del sistema retículo-endotelial (RES), y la degradación por escisión enzimática. La secuencia antisentido 5'-CAT-GGT-GCT-CAC-TGC-GGC-TCC-GGC-3 'es complementaria a Her2 ARNm y ha sido cuidadosamente probado in vitro en varias líneas celulares que expresan HER2 para obtener una alta especificidad hacia el bloqueo de HER2 síntesis y no muestra los efectos fuera de la meta. 8/50668fig3highres.jpg "width =" 500 "/> Figura 3. Nano conjuga para tratar el cáncer de mama HER2-positivo humano. Liderando drogas nano (estructura superior) contiene dos fármacos (Herceptin, AON HER2). Versiones 2 y 3 contienen sólo uno de los medicamentos. La absorción de 1 y 2 en las células tumorales que sobreexpresan HER2-humanos está gestionado por la unión de Herceptin. Nano conjugado 3, que no contiene Herceptin, recibió anti-HuTfRmAb para la absorción endosoma por las células humanas. La conjugación con Alexa Fluor 680 era opcional para los propósitos de formación de imágenes. La barra roja representa la plataforma conjugado nano PMLA / Loet (40%). % Indica la fracción de residuos de ácido málico consumidos en la unión del ligando indicado (cantidad total de residuos de ácido málico en el nanodroga = 100%). Figura 4. La síntesis química de nanoconjugados P / Loet / AON HER2 / anti-MsTfR/Herceptin De arriba a abajo:. Síntesis de succinimidiléster PMLA-N-hidroxi (PMLA-NHS) de carboxilatos colgante (activación química). Reemplazo de NHS por formación de amida con 2-mercapto-1-aminoethan (2-MEA), metil-PEG 5000-amina (mPEG 5000-NH 2), trileucina (LLL) o leucina éster etílico (Loet). Este "preconjugate" concede mAb-Mal-PEG-Mal por tioéter formación y AON por la formación de enlaces disulfuro escindibles. Restos de 2-MEA tiene un tope formando ácido amidoetil-ditio-propiónico. Sólo se muestra la unión de una sola mAb. Múltiples archivos adjuntos se gestionan mediante el uso de mezclas de mAbs. Porcentaje% denota fracciones de carboxilatos unidos a diversos ligandos (100% gratis PMLA). Los conjugados de nanopartículas se sintetizaron como se indica en la figura 4 Ure. El peso molecular calculado de la ventajaconjugado era 719.000. El rendimiento global de la síntesis fue 45 ± 5% con respecto al contenido de ácido málico. En promedio, de las 862 unidades malyl (= 100%) de la plataforma 100 kDa de MPLA, 40% lleva a Loet, 5% de mPEG, 2% AON 2%, 0,2% y 0,2% Herceptin anti-MsTfR mAb. La cantidad para cada anticuerpo correspondió a un promedio de 1,7 moléculas por molécula de plataforma PMLA. El% diseñado y el% que se verificó mediante análisis de grupo eran los mismos dentro de ± 5%. Un ejemplo es el caso dado en la Tabla 1 para el cálculo del contenido experimental de ácido málico, AON, mAb y mPEG 5000 y en la Tabla 2 muestra la comparación con el contenido por diseño. La alta pureza de acuerdo con los criterios establecidos en la sección 3 se logró sobre la base de altos rendimientos de reacción y separación eficiente por exclusión de tamaño (por ejemplo, libre de mAb y mAb-nanoconjugate están separados por 1 min en sec-HPLC), y la solubilidad selectiva en disolventes. La actividad de los anticuerpos monoclonales fue se muestra para ser retenido a lo largo de la síntesis de drogas nano, y se confirmó que los dos tipos de anticuerpos fueron ensamblados en la misma plataforma de polímero. El resultado de atípico experimento de ELISA se muestra en la figura 5 Ure. En general, los ensayos para el análisis cuantitativo grupo para el ácido málico, AON, proteína, PEG y para ELISA fueron robusta, dando resultados reproducibles cuando se realiza por personal diferente y la instrumentación no sólo en el caso de la síntesis descrita, sino también cuando se utilizan para el análisis de otros nanoconjugados sintetizados. Tabla 1. Cálculo de la composición nanodroga con referencia al contenido de ácido málico. 668table2.jpg "width =" 600 "/> Tabla 2. Comparación de la composición de fármaco de nano experimental con composición diseñada. Figura 5. ELISA para la medición de la afinidad del anticuerpo después de la síntesis química, y para la demostración de unión múltiple de diferentes anticuerpos. El fármaco de nano contiene anticuerpo mAb (A) y anticuerpo mAb (B) contra los antígenos A y B, respectivamente. Las placas de ELISA se recubren con antígeno (A). Libre de mAb (A), el mAb libre (B), y drogas nano se aplican a placas de ELISA. Después del lavado, los anticuerpos se prueban con peroxidasa secundaria anticuerpos acoplados específicos para mAb (A) o mAb (B), mientras que sólo el mAb (A) se une a antígeno (A). Se ve que el fármaco libre y nano conjugado con mAb (A), e indirectamente anticuerpo monoclonal conjugado (B) de la misma molécula de fármaco de nano, pero no libre de mAb (B), Se conservan en el plato. La dependencia de la concentración muestra afinidades de unión comparables para el mAb libre y conjugada (A), lo que indica que la conjugación química no afectó a la actividad de unión del anticuerpo. Por otra parte, el co-ligación de mAb (B) con el mAb (A) en la misma entidad física (plataforma nano) resultados en mAb (B) la detección de anticuerpos. Los resultados experimentales mostrados aquí se refieren a TfRmAb anti-humano (A) y anti-ratón TfRmAb (B). Resultados similares se han demostrado para otras parejas de anticuerpos probados, tales como anti-MsTfR mAb y anti-HER2 MAB (Herceptin). La investigación indicó fisicoquímica diámetro hidrodinámico 22,1 ± 2,3 nm para P / mPEG (5%) / Loet (40%) / AON (2%) / Herceptin (0,2%) / anti-MsTfRmAb (0,2%) (plomo, los dos- versión de drogas), 20,1 ± 2,4 nm para P / mPEG (5%) / Loet (40%) / AON (2%) / anti-MsTfRmAb (0,2%) / anti-HuTfRmAb (0,2%) (la versión de drogas AON) , y 15,1 ± 1,2 nm para P / mPEG (5%) / Loet (40%) / Herceptin (0,2%) (la versión de drogas Herceptin). Zeta-potenciales a pH 70.5 fueron en este orden -5,2 ± 0,4 mV, -5,7 ± 0,6 mV, y -4,1 ± 0,4 mV. Cabe mencionar que el diámetro hidrodinámico medido de conjugados nano no siguió la aditividad de los diámetros medidos para los componentes libres. La entrega de la droga nano a través de la membrana de la célula tumoral y la liberación en el citoplasma después de 0 horas y 3h r La entrega de fármaco de nano a través de la membrana celular por la absorción endosoma se muestra en la figura 6 Ure después de 0 horas y 3 horas. Etiquetas de fluorescencia están unidos a la plataforma nano de drogas (Alexa Fluor 680, verde) y para AON (lisamina, rojo). Su superposición se muestra en los paneles D y L y junto con la fluorescencia de endosomas marcados (azul) en los paneles de G & O. Coeficientes de correlación de Pearson (R (r) se calcula a partir de las imágenes en relación con la co-localización de la plataforma / endosomas, AON / endosomas, la plataforma / AON de 0 hy 3 h. Tque la imagen hr 3 indica la liberación de endosomas en el citoplasma y la disociación de AON de la droga nano por el glutatión dependiente de disulfuro de escisión en el citoplasma. Figura 6. La microscopía confocal de la absorción de conjugado de nano por las células diana (adaptado de Ding et al. 11). Las células se incubaron durante 30 min a 37 ° C con drogas nano que había sido doblemente marcado con Alexa Fluor 680 (verde) en la plataforma de polímero y con lisamina (rojo) unido a AON. Además, los endosomas se tiñeron con FM1-43 (azul). La localización se muestra después de las 0 horas (A) y 3 horas (B) incubación. Los paneles A, AB, B y, ij muestran la tinción de los fluoróforos conjugados nano solo, ysu co-localización en A, cd & B, kl. Además, la tinción de endosomas se muestra en los paneles A, E y B, M y la colocalización de conjugado nano y paneles endosomesin A, fg & B, no. Los paneles A, h & B, contraste p espectáculo fase para paneles respectivos. (C) de correlación de Pearson coeficientes de R (r) para la colocalización de la plataforma-endosomas, AON-endosomas, plataforma-AON calculado para las 0 horas y 3 horas. Por favor, haga clic en aquí para ver una versión más grande de esta figura. La inhibición de cáncer de mama humano in vitro e in vivo En la inhibición del crecimiento in vitro de células que sobreexpresan HER2 línea BT-474 en comcomparación con una baja línea celular expresando MDA-MB-231 se muestra en la fig ure 7. Grado de inhibición es del 50% y 30%, respectivamente, por el plomo conjugado nano P / MPEG / Loet / AON HER2 / Herceptin / anti-MsTfRmAb. Inhibición por los otros compuestos es menor pero mayor para BT-474 que para MDA-MB-231 células. Línea celular BT-474 fue elegido para el tratamiento de cáncer de mama xenogeneico ratón. Figura 7. Inhibición del crecimiento in vitro de que sobreexpresan HER2 BT-474 células de cáncer de mama y de bajo expresando MDA-MB-231 células (adaptado de Inoue et al. 12). Comparación de la inhibición del crecimiento para que sobreexpresan HER2 BT-474 línea celular de cáncer de mama ( izquierda) y de HER2 bajo expresando línea celular de cáncer de mama MDA-MB-231 (a la derecha). TfR (s) denota anti-MsTfRmAb y TfR (Hu / Ms) marca el anti-HuTfRmAb y anti-MsTfRmAb. El fármaco de nano plomo, P / MPEG / Loet / AON HER2 / Herceptin / TfR (MS), y las drogas nano desprovistos de cualquiera de Herceptin o AON de HER2 se comparan con PBS, Herceptin y AON HER2. En la ausencia de Herceptin, anti-MsTfRmAb se conjugó para proporcionar la absorción de endosoma por las células tumorales. Las concentraciones fueron 40 g / ml con respecto a los anticuerpos, 4 M con respecto a AON HER2, 4 M endoporter (aplicación de AON). Importancia denota por *, P <0,05: **, P <0,02: ***, P <0,003 en comparación con PBS. Los resultados del tratamiento in vivo en la Figura 8 se presentan para ratones portadores de BT-474 que sobreexpresan HER2 cáncer de mama humano. El crecimiento se inhibió> 95% por el nanodroga plomo que contiene Herceptin y HER2-específica AON en comparación con los controles tratados sólo con PBS (Fig. Ure 8). Inhibiciónera 60% o menos con Herceptin solo, P / MPEG / Loet / Herceptin o P / MPEG / Loet / AON / anti-MsTfRmAb / anti-HuTfRmAb. Western blot de extractos tumorales mostró inhibición tanto de la síntesis de HER2 y la fosforilación de Akt, pero ningún cambio de Akt total y la enzima GAPDH. PARP se escindió en correspondencia con un aumento del nivel de apoptosis. Imágenes de tumor después del tratamiento, y secciones de tejido teñidas con H & E que ilustra la regresión del tumor se muestran en la Fig. 9 Ure. Figura 8. El tamaño del tumor y las proteínas durante el tratamiento con medicamentos nano de plomo y precursores (adaptado de Inoue et al. 12). Un tamaño del tumor. Para los distintos tratamientos (día 21 a día 42, total 8 inyecciones). Las barras indican estándardesviaciones de la media. El plomo conjugada con anti-Her2 AON y Herceptin fue superior a solas Herceptin o conjugados de fármacos que contienen nanopartículas individuales. B. Efecto de los distintos tratamientos sobre la expresión de HER2, fosforilados Akt, Akt total, PARB, PARB hendidas y GAPDH se muestran por el Western Blot. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 9. Tratamiento de BT-474 de cáncer de mama positivo para HER2 humano en ratones desnudos. La regresión del tumor y la necrosis / apoptosis en secciones de tejido (adaptado de Ionue et al. 12). Superior: reducción del tumor (flechas rojas). Indicación de la pastilla de estrógeno para apoyar el crecimiento del tumor (flecha azul). Lower: Hematoxilina y Eosina (H & E) tinción de secciones de tumores. La proliferación tumoral se muestra por el empaquetamiento denso de las células tumorales. El tejido necrótico es vista en que se han eliminado las células tumorales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.