Polyäpfelsäure-basierten Nano Biopolymere für Targeting mehrerer Tumormarker: Eine Chance für die personalisierte Medizin?

Die Hemmung des menschlichen HER2-positivem Brustkrebs durch Schweigen HER2-Rezeptor-Expression und Sperr HER2-Signalgebung 12 Strategie Unter den verschiedenen Formen von menschlichem Brustkrebs, HER2-positiven Tumoren haben die schlechtesten klinischen Ergebnis. Wir präsentieren die erfolgreiche Behandlung von HER2-Überexpression menschlichen Brustkrebs in der Nacktmaus-Modell. Die Strategie beinhaltet die Nano Droge sowohl in der unmittelbaren Silencing des HER2-Signalweg Einsatz Herceptin und HER2-spezifischen AON zum Blockieren des HER2-mRNA-Synthese in Abhängigkeit des Rezeptors (Abbildung 1) aktiv. Die Bleinano Konjugat, das Herceptin und Anti-HER2 AON enthält, ist in Fig. 3 zusammen mit zwei Kontrollen, die frei von entweder Herceptin oder AON gezeigt. Die Bleiverbindung enthalten anti-MsTfRmAb aktive Extravasation transzytotisch thro erreichenugh Bindung an TfR der Tumorgefäße Endothelzellen. Viel geringer Aufnahme in den Tumor wurde in Abwesenheit des Antikörpers wurde notiert und die Tumor abhängig EPR-Effekt 13 zurückzuführen. Leuchtstoffversionen der Nano Konjugate, die Alexa Fluor 680 wurden für die bildgebenden Studien synthetisiert. . Abbildung 1 Mechanismus der AON Lieferung in HER2-positiven Brustkrebszellen und Tumorwachstumshemmung Linke obere Ecke:. Nano-Konjugat aus 3 angepasst. Linke untere Ecke: Maus exprimieren Tumorgefäße TfR auf der Oberfläche. Die Nano Medikament an den Rezeptor bindet und in den Tumor durch Transzytose. Darüber hinaus ist ein gewisser Grad von Zugriff auf den Tumor durch die ungeordneten Schichten Endothelzellen, die in Tumor teilnehmen abhängig wodurch die Aufnahme und retenti möglichauf (EPR) 13. Weiter bindet das nanodrug HER2 exprimiert auf den menschlichen Krebszellen und in frühe Endosomen internalisiert. Binding blockiert auch HER2-Signalweg. Nach der Reifung der Endosomen und ihre Versauerung wird die Endosomen Escape-Mechanismus der Nano Medikament aktiviert. Nanodrug in das Zytoplasma von Nano Plattform durch reduktive Spaltung der Disulfid-Abstands freigesetzt und bindet an HER2-mRNA blockieren HER2-Synthese. Blockierung der Synthese erstreckt Sperrung von HER2-Signalgebung und induziert Hemmung des Tumorwachstums. Mikrobielle Produktion der Polyäpfelsäure Plattform Die Nano-Konjugat-Plattform, Polyäpfelsäure (PMLA) wurde durch kultivierte microplasmodia von Physarum polycephalum und aus der Brühe nach dem Protokoll beschrieben und in Fig. 2 dargestellt gereinigten hergestellt. Herstellung und Reinigung waren glatt und reproduzierbar. Es war wichtig, cont rol Zeit, pH-Wert und Temperatur auf die spontane Spaltung des Polymers zu vermeiden. Sorgfältiges Waschen und Elution der DEAE-Säule, um die DNA, Kohlenhydrate, Toxine und farbigen Materials zu entfernen empfohlen. Extreme Reinheit wurde nach Lösen in wasserfreiem Aceton und Entfernen von unlöslichen Material erhalten. Gesamtbetrag der produzierten PMLA war 5 ± 1 g pro Kampagne. Mengen von 1,5 ± 0,5 g hochgereinigten PMPLA von M w 80.000-100.000 wurden reproduzierbar, wenn Sie die 10-l-Bioreaktor erreicht. SEC-HPLC-Elutionsprofile waren symmetrisch. Dynamische Lichtstreuungsanalyse nach Anzahlverteilung zeigte einen einzelnen Peak, der einem hydrodynamischen Durchmesser von 8 ± 1 nm und einem Polydispersitätsindex PDI = 0,10 ± 0,02, von der Gerätesoftware übernommen für kugelförmige Partikel berechnet wird. Zetapotential betrug -22 ± 2 mV (pH 7.5). / 50668/50668fig2highres.jpg "width =" 500 "/> 2. Herstellung und Reinigung von Polymaleinsäure aus kultivierten Mikro Plasmodien von Physarum polycephalum (von Lee et al. 9 angepasst). Polyäpfelsäure (PMLA) von Plasmodien Physarum polycephalum in einem Bioreaktor hergestellt und aus dem Kulturüberstand durch Bindung an Anionenaustauscher (DEAE) gesammelt. Das Elutionsmittel wird als Calciumsalz in Ethanol ausgefällt. Lösungen des Calciumsalzes sind über Sephadex-G25-Mw fraktioniert. PMLA haltigen Fraktionen werden aus dem Ca-Salz in die Säure über Amberlite IR-120H + umgewandelt. Die kostenlose PMLA schließlich gefriergetrocknet, um trockenes, weißes Pulver erhalten. Chemische Synthese des Leiternano Konjugat P / mPEG 5000 (5%) / Loet (40%) / AON (2,5%) / Herceptin (0,2%) / a nti-MsTfRmAb (0,2%) Die schematischen Strukturen des Leiternano Medikament und von zwei Vorläufer nano-Konjugate sind in Abbildung 3 dargestellt. Das Blei enthält alle Bestandteile, während die Vorläufer wurden entwickelt, um entweder AON HER2 oder den Antikörper Herceptin fehlt. Neben AON und mAbs, die Verbindungen enthalten Polyethylenglykol, mPEG 5000, Bindung an Plasmaproteinen zu minimieren, Freigabe durch die retikuloendothelialen Systems (RES) und dem Abbau durch enzymatische Spaltung. Das Antisense-Sequenz 5'-CAT-GGT-GCT-CAC-TGC-GGC-TCC-GGC-3 'war komplementär zu mRNA Her2 und wurde sorgfältig in vitro auf mehreren HER2-exprimierenden Zelllinien getestet, um eine hohe Spezifität zu blockieren HER2 erhalten Synthese und nicht zeigen, Off-Target-Effekte. 8/50668fig3highres.jpg "width =" 500 "/> Abbildung 3. Nano-Konjugate für die menschliche Behandlung von HER2-positivem Brustkrebs zu behandeln. Führende Drogen nano (oben Struktur) enthält zwei Medikamente (Herceptin, AON HER2). Versionen 2 und 3 enthalten nur eines der Medikamente. Aufnahme von 1 und 2 in menschlichen HER2-überexprimierende Tumorzellen wird durch die Bindung von Herceptin verwaltet. Nano-Konjugat 3, die nicht Herceptin enthält, erhalten Anti-HuTfRmAb für Endosomen Aufnahme durch die menschlichen Zellen. Die Konjugation mit Alexa Fluor 680 war optional zur Bildgebung. Der rote Balken stellt die Nano Konjugat-Plattform-PMLA / Loet (40%). % Gibt den Anteil der Äpfelsäurereste an der Bindung der angegebenen Liganden (Gesamtmenge der Äpfelsäurereste in der nanodrug = 100%) verzehrt. 4. Chemische Synthese von NanoKonjugate P / Loet / AON HER2 / anti-MsTfR/Herceptin Von oben nach unten: Synthese von PMLA-N-Hydroxy succinimidylester (PMLA-NHS) der Anhänger Carboxylate (chemische Aktivierung).. Ersatz von NHS durch Amidbildung mit 2-Mercapto-1-Aminoethan (2-MEA), Methyl-PEG 5000-Amin (mPEG 5000-NH 2), Trileucin (LLL) oder Leucin ethylester (Loet). Diese "preconjugate" legt mAb-Mal-PEG-Mal durch Thioether Bildung und AON durch Bildung von Disulfidbrücken spaltbar. Leftover 2-MEA wird verschlossen Bildung amidoethyl-Dithio-Propionsäure. Nur Anbringung eines einzigen mAb gezeigt. Mehrere Anhänge werden durch Verwendung von Mischungen von mAb verwaltet. Prozentual% bedeutet Fraktionen von Carboxylaten zu verschiedenen Liganden (100% kostenlos PMLA) gebunden. Die Nano-Konjugate wurden synthetisiert, wie in Abbildung 4 dargestellt. Das berechnete Molekulargewicht des LeitungsKonjugat war 719.000. Die Gesamtausbeute der Synthese betrug 45 ± 5% bezüglich der Äpfelsäure-Gehalt. Im Durchschnitt der 862 Malyl Einheiten (= 100%) der 100 kDa PMLA Plattform ausgeführt Loet 40%, 5% mPEG, 2% AON 2%, 0,2% und 0,2% Herceptin Anti MsTfR mAb. Die Menge für jeden Antikörper entsprach durchschnittlich 1,7 Moleküle pro Molekül des PMLA Plattform. Die% ausgelegt und die% von Gruppe-Analyse verifiziert waren die gleichen, innerhalb von ± 5%. Ein Beispiel ist die in Tabelle 1 für die Berechnung der experimentellen Gehalt an Äpfelsäure, AON-mAb und MPEG 5000 und in Tabelle 2 zeigt den Vergleich mit dem Inhalt von Auslegungsfall. Die hohe Reinheit nach den Kriterien in Abschnitt 3 wurde auf der Grundlage der hohen Reaktionsausbeuten und effiziente Trennung durch Größenausschluss (z. B. freie mAb und mAb-nanoconjugate werden von 1 min auf s-HPLC) und selektive Löslichkeit in Lösungsmitteln gelöst. Die Aktivität der monoklonalen Antikörper war gezeigt, während Nanowirkstoffsynthese zurückgehalten werden, und es wurde bestätigt, dass die beiden Arten von Antikörpern sind auf dem gleichen Polymerplattform montiert. Das Ergebnis der atypischen ELISA-Experiment ist in Abbildung 5 dargestellt. Im Allgemeinen waren die Assays für die quantitative Analyse Gruppe Äpfelsäure, AON, Protein und PEG für ELISA robust, wodurch reproduzierbare Ergebnisse, wenn sie von unterschiedlichem Personal und Instrumente nicht nur im Fall der beschriebene Synthese durchgeführt wird, sondern auch, wenn für die Analyse verwendet andere Nanokonjugate synthetisiert. Tabelle 1. Berechnung der nanodrug Zusammensetzung mit Bezug zu Apfelsäuregehalt. 668table2.jpg "width =" 600 "/> Tabelle 2. Vergleich von experimentellen Nano-Wirkstoffzusammensetzung mit entworfen Zusammensetzung. Figur 5 ELISA. Zur Messung der Antikörperaffinität nach der chemischen Synthese, und zur Demonstration der Bindung von mehreren verschiedenen Antikörpern. Die Nano Medikament enthält Antikörper mAb (A) und dem Antikörper mAb (B) gegen die Antigene A und B sind. ELISA-Platten mit Antigen (A) beschichtet. Kostenlose mAb (A), freie mAb (B), und Nanodrogen werden ELISA-Platten aufgebracht. Nach dem Waschen werden die sekundären Antikörper mit Peroxidase-gekoppelten mAb spezifisch für entweder (A) oder mAb (B)-Antikörper getestet, und nur mAb (A) wird an das Antigen (A) gebunden. Es ist ersichtlich, dass der freie und Nano Arzneimittel konjugiert mit mAb (A) und indirekt konjugierten mAb (B) der gleichen nano Wirkstoffmolekül, aber nicht frei mAb (B), Auf der Platte gehalten. Die Konzentrationsabhängigkeit zeigt vergleichbare Bindungsaffinitäten für freie und konjugierte mAb (A), was darauf hinweist, dass die chemische Konjugation hatte keinen Einfluss auf Antikörper-Bindungsaktivität. Auch die Co-Ligation von mAb (B) mit mAb (A) auf der gleichen physischen Einheit (Nano-Plattform) zu Antikörper mAb (B) Detektion. Die hier gezeigten Versuchsergebnisse beziehen sich auf Anti-Human TfRmAb (A) und anti-Maus-TfRmAb (B). Ähnliche Ergebnisse wurden für andere Antikörper-Paare getestet, wie Anti MsTfR mAb und Anti-HER2-mAb (Herceptin) gezeigt. Die physikalisch-chemischen Untersuchung zeigte hydrodynamischen Durchmesser von 22,1 ± 2,3 nm für P / mPEG (5%) / Loet (40%) / AON (2%) / Herceptin (0,2%) / anti-MsTfRmAb (0,2%) (Blei, das Zwei Arzneimittel-Version), 20,1 ± 2,4 nm für P / mPEG (5%) / Loet (40%) / AON (2%) / anti-MsTfRmAb (0,2%) / anti-HuTfRmAb (0,2%) (der AON Medikament Version) , und 15,1 ± 1,2 nm für P / mPEG (5%) / Loet (40%) / Herceptin (0,2%) (die Droge Herceptin Version). Zeta-Potential bei pH 70,5 waren in dieser Reihenfolge -5,2 ± 0,4 mV, -5,7 ± 0,6 mV und -4,1 ± 0,4 mV. Es sollte erwähnt werden, dass der gemessene hydrodynamischen Durchmesser von Nano-Konjugate nicht folgen Additivität der Durchmesser für freie Komponenten gemessen. Lieferung von Nano-Arzneimittel durch die Tumor Zellmembran und Freisetzung in das Zytoplasma nach 0 h und 3 h r Die Lieferung von Nano Arzneimittels durch die Zellmembran durch Endosom Aufnahme ist in Abbildung 6 gezeigt, nach 0 Stunden und 3 Stunden. Fluoreszenz-Etiketten werden in den Nano-Wirkstoffplattform (Alexa Fluor 680, grün) und AON (Lissamin, rot) angebracht. Deren Überlagerung in Platten D und L zusammen mit der Fluoreszenz des markierten Endosomen (blau) in Platten G & O. gezeigten Pearson-Korrelationskoeffizienten (R (r) wurden von den Bildern über die Co-Lokalisierung der Plattform / Endosomen, AON / Endosomen-Plattform / AON für 0 h und 3 Stunden. T berechneter 3 Stunden angegeben Bildmitteilung von Endosomen in das Zytoplasma und Dissoziation von AON von der Nano-Medikament von Glutathion-abhängigen Disulfid-Spaltung im Zytoplasma. Abbildung 6. Konfokale Mikroskopie für Nano-Konjugat-Aufnahme durch die Zielzellen (von Ding et al. 11 angepasst). Zellen wurden 30 min bei 37 ° C mit Nano Medikament, wurde doppelt mit Alexa Fluor 680 (grün) in der Polymerplattform und mit Lissamine (rot) markiert AON angebracht war, inkubiert. Darüber hinaus wurden Endosomen mit FM1-43 (blau) gefärbt. Der Ort ist nach 0 h (A) und 3 h (B) Inkubation gezeigt. Felder A, ab, & B, ij Show Färbung durch die Nano-Konjugat Fluorophore allein, undihre Co-Lokalisation in A, cd & B, kl. Zusätzlich wird Färbung von Endosomen in den Feldern A, E & B, m und die Co-Lokalisation von Nano-Konjugat und endosomesin Platten A, gezeigt fg & B, nein. Panels A, h & B, S. Show Phasenkontrast für die jeweiligen Panels. (C) Pearson-Korrelationskoeffizienten R (r) für die Co-Lokalisation von Plattform-Endosomen, AON-Endosomen, Plattform-AON für 0 h und 3 h berechnet. Bitte klicken hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Hemmung der humanen Brustkrebs in vitro und in vivo In-vitro-Wachstumshemmung von HER2-Überexpression Zelllinie BT-474 in comVergleich mit niedrig exprimierenden Zelllinie MDA-MB-231 ist in Abbildung 7 dargestellt. Grad der Hemmung 50% und 30%, bzw. von der Leitung Nano Konjugat P / MPEG / Loet / AON HER2 / Herceptin / Anti MsTfRmAb. Inhibition von anderen Verbindungen weniger, aber höher für BT-474 als für MDA-MB-231-Zellen. BT-474-Zelllinie wurde für die Behandlung von Brustkrebs xenogenen Maus gewählt. Figur 7. In vitro Wachstumshemmung von HER2-überexprimierenden BT-474-Brustkrebszellen und niedrig exprimierenden MDA-MB-231-Zellen. Vergleich der Wachstumshemmung für HER2 überexprimieren, BT-474-Brustkrebszelllinie (von Inoue et al. 12 angepasst) ( links) und von HER2 exprimieren niedrige Brustkrebszelllinie MDA-MB-231 (rechts). TfR (n) bezeichnet Anti-MsTfRmAb und TfR (Hu / Frau) bezeichnet Anti-HuTfRmAb & Anti-MsTfRmAb. Das Blei nano Droge, P / MPEG / Loet / AON HER2 / Herceptin / TfR (Ms) und nano frei von Drogen entweder Herceptin oder AON HER2 werden mit PBS, Herceptin und AON HER2 verglichen. In Abwesenheit von Herceptin, Anti MsTfRmAb wurde konjugiert an Endosom Aufnahme durch die Tumorzellen bereitzustellen. Konzentrationen waren 40 ug / ml im Hinblick auf Antikörper, 4 &mgr; M im Hinblick auf die AON HER2, 4 uM endoporter (Anwendung von AON). Bedeutung von * bezeichnet, P <0,05: ** p <0,02: *** p <0,003 im Vergleich mit PBS. Die Ergebnisse der in vivo-Behandlung in 8 Mäusen, die für BT-474 Her2-überexprimierenden humanen Brustkrebs dargestellt. Das Wachstum wurde durch die Führung nanodrug enthält Herceptin und HER2-spezifischen AON im Vergleich zu Kontrollen nur mit PBS (Abb. Abbildung 8) behandelt gehemmt> 95%. Hemmung60% oder weniger mit Herceptin allein, P / MPEG / Loet / Herceptin oder P / MPEG / Loet / AON / anti-MsTfRmAb / anti-HuTfRmAb. Western-Blot-Analyse von Tumorextrakten zeigte Hemmung sowohl HER2-Synthese und Akt Phosphorylierung, aber keine Änderung der Gesamt Akt und Hauswirtschaft Enzym GAPDH. PARP wurde in Übereinstimmung mit einem erhöhten Niveau der Apoptose gespalten. Bilder von Tumor nach der Behandlung und Gewebeschnitte mit H & E-gefärbten Tumorregression Veranschaulichung sind in Abb. Abbildung 9 dargestellt. Figur 8. Tumorgröße und Proteine ​​während der Behandlung mit Blei-und Vorläufernano Drogen (von Inoue et al. 12 angepasst). A. Tumorgröße für die verschiedenen Behandlungen (Tag 21 bis Tag 42, insgesamt 8 Injektionen). Die Balken zeigen StandardAbweichungen vom Mittelwert. Das Blei mit Anti-Her2 AON und Herceptin konjugiert überlegen war, entweder allein oder Herceptin einziges Medikament mit Nano-Konjugate. B. Wirkung der verschiedenen Behandlungen auf die Expression von HER2, phosphoryliert Akt, Gesamt Akt, PARB, gespalten PARB und GAPDH durch Western-Blot gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 9. Behandlung von HER2-positivem BT-474 menschlichen Brustkrebs auf Nacktmäusen. Tumorrückbildung und Nekrose / Apoptose in Gewebeschnitten (von Ionue et al. 12 angepasst). Obermaterial: Schrumpfung des Tumors (rote Pfeile). Anzeige der Östrogen-Pellet, das Tumorwachstum (blauer Pfeil) unterstützen. Lower: Hämatoxilin & Eosin (H & E)-Färbung von Tumorschnitte. Proliferierende Tumor wird durch die dichte Packung von Tumorzellen gezeigt. Nekrotischen Gewebes ist zu sehen, wo Tumorzellen eliminiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.