複数の腫瘍マーカーのターゲットとするためのポリリンゴ酸ベースのナノバイオポリマー：個別化医療の機会？

HER2受容体の発現を抑制するとHER2シグナリング12を遮断することによって、ヒトHER2陽性乳がんの抑制 戦略 ヒト乳癌の異なる形態の中で、HER2陽性腫瘍は、最悪の臨床転帰を有する。我々はヌードマウスモデルにおけるヒトHER2過剰発現乳癌の治療の成功を提示する。戦略は、受容体のHER2-mRNAの依存の合成（ 図1）を遮断するためのハーセプチンとHER2固有のAONを採用した、HER2シグナル伝達経路の即時サイレンの両方に積極的にナノ薬剤を必要とする。ハーセプチンおよび抗HER2 AONを含有する鉛ナノコンジュゲートは、ハーセプチン又はAONのいずれかを欠いているつのコントロールと共に図3に示されている。リード化合物は、throをトランスサイトーシスによってアクティブ溢出を達成するために抗MsTfRmAbを含んでいたぐふ腫瘍血管の内皮のTfRに結合する。腫瘍への取り込みがはるかに少ない抗体の非存在下で認められ、腫瘍依存性のEPR効果に起因していた13。アレクサフルーア680を含むナノ複合体の蛍光バージョンはイメージング研究のために合成した。 。HER2陽性乳癌細胞へのAON送達および腫瘍増殖阻害のメカニズムを図1左上隅：ナノコンジュゲートは、 図3から適応。左下隅：マウスの​​腫瘍血管の表面上のTfRを発現する。ナノ薬物が受容体に結合し、トランスサイトーシスによって腫瘍に入る。さらに、腫瘍へのアクセスがある程度の腫瘍依存強化取り込みと尿閉に参加無秩序内皮層を通って可能です（EPR）13。次に、nanodrugは、ヒト癌細胞上に発現HER2に結合し、初期エンドソーム中に内在化。 HER2シグナル伝達経路もブロックを結合する。エンドソームの成熟とその酸性化した後、ナノ薬剤のエンドソーム脱出メカニズムが有効になります。 Nanodrugが細胞質に入射したジスルフィドスペーサーの還元的切断によってナノプラットフォームから放出され、HER2合成を遮断HER2-mRNAに結合する。合成の遮断は、HER2シグナル伝達の遮断を拡張し、腫瘍増殖阻害を誘導する。 ポリリンゴ酸プラットフォームの微生物生産 ナノコンジュプラットフォーム、ポリリンゴ酸（PMLA）は、 モジホコリカビ microplasmodiaの培養によって産生され、プロトコールに記載され、 図2に示すように、培養液から精製した。生産および精製は、滑らかで再現性があった。それは、CONTすることが重要であったポリマーの自発的切断を回避するためにROL時間、pHおよび温度。入念な洗浄およびDEAE-カラムの溶出は、DNA、炭水化物、毒素や色物質を除去するために推奨されます。極端な純度を無水アセトンに溶解し、不溶性物質を除去した後に得た。生産PMLAの総量は、キャンペーンごとに5±1グラムだった。高度10 Lバイオリアクターを使用する際に再現性よく達成された80,000〜100,000 ワット MのPMPLA精製1.5±0.5グラムの量。秒-HPLC溶出プロフィールは、対称的であった。個数分布に応じて動的光散乱分析は、8±1nmの流体力学直径に対応する単一のピークとPDI多分散指数= 0.10±0.02、球状粒子と仮定するための測定器ソフトウェアによって計算さを示した。ゼータ電位だっ-22±2 MV（pH値7.5）。 / 50668/50668fig2highres.jpg "幅=" 500 "/> 図2。（Lee ら 9から適応） モジホコリカビの培養されたマイクロマラリア原虫からのポリリンゴ酸の産生および精製 。ポリリンゴ酸（PMLA）はバイオリアクター中モジホコリカビのマラリア原虫から製造し、陰イオン交換（DEAE）に結合することによって培養上清から回収される。溶離液は、カルシウム塩としてエタノール沈殿させる。カルシウム塩の溶液は、セファデックスG25上でMW-画している。 PMLA含む画分をアンバーライトIR-120H +の上の酸へのCa-塩から変換されます。無料PMLAは、最終的に乾燥、白色の粉末をを凍結乾燥されています。 リードナノ複合体の化学合成 P /ペグ5000（5％）/ LOEt（40％）/ AON（2.5％）/ハーセプチン（0.2％）/ A NTI-MsTfRmAb（0.2％） リードナノ薬物の2つの前駆体とナノ複合体の模式的な構造は、図のウレア3に示されている。前駆体がAON、HER2または抗体ハーセプチンのいずれかを欠いているように設計されている間、リードは、すべての成分が含まれています。 AONとのmAbのほかに、化合物は、血漿タンパク質、細網内皮系（RES）からのクリアランス、および酵素的切断による分解への結合を最小限にするために、ポリエチレングリコール5000のmPEG を含有した。アンチセンス配列5'-CAT-GGT-GCT-CAC-TGC-GGC-TCC-GGC-3 ' のHer2 mRNAに相補的であり、慎重にHER2を遮断することに向けて高い特異性を得るために、いくつかのHER2発現細胞株に対してインビトロで試験されている合成とオフターゲット効果を示さない。 8/50668fig3highres.jpg "幅=" 500 "/> 図3ナノは、ヒトHER2陽性乳癌を治療するためにコンジュゲート 。大手ナノ薬剤（上部構造）2薬（ハーセプチン、AON HER2）が含まれています。バージョン2と3は、薬を1つだけ含んでいる。ヒトHER2過剰発現腫瘍細胞への1及び2の取り込みは、ハーセプチンの結合によって管理されている。ハーセプチンが含まれていないナノ接合体3は、ヒト細胞によってエンドソームの取り込みのための抗HuTfRmAbを受けた。アレクサフルーア680との結合は、画像化目的のためのオプションでした。赤いバーは、ナノ複合体プラットフォームPMLA / LOEt（40％）を表している。 ％は、指示されたリガンド（nanodrug = 100％リンゴ酸残基の合計量）の結合で消費リンゴ酸残基の割合を示している。 図4ナノの化学合成コンジュゲートP / LOEt / AON HER2 / anti-MsTfR/Herceptin上から下へ：ペンダントカルボキシレート（化学活性化）のPMLA-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル（PMLA-NHS）の合成。 2 -メルカプト-1 -アミノエタン（2-MEA）とのアミド形成によりNHSの置換、メチル-PEG 5000 -アミン（のmPEG 5000-NH 2）、トリロイシン（LLL）又はロイシンエチルエステル（LOEt）。この「preconjugateは「切断可能なジスルフィド結合の形成によるチオエーテル形成とAONによるモノクローナル抗体-MAL-PEG-MALを添付します。残りの2-MEAはアミドエチル – ジチオプロピオン酸を形成するキャップされる。シングルmAbの添付ファイルのみが表示されます。複数の添付ファイルは、モノクローナル抗体の混合物を使用して管理されています。パーセンテージ％が種々のリガンド（無料PMLA 100％）と結合したカルボキシレートの分画を示す。 図のウレア4に概説されるようにナノ複合体を合成した。鉛の計算された分子量結合体は、719000でした。合成の全収率はリンゴ酸含有量に関して45±5％であった。 100kDaのPMLAプラットフォーム862マリル単位（= 100％）、平均で40％がLOEt、5％のmPEG 2％AON 2％、0.2％および0.2％ハーセプチン、抗MsTfRのmAbを行う。各抗体の金額はPMLAプラットフォームの分子あたり1.7分子の平均に対応した。 ％が設計され、基分析によって確認％、±5％以内で同一であった。例は、設計によるコンテンツとの比較を示すリンゴ酸、AONに、mAb及びmPEG 5000と表2の実験の内容を計算するために、表1に与えられた場合である。セクション3の下の基準に基づいて、高純度、高反応収率およびサイズ排除による効率的な分離（ 例えばモノクローナル抗体の無料およびmAb-ナノコンジュゲートは、SEC-HPLCで1分で区切られています）、および溶媒への選択的な溶解度に基づいて達成された。モノクローナル抗体の活性はナノ薬物合成の全体にわたって保持されることが示され、それは2種類の抗体が同じポリマープラットフォーム上で組み立てられたことを確認した。非定型ELISA実験の結果を図5のウレアに示されている。一般的には、リンゴ酸、AON、タンパク質、PEGの定量的グループ解析用およびELISAのためのアッセイが報告された合成の場合だけではなく様々な人員および計測が実施した場合に再現性のある結果が得られ、堅調に推移しましたが、また分析に使用するとき他の合成されたナノコンジュゲートの。 表1。リンゴ酸含量を基準にnanodrug組成の計算。 668table2.jpg "幅=" 600 "/> 表2に設計された組成物を用いた実験ナノ薬剤組成物の比較。 図5 ELISA化学合成後に、及び異なる抗体の複数の結合の実証のために抗体親和性の測定のためのナノ薬物は、抗体mAbそれぞれの抗原A及びBに対する（A）及び抗体mAb（B）を含有する。 ELISAプレートを抗原（A）で被覆されている。遊離のmAb（A）、遊離のmAb（B）、及びナノ薬物は、ELISAプレートに適用される。唯一のmAb（A）は、抗原（A）に結合している間に洗浄後、抗体は、モノクローナル抗体（A）またはmAb（B）のいずれかに特異的な二次ペルオキシダーゼ結合した抗体を用いて試験する。これは、遊離およびmAb（A）と結合したナノ薬物、および間接的mAbを同じナノ薬物分子の（B）ではなく遊離のmAb（B）共役していることがわかる、プレート上に保持される。濃度依存性は、化学的結合は、抗体の結合活性に影響を与えなかったことを示し、自由で結合mAb（A）のための同等の結合親和性を示しています。さらに、同じ物理エンティティ（ナノプラットフォーム）抗体mAb（B）の検出結果に対するmAb（A）とモノクローナル抗体（B）の共同ライゲーション。ここに示した実験結果は、抗ヒトTfRmAb（A）および抗マウスTfRmAb（B）を参照してください。同様の結果は、抗MsTfR mAbおよび抗HER2モノクローナル抗体（ハーセプチン）などの試験された他の抗体結合のために示されている。 物理化学的な調査は、P / MPEG（5％）/ LOEt（40％）/ AON（2％）/ハーセプチン（0.2％）/抗MsTfRmAb（0.2％）（鉛、2 – のための流体力学的直径22.1±2.3 nmで示された薬物版）、20.1±2.4 nmのPに対する/ MPEG（5％）/ LOEt（40％）/ AON（2％）/抗MsTfRmAb（0.2％）/抗HuTfRmAb（0.2％）（AON薬版） 、および15.1±P / MPEG（5％）/ LOEt（40％）/ハーセプチン（0.2％）（ハーセプチン薬版）1.2程度。 pH7におけるゼータ電位0.5は、次の順序-5.2±0.4 mVで、-5.7±0.6 mVであり、-4.1±0.4 mVでいた。これは、ナノ複合体の測定された流体力学的直径は、無料のコンポーネントの測定された直径の加法に従わなかったことに言及すべきである。 腫瘍細胞膜を通るナノ薬物の送達とは、0時間及び3時間後に rを細胞質に放出する エンドソーム取り込みによる細胞膜を介してナノ薬物の送達は、0時間及び3時間後のウレア図6に示されている。蛍光ラベルは、ナノ薬物プラットフォーム（緑アレクサフルーア680）に取り付けられており、AON（赤リサミン、）にしている。その重ね合わせは、D＆Lと一緒にパネルG＆Oの中の標識エンドソーム（青）の蛍光とのパネルに示されているピアソンの相関係数（R（r）は、プラットフォーム/エンドソームの共局在化、AON /エンドソーム、0時間および3時間のためのプラットフォーム/ AON。Tに関する画像から算出した彼は3時間の画像は、細胞質内のグルタチオン依存性ジスルフィド切断によるナノ薬剤の細胞質とAONの解離にエンドソームからの放出を示した。 図6。標的細胞（丁ら 11から適応）によるナノ複合体の取り込みのための共焦点顕微鏡 。細胞を二重ポリマープラットフォーム時およびリサミンAONに結合した（赤色）でのAlexaフルーア680（緑色）で標識されたナノ薬物と共に37℃で30分間インキュベートした。加えて、エンドソームをFM1-43（青）で染色した。局在化は、0時間（A）および3時間後（B）のインキュベーション後に示されている。パネルA、AB、＆B単独のナノ複合体の蛍光団によるのijショー染色し、A、CD＆B、KLでの共局在。さらに、エンドソームの染色はなし、FG＆B、パネルA、E＆B、M、ナノコンジュゲートおよびendosomesinパネルAの共局在に示されている。それぞれのパネルのためのパネルA、H＆B、Pショーの位相差。（C）ピアソンの相関関係は、プラットフォームにエンドソーム、AON-エンドソーム、0時間、3時間に計算プラットフォームAONの共局在のために、R（r）を係数。 をクリックしてくださいここで、この図の拡大版を表示します。 in vitroおよびin vivoでのヒト乳癌の阻害 コムで細胞株BT-474を過剰発現するHER2のインビトロ成長阻害における低発現細胞株MDA-MB-231を有するパリソンのウレアは、 図7に示されている。阻害の程度は、リードナノ複合体P /ペグ/ LOEt / AON HER2 /ハーセプチン/抗MsTfRmAbによって、それぞれ、50％および30％である。他の化合物による阻害は、MDA-MB-231細胞に対するよりBT-474のために小さいが高い。 BT-474細胞株は、異種の乳癌のマウスの治療のために選択した。 図7 BT-474乳癌細胞および（Inoue ら 12より）低い発現するMDA-MB-231細胞を過剰発現するHER2のインビトロ成長阻害。HER2は、BT-474乳癌細胞株を過剰発現するための増殖阻害の比較（左）およびHER2低発現する乳癌細胞株MDA-MB-231（右）。のTfR（S）抗MsTfRmを表すABとのTfR（胡/ MS）は、抗HuTfRmAb＆アンチMsTfRmAbを示している。ハーセプチンまたはAON のHER2のどちらかを欠いてリードナノ薬、P / MPEG / LOEt / AON のHER2 /ハーセプチン/のTfR（MS）、およびナノ薬は、PBS、ハーセプチンとAON HER2と比較されます。ハーセプチンの非存在下で、抗MsTfRmAbは、腫瘍細胞によりエンドソーム取り込みを提供するために結合させた。濃度は、抗体、AON、HER2、4μMのendoporter（AONの適用）に関して、4μMに関して40μg/ mlのでした。有意性は、*を付し、P <0.05：**、P <0.02 ***、P <0.003はPBSと比較した。 図8のインビボでの治療の結果は、ヒト乳癌を過剰発現するBT-474のHer2を有するマウスのために提示される。成長は、PBS（ 図のURE 8）でのみ処理した対照と比較してハーセプチンおよびHER2固有のAONを含む鉛nanodrugで> 95％阻害された。阻害ハーセプチン単独、P / MPEG / LOEt /ハーセプチンまたはP / MPEG / LOEt / AON /抗MsTfRmAb /抗HuTfRmAb 60％以下であった。腫瘍抽出物のウェスタンブロット分析は、HER2合成およびAktリン酸化の両方の阻害を示したが、全Aktの変化及びハウスキーピングGAPDH酵素なし。 PARPは、アポトーシスのレベルの上昇に対応して切断した。治療、および腫瘍の退縮を示すH＆Eで染色した組織切片後の腫瘍の写真を図のウレア9に示す。 （井上ら 12から適応）鉛および前駆体ナノ薬による治療中図8。腫瘍サイズおよびタンパク質。種々の処置（42日、完全に8回の注射を21日目）であった。腫瘍の大きさ。バーは標準を示す平均からの偏差。抗Her2 AONとハーセプチンとコンジュゲートリードはハーセプチン単独またはナノコンジュゲートを含む単一の薬物のいずれかよりも優れていた。B。 HER2、リン酸化Akt、全Akt、PARBの発現に及ぼす様々な治療の効果、切断されPARB及びGAPDHをウエスタンブロット法で示されている。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。 図9。ヌードマウス上のHER2陽性のBT-474ヒト乳癌。腫瘍退縮および組織切片における壊死/アポトーシス（Ionue ら 12から適応） の治療 。アッパー：腫瘍の縮小（赤矢印）。腫瘍の成長（青色の矢印）をサポートするエストロゲンペレットの表示。ロウrは腫瘍切片のヘマトキシリン​​·エオシン（H＆E）染色。増殖する腫瘍は、腫瘍細胞の密なパッキングにより示されている。壊死組織が ​​腫瘍細胞が消去されているところが見られる。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。