البوليمرات الحيوية نانو مقرها حمض Polymalic لاستهداف علامات ورم متعددة: فرصة للطب شخصية؟
Summary
ويقدم مثالا على المخدرات نانو على أساس حمض polymalic نحو التصميم الرشيد للطب الشخصية التي تنطبق على مرض السرطان. فهو يصف تركيب دواء نانو لعلاج سرطان الثدي HER2 إيجابية الإنسان في ماوس عارية.
Abstract
Tumors with similar grade and morphology often respond differently to the same treatment because of variations in molecular profiling. To account for this diversity, personalized medicine is developed for silencing malignancy associated genes. Nano drugs fit these needs by targeting tumor and delivering antisense oligonucleotides for silencing of genes. As drugs for the treatment are often administered repeatedly, absence of toxicity and negligible immune response are desirable. In the example presented here, a nano medicine is synthesized from the biodegradable, non-toxic and non-immunogenic platform polymalic acid by controlled chemical ligation of antisense oligonucleotides and tumor targeting molecules. The synthesis and treatment is exemplified for human Her2-positive breast cancer using an experimental mouse model. The case can be translated towards synthesis and treatment of other tumors.
Introduction
في عصر ما بعد الجينوم عندما تم كشف جينوم السرطان (المركز الوطني للتكنولوجيا الحيوية والسرطان والجينوم أطلس)، والعلاج من السرطان في المستقبل سوف تمثل التنوع الجيني للأورام في كثير من الأحيان ضمن نفس الورم 1-4. المعلوماتية الحيوية وسريعة وغير مكلفة تسلسل الحمض النووي يسمح اقتناء الجينات الخبيثة / الطفرات على المستوى الشخصي 2،4،5. مرة واحدة وقد تم التعرف على الجينات، وسوف يعامل المرضى الذين يعانون من الطب الشخصي لتعديل أو إسكات التعبير عنها الجينات الخبيثة 6. الحاجة لاستهداف الخلايا السرطانية وتسليم المخدرات إلى هذه الخلايا يدعو لأنظمة تسليم polyfunctional. من الواضح، أن المخدرات نانو تلبية هذا المطلب 7.
في موجة متصاعدة من الاكتشافات أثبتت النانوية مناسبة لتحقيق حمولات من أدوية العلاج الكيميائي، والبروتينات و / أو المادة الفعالة وراثيا إلى خلايا السرطان. ومع ذلك، لا تزال الآثار السلبية لتكون الإعلانيرتدي. قد يتسبب واحد منهم المتصلة غياب التحلل البيولوجي ترسب المواد في الأنسجة والأعضاء السليمة مع احتمال لاستفزاز الأمراض. لتقليل الترسيب، قدمنا غير سامة وغير المناعية حمض polymalic، والذي هو من أصل الميكروبية والقابلة للتحلل إلى H 2 O وCO 2 8. نستخدم البوليمر لتجميع نوع التساهمية في كل واحدة من نانو المخدرات. أنه يحتوي على مبحث المعالجة الكيميائية المرفقة كيميائيا مثل Temozolomide، دوكسوروبيسين، أو أليغنوكليوتيد] العقاقير والمجموعات الوظيفية التي تخدم التسرب، استهداف الأنسجة، والتسليم endosomolytic. والمشقوق الأدوية جوهريا من منصة نانو عندما وصلوا في استهداف الخلايا السرطانية، وبالتالي تجديد النشاط الصيدلانية الكاملة.
نحن تصف طريقة الإنتاج الميكروبية من منصة البوليمر نانو، وتنقية لها، والتركيب الكيميائي للدواء نانو الذي يحتوي تراستوزوماب (هيرسيبتين) للسرطاناستهداف وقليل النوكليوتيد العقاقير لتثبيط الإفراط HER2. في تطبيق المخدرات نانو لأعضاء غير بشرية الإنسان HER2 إيجابية سرطان الثدي في الفئران عارية، علينا أن نظهر فعالية عالية في علاج السرطان. مبادئ استهداف الورم وإسكات الجينات أدخلت هنا لpolymalic المخدرات حمض نانو يمكن تطبيقها في علاج حالات أخرى من السرطان.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويرد الطريق التجريبية لإعداد الأدوية نانو من البوليمر الطبيعية القابلة للتحلل والتي يمكن استخدامها في تركيب الأدوية شخصية. وصف يبدأ الإنتاج للرقابة وتنقية حمض polymalic، والتي هي عبارة عن منصة تنوعا لتخليق المخدرات نانو. باستخدام تقنيات استنساخه، يتم الحصول على البوليمر مع ارتفاع الوزن الجزيئي والنقاء الشديد مناسبة لالتوليفات الدوائية. يوصف التوليف لعقار نانو الذي يظهر لعلاج سرطان الثدي HER2 الإيجابي-بكفاءة. يمكن ترجمتها إلى وصف التوليفات من معظم الأدوية الأخرى نانو لعلاج السرطان. ينطوي استهداف الأجسام المضادة مثل هيرسيبتين التي تربط مستضد ورم محددة مثل البروتين HER2 أو أي علامة الورم الأخرى التي يتم المنضوية بكفاءة. المخدرات نانو يسلم مجموعة مختارة من أليغنوكليوتيد] العقاقير ومبحث المعالجة الكيميائية التي من شأنها أن تمنع بكفاءة نمو السرطان تحت عطرatment. في المثال، هيرسيبتين ملزمة لHER2 ومحددة الصلب العقاقير قليل النوكليوتيد مع نجم مرنا في عرقلة مستمرة من HER2-الإشارات وانخفاض حاد من سرطان الثدي HER2 الإيجابي-الترميز HER2. استنادا إلى المبدأ الكامن وراء استهداف الورم وتثبيط التعبير الجيني عن طريق أليغنوكليوتيد] العقاقير قمنا إلى تاريخ تصنيعه العديد من الأدوية الأخرى، ويحول دون نانو بنجاح ورم أرومي دبقي الإنسان قبل السريرية والثلاثي السلبية سرطان الثدي 11،14-18.
يبدأ العمل الاصطناعية مع إعداد عالي النقاء منصة نانو المخدرات، وهو حمض polymalic من طاف ثقافة Physarum polycephalum (أ الأنواع من "الوحل العفن" الأسرة). إعداد يؤكد أوزان جزيئية عالية من البوليمر، من حيث المبدأ السماح الحجز على العديد من الأجسام المضادة، الببتيدات، أليغنوكليوتيد] والجزيئات الأخرى تعمل في تسليم المخدرات النشطة وورم تثبيط نمو. Followiنانوغرام زراعة للرقابة وتنقية، وقد تم إنتاج نوعية استنساخه من البوليمر في عوائد يمكن التنبؤ بها. يتم تخزين البوليمر في ظل ظروف مريحة للأي وقت.
ويتم تجميع PMLA تقارن نانو بدءا من تفعيل الكيميائي للcarboxylates البوليمر قلادة في بضع خطوات الاصطناعية. بين الخطوات، والتوليف يمكن وضعها اختياريا على عقد السماح إعداد كميات التعسفي وسيطة، وبالتالي يمكن استخدامها في ما يصل التحجيم. ويتبع التقدم من تجميعي من TLC وثوانى-HPLC، ويتم التحكم كل من تكوين ونشاط المخدرات التي كتبها نانو المقايسات مجموعة محددة الكيميائي والكمي، ELISA، ومجموعة متنوعة من القياسات الفيزيائية. تجربتنا هو أن هذه التوليفات تم تقدما سلسا وبتكاثر مع عوائد ممتازة والنقاء. عن طريق اختيار النوعية من الأجسام المضادة والعقاقير [أليغنوكليوتيد أي متغير من نانو المخدرات يتم تصنيعه بشكل ايجابي حسب الحاجة في المؤسسة العامةrsonalized الطب.
طرائق العلاج الناجح لسرطان الثدي HER2 الإيجابي، الإنسان ممثلين صالحة لإعداد نماذج سرطان الفأر، وتطبيق الأدوية نانو، والتصوير، وتحليل نمو الورم. نتائج الاختبارات في المختبر جدوى مفيدة في اختيار خط الخلية والمخدرات مما يؤدي إلى استخدامها في التجربة الحيوانية. في الجسم الحي التصوير Xenogen يؤكد أن المخدرات نانو يتم تسليم الواقع داخل الورم. نتائج النشاف الغربية يكشف ما إذا كان مستوى بروتينات معينة وردت في الأزياء وتوقع أثناء علاج السرطان. قياس حجم الورم يبلغ عن نجاح العلاج، أي حوالي تثبيط، والركود أو التراجع. يعكس المثال وصف تجربتنا مع غيرها من polymalic القائم على حمض نانو المخدرات مما يدل على درجة عالية من القدرة على التنبؤ، واستنساخ غياب سمية ملحوظة. النتائج الأخيرة على سمية وفعالية متعددة رargeted تقارن حمض polymalic لعلاج سرطان الثدي الثلاثي السلبية هي في الدعم القوي لهذا المفهوم 18. ومن السمات الرئيسية هي أن المخدرات نانو لدينا هي قادرة على اختراق الحواجز الحيوي: حاجز البطانية التي كتبها التسرب إلى الورم الخلالي، وغشاء الخلية السرطانية عن طريق امتصاص جسيم داخلي، واضطراب الغشاء جسيم داخلي عن طريق عمل ethylester يسين أو trileucine المجموعات. التسرب وامتصاص جسيم داخلي يتم إنجاز موثوق بها أجسام مضادة محددة تعلق على المخدرات نانو. مكافحة فأر ترانسفيرين مستقبلات الأجسام المضادة تتوسط تدفق كفاءة داخل الورم بواسطة transcytosis، ربما لأن هى overexpressed مستقبلات على معظم الأوعية الدموية السرطانية. A الأجسام المضادة مختلفة تعلق على نفس وظائف نانو جزيء المكورات في توجيه تحديدا المخدرات نانو في الخلية السرطانية المتلقي. وجود الأجسام المضادة على حد سواء، واحد لtranscytosis والآخر لامتصاص جسيم داخلي، أمر ضروري لأداء الأمثل. التحليل الكمي للمينصح بشدة حمض ALIC والأجسام المضادة من أجل السيطرة على تكوين الأمثل للدواء نانو. أخيرا تجدر الإشارة إلى أن التساهمية نانو المخدرات الكل في واحد يسلم المخدرات في الاستمارة المرفقة كيميائيا في طريقها من خلال الأوعية الدموية المضيف في الخلايا السرطانية المتلقي. مرفق الكيميائية يجعل معظم الأدوية غير نشط (prodrugs) حتى يتم تشكيلها على أنها أدوية مجانا من الانقسام من منصة نانو المكورات في الموقع المستهدف. هذا أمر مهم لأن طريقة تنشيط يوفر درجة عالية من الأمان أثناء الولادة وفرصة ضئيلة لاستحضار آثار جانبية ضارة. براعة ونجاعة وسلامة هي سمات لا غنى عنها للطب شخصية جيدة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We greatly acknowledge financial support by NIH R01 CA123495, U01 CA151815, R01 CA136841, grants from the Department of Neurosurgery at Cedars-Cedars Medical Center and Arrogene Technology Inc.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercapto-1-ethylamine (Cysteamine (2MEA) | Sigma-Aldrich | 30078-25G | |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories, Burlingame, CA | ||
| 90-Day release 17β-estradiol pellet | Innovative Research of America | ||
| Alexa Fluor 680 C2 maleimide | Invitrogen | A20344 | |
| Amberlite IR 120H | Sigma-Aldrich | 6428 | |
| Antifoam Y-30 Emulsion | Sigam-Aldrich | A5758 | |
| Anti-laminin-411 chain mAbs | Santa Cruz | SC-59980 | |
| Anti-pAkt mAb | Cell Signalling | 9271S | |
| Anti-PARB mAb | BD Biosciences | 556494 | |
| Anti-von Willebrand Factor antibody | Abcam | AB6994 | |
| Bacto Yeast Extract | Bacto, Dickinson/Sparks, MD | 212720 | |
| Beta-actin | Cell Signalling | 3700 | |
| BT-474 | ATCC | HTB-20 | |
| Calcium Carbonate | Alfa Aesar | 36337 | |
| Cell Proliferation Assay kit | Promega, Madison, WI, USA | PR-G3580 | |
| Centriplus 100 | Millipore | 4414 | |
| Dicyclohexylcarbodimide | Fluka | 36650 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Eosin | Cardinal Health | S7439-4 | |
| Galardin (MMP-inhibitors) | Santa Cruz | SC-994 | |
| GAPDH | Cell Signalling | 2118 | |
| Hematoxilin | Cardinal Health | S7439-3 | |
| Hemin from porcine | Sigma-Aldrich | 51280 | |
| Herceptin | Genentech | 15534 | |
| Herceptin (Western blotting) | Cell Signalling | 2165S | |
| IgG2a-kappa murine malignoma | Sigma | M77695X5m | |
| Immun-Star AP Substrate Pack | Biorad | 170-5012 | |
| Immun-StarTM AP Substrate Pack | Biorad | 170-5012 | |
| LAL Reagent water | Lonza, MD | W50-1000 | |
| Laminin-411 mAbs | Abcam | ||
| Leucine ethyl ester (LOEt) | Sigma-Aldrich | 61850-10G-F | |
| Limulus Amebocyte Lysate (LAL) PYROGENT-5000 tests | Cambrex BioScience | N384 | |
| Lissamin-Morpholino AON | Gene Tools | Custom made | |
| L-malic acid | Sigma-Aldrich | M6413 | |
| Malate dehydrogenase | Sigma-Aldrich | M2634 | |
| Mal-PEG-Mal | Laysan | mal-PEG-mal-3400 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354248 | |
| Milk, nonfat powdered | Proteomics | M203-10G | |
| Morpholino oligonucleotides | GeneTools | custom made | |
| mPEG5000 | Lysan | mPEG-NH2-5000 | |
| N-hydroxysuccinimde (NHS) | ACROS Organics | 15727100 | |
| Ninhydrin | Merck | 1.06762.0100 | |
| Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich | Invitrogen | LC2001 | |
| Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich, 0.45 µm | Invitrogen | LC2001 | |
| Novex ® Tris-Glycine Transfer Buffer (25X) | Invitrogen | LC3675 | |
| Nude Mice [Tac:Cr:(MCr)-Foxnnm] | Taconic | ||
| PBS pH 7.2 10x | Gibco | 10010-49 | |
| PBS pH 7.2 1x | Gibco | 70013 | |
| PD-10 desalting columns | GE Healthcare | 17-0851 | |
| Physarum polycephalum M3CVII | ATCC | 204388 | |
| Pierce BCA protein assay | Thermo Scientific | 23225 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 1.18362E+11 | |
| Protein Detector ELISA Kit | KPL | 54-62-18 | |
| Sephadex G-25 superfine | GE Healthcare | 17-0031 | |
| Sephadex G-75 | GE Healthcare | 17-0050 | |
| Sephadex-LH20 | GE Healthcare | 17-0090 | |
| SKBR-3 | ATCC | HTB-30 | |
| SPDP | Proteochem | C1116 | |
| Streamline-DEAE | GE Healthcare | 17-0994 | |
| Styryl Red FM 1-43 | Life Technologies | T-3163 | |
| TBS 10x | Bio-Rad | 170-6435 | |
| TCEP | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| TLC, silica coated aluminia sheets | Merck, Darmstadt, DE | 60F254 | |
| Trileucine (LLL) | Bachem | H-3915 | |
| Triton X-114 | Sigma-Aldrich | X114 | |
| Tween®20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Vivaspin 20 | VWR | 14005-302 | |
| DAPI | Vector Laboratories, Burlingame, CA | ||
| Dexmedetomidine | Pfizer | ||
| Atipamezole | Pfizer | ||
| Carprofen | Pfizer | ||
| Betadine | Foster and Smith, Wisconsin | ||
References
- Koboldt, D. C., Fulton, R. S., McLellan, M. D. Comprehensive molecular portraits of human breast tumors. Cancer Genome Atlas Network. Nature. 490, 61-70 (2012).
- Kwong, L. N., Costello, J. C., et al. Oncogenic NRAS signaling differentially regulates survival and proliferation in melanoma. Nat. Med. 18, 1503-1510 (2012).
- Gerlinger, M., Rowan, A. J., Gerlinger, M., Rowan, A. J., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N. Engl. J. Med. 366, 883-892 (2012).
- Yap, T. A., Workman, P. Exploiting the cancer genome: strategies for the discovery and clinical development of targeted molecular therapies. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 52, 549-573 (2012).
- Chatterjee, S. Cancer Biomarkers: Knowing the Present and Predicting the Future. Future Oncol. 1, 37-50 (2005).
- Suh, K. S., Sarojini, S., Youssif, M., et al. Tissue Banking, Bioinformatics, and Electronic Medical Records: The Front-End Requirements for Personalized Medicine. J. Oncology. , (2013).
- Ljubimova, J. Y., Holler, E. Biocompatible nanopolymers: the next generation of breast cancer treatment. Future Medicine, Nanomedicine. 7, 1-4 (2012).
- Lee, B. -. S., Vert, M., Holler, E., Steinbüchel, A. . Water-soluble aiphatic polyesters: poly(malic acid)s. Biopolymers 3a. , 75-103 (2002).
- Lee, B. -. S., Fujita, M., et al. Polycefin, a new prototype of multifunctional nanoconjugate based on poly(beta-L-malic acid) for drug delivery. Bioconjugate Chem. 17, 317-326 (2006).
- Nag, A., Mitra, G., et al. A colorimetric assay for estimation of polyethylene glycol and polyethylene glycolated protein using ammonium ferrothiocyanate. Analytical Biochem. 237, 224-231 (1996).
- Ding, H., Inoue, S., et al. Inhibition of brain tumor growth by intravenous poly(beta-L-malic) acid nanobioconjugate with pH-dependent drug release. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 18143-18148 (2010).
- Inoue, S., Ding, H., et al. Nanobioconjugate inhibition of HER2/neu signaling and synthesis provides efficient mouse breast cancer treatment. Cancer Research. 71, 1454-1464 (2011).
- Maeda, H., Sawa, T., Konno, T. Mechanism of tumor-targeted delivery of macromolecular drugs, including the EPR effect in solid tumor and clinical overview of the prototype polymeric drug SMANS. J. Control. Release. 74, 47-61 (2001).
- Ljubimova, J. Y., Fujita, M., Ljubimov, Y. J., et al. Poly(malic acid) nanoconjugates containing various antibodies and oligonucleotides for multitargeting drug delivery. Nanomed. 3, 247-265 (2008).
- Inoue, S., Patil, R., Portilla-Arias, J., et al. Novel nanobioconjugate inhibiting EGFR expression in triple negative breast cancer. PLoS One. 7, 1-9 (2012).
- Patil, R., Portilla-Arias, J., Ding, H., et al. Cellular Delivery of Doxorubicin via pH-Controlled Hydrazone Linkage Using Multifunctional Nano Vehicle Based on Poly(β-L-malic Acid). Int. J. Mol. Sci. 13, 11681-11693 (2012).
- Patil, R., Portilla-Arias, J., Ding, H., et al. Temozolomide delivery to tumor cells by a multifunctional nano vehicle based on poly(β-L-malic acid). Pharm. Res. 27, 2317-2329 (2010).
- Ljubimova, J. Y., Portilla-Arias, J., Patil, R., et al. Toxicity and efficacy evaluation of multiple targeted polymalic acid conjugates for triple-negative breast cancer treatment. J. Drug Target. 21, 956-967 (2013).
