À base de ácido Polymalic Nano Biopolímeros para Segmentação de múltiplos marcadores tumorais: uma oportunidade para a medicina personalizada?

A inibição do câncer de mama HER2-positivo humano ao silenciar a expressão do receptor HER2, impedindo a sinalização HER2-12 Estratégia Entre as diferentes formas de câncer de mama humano, os tumores HER2-positivos têm o pior resultado clínico. Apresentamos o sucesso do tratamento de câncer de mama com superexpressão de HER2 humano no modelo nu mouse. A estratégia envolve a droga activa em nano tanto o silenciamento imediata da via de sinalização de HER2 empregando Herceptin e AON HER2-specific para o bloqueio da síntese de ARNm de HER2-dependente do receptor (Figura 1). O conjugado nano chumbo, que contém Herceptin e anti-HER2 AON é mostrado na Figura 3, juntamente com os dois controles, que são desprovidos de qualquer Herceptin ou AON. O composto de chumbo contido anti-MsTfRmAb para alcançar extravasamento ativo por transcitose through ligação endotelial TfR dos vasos tumorais. Muito menos absorção para dentro do tumor foi observada na ausência do anticorpo, e foi atribuído ao tumor dependente efeito EPR ​​13. Versões fluorescentes de conjugados contendo nano Alexa Fluor 680 foram sintetizados por exames de imagem. . Figura 1 Mecanismo de entrega AON em células de câncer de mama HER2-positivo e inibição do crescimento do tumor canto superior esquerdo:. Conjugado Nano adaptado da Figura 3. Canto inferior esquerdo: vasos tumorais rato expressando TfR na superfície. A droga nano se liga ao receptor e entra no tumor por transcitose. Além disso, um certo grau de acesso para o tumor é possível através das camadas endoteliais desordenadas que participam de tumor dependente de aumentar a captação e retentiem (EPR) 13. Em seguida, o nanodrug se liga ao HER2 expressa nas células cancerosas humanas e internaliza no início endosomes. Encadernação blocos também HER2 via de sinalização. Após a maturação de endosomes ea sua acidificação, o mecanismo endosome fuga da droga nano é ativado. Nanodrug entrar no citoplasma é libertado a partir da plataforma de nano por clivagem redutora de dissulfureto espaçador e liga-se à proteína HER2 ARNm bloqueio HER2-síntese. O bloqueio da síntese de bloqueio estende-se à proteína HER2 sinalização e induz a inibição do crescimento do tumor. Produção microbiana da plataforma ácido polymalic A plataforma conjugado nano, ácido polymalic (MPLA), foi produzido por microplasmodia cultivadas de Physarum polycephalum e purificada a partir do caldo, como descrito no protocolo e ilustrado na Figura 2. Produção e purificação eram lisas e reprodutível. Era importante cont rol tempo, pH e temperatura para evitar a clivagem espontânea do polímero. Lavagem cuidadosa e eluição da coluna de DEAE-é recomendado, a fim de remover o ADN, hidratos de carbono, toxinas e materiais coloridos. Extrema pureza foi obtida após dissolução em acetona anidra e remoção do material insolúvel. A quantidade total de produção foi de 5 PMLA ± 1 g por campanha. Os valores de 1,5 ± 0,5 g altamente purificado PMPLA de M w 80.000-100.000 foram reproducibly alcançada ao utilizar a 10 L biorreator. Perfis de eluição Sec-HPLC foram simétricas. A análise da dispersão de luz dinâmica de acordo com a distribuição do número indicado um único pico correspondendo a um diâmetro hidrodinâmico de 8 ± 1 nm e um índice de polidispersão de PDI = 0,10 ± 0,02, calculada pelo software do aparelho para as partículas esféricas assumidas. Potencial zeta foi -22 ± 2 mV (pH 7,5). / 50668/50668fig2highres.jpg "width =" 500 "/> Figura 2. Produção e purificação de ácido a partir de micro polymalic plasmódios cultivadas de Physarum polycephalum (adaptado a partir de Lee et al. 9). Ácido Polymalic (MPLA) é produzido a partir de plasmódios Physarum polycephalum em um biorreator e recolhidos a partir do sobrenadante da cultura através da ligação em permutador de aniões (DEAE). O eluente é etanol-precipitou como sal de cálcio. As soluções do sal de cálcio são Mw fraccionado sobre Sephadex-G25. PMLA contendo frações são convertidos a partir do Ca-sal no ácido sobre Amberlite IR-120H +. A livre PMLA está finalmente liofilizado para produzir um pó branco seco. A síntese química do conjugado nano liderança P / mPEG 5000 (5%) / Loet (40%) / AON (2.5%) / Herceptin (0,2%) / a nti-MsTfRmAb (0,2%) As estruturas esquemáticas da droga nano chumbo e de dois conjugados precursor nano são mostrados na Fig. ra 3. O chumbo contém todos os componentes, enquanto que os precursores foram concebidos para a falta ou AON HER2 ou o anticorpo Herceptin. Além AON e mAbs, os compostos contidos polietileno glicol, MPEG 5000, para minimizar a ligação às proteínas plasmáticas, a depuração através do sistema retículo-endotelial (RES) e degradação por clivagem enzimática. A sequência antisense 5'-CAT-GGT-GCT-CAC-TGC-GGC-TCC-GGC-3 'era complementar a Her2 mRNA e foi cuidadosamente testado in vitro em várias linhas de células que expressam HER2 obter alta especificidade para o bloqueio HER2 síntese e não mostrando efeitos off-alvo. "Width =" 500 8/50668fig3highres.jpg "/> Figura 3. Nano conjuga para tratar o câncer de mama HER2-positivo humano. Liderando droga nano (estrutura superior) contém duas drogas (Herceptin, AON HER2). Versões 2 e 3 contêm apenas um dos medicamentos. Captação de 1 e 2 em células do tumor HER2-overexpressing humanos é gerido pela ligação de Herceptin. Nano conjugado 3, que não contém o Herceptin, receberam anti-HuTfRmAb para a absorção do endossoma por as células humanas. A conjugação com Alexa Fluor 680 era opcional para fins de imagem. A barra vermelha representa a plataforma conjugado nano PMLA / Loet (40%). % Indica a fracção de resíduos de ácido málico consumidos na ligação do ligando indicada (quantidade total de resíduos de ácido málico no nanodrug = 100%). Figura 4. Síntese química de nanoconjugados P / Loet / AON HER2 / anti-MsTfR/Herceptin De cima para baixo:. Síntese de éster succinimidyl PMLA-N-hidroxi (MPLA-NHS) de carboxilatos pingente (ativação química). Substituição de NHS por formação de amida com o 2-mercapto-1-aminoethan (2-MEA), metil-PEG 5000-amina (MPEG 5000-NH 2), trileucina (LLL) ou leucina etílico (Loet). Este "preconjugate" atribui mAb-Mal-PEG-Mal por formação de tioéter e AON por formação de ligações dissulfureto quebráveis. Sobra 2-MEA é tampado formando-ditio-propiônico amidoetil ácido. Apenas a ligação de um único mAb é mostrado. Vários anexos são gerenciados usando misturas de mAbs. Percentagem% significa frações de carboxilatos vinculados a vários ligantes (100% de graça PMLA). Os conjugados de nano foram sintetizados como descrito na Fig. 4 ure. O peso molecular calculado do chumboconjugado foi 719.000. O rendimento global da síntese foi de 45 ± 5% no que diz respeito ao conteúdo de ácido málico. Em média, as 862 unidades malil (= 100%) da plataforma 100 kDa MPLA, 40% realizado Loet, 5% de mPEG, 2% AON 2%, 0,2% e 0,2% Herceptin anti-MsTfR mAb. O valor para cada anticorpo corresponde a uma média de 1,7 moléculas por molécula de plataforma PMLA. O% projetado eo% verificada por análise do grupo eram os mesmos dentro de ± 5%. Um exemplo é o caso, dado na Tabela 1 para o cálculo do teor experimental de ácido málico, AON, mAb e mPEG 5000 e na Tabela 2 mostra a comparação com o conteúdo de desenho. O elevado grau de pureza de acordo com os critérios previstos no capítulo 3 foi obtido com base em rendimentos elevados de reação e separação eficiente por exclusão de tamanho (por exemplo, livre e mAb mAb-nanoconjugate estão separados por 1 min em sec-HPLC) e solubilidade seletiva em solventes. A actividade de anticorpos monoclonais era mostrado a ser mantida durante a síntese de drogas nano, e confirmou-se que os dois tipos de anticorpos foram montados sobre a mesma plataforma polímero. O resultado da experiência de ELISA atípica é mostrado na Fig. 5 ure. Em geral, os ensaios para a análise quantitativa por grupo de ácido málico, AON, proteína, PEG e para ELISA foram robustos, com resultados reprodutíveis quando realizado por pessoal diferente e instrumentação não apenas no caso da síntese relatados, mas também, quando utilizado para a análise de outros nanoconjugates sintetizados. Tabela 1. Cálculo da composição nanodrug com referência ao conteúdo em ácido málico. "Width =" 600 668table2.jpg "/> Tabela 2. Comparação da composição da droga experimental nano com composição projetado. Figura 5. ELISA para a medição da afinidade dos anticorpos após a síntese química, e para demonstração de múltiplos de ligação de anticorpos diferentes. Nano A droga contém anticorpo mAb (A) e anticorpo mAb (B) contra os antigénios A e B, respectivamente. As placas de ELISA são revestidas com antigénio (A). MAb livre (A), mAb livre (B), e drogas de nano são aplicadas a placas de ELISA. Após a lavagem, os anticorpos são testados com peroxidase secundário anticorpos acoplados específicos para mAb (A) ou mAb (B), enquanto que apenas o mAb (A) está ligado ao antigénio (A). É visto que o fármaco livre e nano conjugada com mAb (A) e, indirectamente, conjugados de mAb (B) da mesma molécula de droga nano, mas não de mAb livre (B), São retidos na placa. A dependência da concentração mostra as afinidades de ligação comparáveis ​​para a livre e conjugado mAb (A), indicando que a conjugação química não afectou a actividade de ligação do anticorpo. Além disso, a co-ligação de mAb (B) com o mAb (A) sobre a mesma entidade física (plataforma nano) resulta em anticorpo mAb (B) de detecção. Os resultados experimentais aqui apresentados referem-se a TfRmAb anti-humano (A) e anti-rato TfRmAb (B). Resultados semelhantes foram mostrados para outros pares de anticorpos testados, tais como anti-MsTfR mAb anti-HER2 e o mAb (Herceptin). A investigação de propriedades físico-químicas indicadas diâmetro hidrodinâmico de 22,1 ± 2,3 nm, para o P / mPEG (5%) / Loet (40%) / AON (2%) / Herceptin (0,2%) / anti-MsTfRmAb (0,2%) (chumbo, a dois versão da droga), 20,1 ± 2,4 nm, para o P / mPEG (5%) / Loet (40%) / AON (2%) / anti-MsTfRmAb (0,2%) / anti-HuTfRmAb (0,2%) (a versão droga AON) e 15,1 ± 1,2 nm, para o P / mPEG (5%) / Loet (40%) / Herceptin (0,2%) (a versão fármaco Herceptin). Zeta-potenciais, a pH 70,5 foram nesta ordem -5,2 ± 0,4 mV, -5,7 ± 0,6 mV, e -4,1 ± 0,4 mV. Deve ser mencionado que o diâmetro hidrodinâmico medido de nano conjugados não seguiu aditividade dos diâmetros medidos para componentes livres. Entrega de drogas nano através da membrana da célula tumoral e liberar para o citoplasma, após 0 horas e 3h r A entrega de drogas nano através da membrana da célula através da incorporação do endossoma é mostrado na Fig. 6 ure após 0 h e 3 h. Etiquetas de fluorescência estão ligados à plataforma nano droga (Alexa Fluor 680, verde) e AON (Lissamina, vermelho). A sua sobreposição é mostrado nos painéis D e L e em conjunto com a fluorescência de endossomas marcados (azul) em painéis G & O. Os coeficientes de correlação de Pearson (r (r) foram calculados a partir das imagens sobre a co-localização de plataforma / endosomes, AON / endosomes, plataforma / AON para 0 horas e 3 horas. Tele imagem 3 hr indicado libertação de endossomas para o citoplasma e dissociação de AON do fármaco nano-dependente glutationa clivagem no citoplasma. Figura 6. Microscopia confocal para a absorção do conjugado nano por células alvo (adaptado a partir de Ding et al. 11). As células foram incubadas durante 30 min a 37 ° C com droga nano, que tinha sido marcado duas vezes com Alexa Fluor 680 (verde) na plataforma de polímero e com lissamina (vermelho) ligado ao AON. Além disso, endosomes foram marcadas com FM1-43 (azul). A localização é mostrado depois de 0 h (A) e 3 horas (B), incubação. Painéis A, AB, & B, ij show de coloração pelo menos os fluoróforos conjugadas nano, esua co-localização em A, cd & B, kl. Além disso, a coloração de endosomes é mostrado nos painéis A, e & B, M e da co-localização de conjugado nano e painéis endosomesin A, fg & B, não. Painéis A, H & B, contraste de fase p show para respectivos painéis. (C) de correlação de Pearson coeficientes R (r) para a co-localização de plataforma-endosomes, AON-endosomes, plataforma de AON calculado para 0 horas e 3 horas. favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. A inibição do cancro da mama humano in vitro e in vivo Na inibição do crescimento in vitro de HER2 superexpressão linha celular BT-474 em comparação com baixo linha de células que expressa de MDA-MB-231 é mostrada na Fig. 7 ure. O grau de inibição é 50% e 30%, respectivamente, pela ligação do conjugado nano P / mPEG / Loet / AON HER2 / Herceptin / anti-MsTfRmAb. Inibição por outros compostos, mas é menos elevado para BT-474 do que para MDA-MB-231. A linha celular BT-474 foi escolhida para o tratamento do cancro da mama do rato xenogénico. Figura 7. In vitro de inibição do crescimento de HER2 overexpressing células BT-474 de cancro da mama e baixa expressão de MDA-MB-231 (adaptado a partir de Inoue et al. 12). Comparação da inibição do crescimento para HER2 overexpressing BT-474 A linha celular de cancro da mama ( à esquerda) e do HER2 baixo expressar linha de células de câncer de mama MDA-MB-231 (direita). TfR (s) indica a anti-MsTfRmAb e TfR (Hu / Ms) denota anti-HuTfRmAb & anti-MsTfRmAb. A droga nano chumbo, P / MPEG / Loet / AON HER2 / Herceptin / DTR (Ms), e nano drogas desprovidas de qualquer Herceptin ou AON HER2 são comparados com PBS, Herceptin e AON HER2. Na ausência de Herceptin, anti-MsTfRmAb foi conjugado para proporcionar absorção endossoma pelas células tumorais. As concentrações foram de 40 ug / ml em relação aos anticorpos, 4 uM no que diz respeito ao AON HER2, 4 uM endoporter (aplicação de AON). Significância denotado por *, P <0,05: **, P <0,02: ***, P <0,003 em comparação com PBS. Os resultados do tratamento in vivo na Figura 8 são apresentados para ratinhos portadores de BT-474 que sobre-expressam Her2 cancro da mama humano. O crescimento foi inibida> 95% pela nanodrug chumbo contendo Herceptin e AON HER2-specific em comparação com os controlos tratados apenas com PBS (Fig. ure 8). Inibiçãofoi de 60% ou menos com Herceptin sozinho, P / MPEG / Loet / Herceptin ou P / MPEG / Loet / AON / anti-MsTfRmAb / anti-HuTfRmAb. Análise de Western blot de extractos de tumores mostraram inibição da síntese tanto HER2 e Akt fosforilação, mas nenhuma mudança de Akt total e enzima GAPDH de limpeza. PARP foi clivada em correspondência com um aumento do nível de apoptose. Imagens do tumor após o tratamento, e secções de tecidos coradas com H & E ilustra a regressão do tumor é mostrada na Figura 9 ure. Tamanho Figura 8. Tumoral e proteínas durante o tratamento com chumbo e precursoras nano drogas (adaptado a partir de 12 de Inoue et al.). Um tamanho do tumor. Dos vários tratamentos (dia 21 ao dia 42, num total de oito injecções). As barras indicam padrãodesvios da média. O chumbo conjugado com anti-Her2 AON e Herceptin foi superior ao sozinho ou Herceptin ou único medicamento contendo nano conjugados. B. Efeito dos diversos tratamentos sobre a expressão de HER2, fosforilada Akt, Akt total parB, parB clivada e GAPDH são mostrados por western blotting. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 9. Tratamento de HER2-positivos BT-474 de cancro da mama humano em ratinhos nus de regressão. Tumoral e necrose / apoptose em secções de tecido (adaptado a partir de 12 Ionue et al.). Superior: Encolhimento do tumor (setas vermelhas). Indicação do pellet estrogênio para suportar o crescimento do tumor (seta azul). Lower: Hematoxilina & Eosina (H & E) coloração de secções de tumor. Em proliferação tumoral é demonstrada pelo empacotamento denso de células tumorais. O tecido necrosado é visto onde as células tumorais foram eliminados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.