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Chemistry

Biopolymères à base d'acide malique Nano pour le ciblage des marqueurs tumoraux multiples: une opportunité pour la médecine personnalisée?

Published: June 13, 2014
doi:
10.3791/50668
, , , , , , , , , ,
1Nanomedicine Research Center, Department of Neurosurgery,Cedars-Sinai Medical Center

Summary

Un exemple d'un médicament à base de nano acide malique est présentée vers la conception rationnelle de médicament personnalisé qui est applicable à un cancer. Il décrit la synthèse d'un médicament pour traiter le cancer nano sein HER2-positif humain dans une souris nude.

Abstract

Tumors with similar grade and morphology often respond differently to the same treatment because of variations in molecular profiling. To account for this diversity, personalized medicine is developed for silencing malignancy associated genes. Nano drugs fit these needs by targeting tumor and delivering antisense oligonucleotides for silencing of genes. As drugs for the treatment are often administered repeatedly, absence of toxicity and negligible immune response are desirable. In the example presented here, a nano medicine is synthesized from the biodegradable, non-toxic and non-immunogenic platform polymalic acid by controlled chemical ligation of antisense oligonucleotides and tumor targeting molecules. The synthesis and treatment is exemplified for human Her2-positive breast cancer using an experimental mouse model. The case can be translated towards synthesis and treatment of other tumors.

Introduction

Dans l'ère post-génomique quand génomes de cancer ont été démêlé (Centre national pour la biotechnologie et la génomique du cancer Atlas), le traitement futur du cancer représentera la diversité génétique des tumeurs souvent dans la même tumeur 1-4. Bioinformatique et séquençage de l'ADN rapide, pas cher permet l'acquisition de gènes / mutations malignes à un niveau personnel 2,4,5. Une fois que les gènes ont été identifiés, les patients seront traités avec la médecine personnalisée de modifier ou de réduire au silence l'expression de gènes malignes 6. La nécessité de cibler les cellules cancéreuses et délivrer des médicaments dans ces cellules nécessite des systèmes de délivrance polyfonctionnels. De toute évidence, les médicaments de nano peuvent répondre à cette exigence 7.

Dans une vague déferlant de découvertes nanoparticules ont prouvé approprié pour apporter des charges utiles de médicaments chimiothérapeutiques, des protéines et / ou de matériel génétiquement actif pour les cellules cancéreuses. Cependant, les effets indésirables restent à l'annoncehabillé. L'un d'entre eux en rapport avec l'absence de biodégradabilité peut provoquer un dépôt de matière dans les tissus et organes en bonne santé avec le risque de provoquer des maladies. Pour minimiser le dépôt, on introduit l'acide malique non toxique et non immunogène, ce qui est d'origine microbienne et biodégradable à H 2 O et CO 2 8. Nous utilisons le polymère à synthétiser un type covalent tout-en-un de nano médicament. Il contient des agents chimiothérapeutiques attachés chimiquement tels que le témozolomide, la doxorubicine, ou des oligonucleotides antisens et des groupes fonctionnels qui servent extravasation, le ciblage tissulaire, la livraison endosomolytique. Les médicaments sont intrinsèquement clivés de la plate-forme de nano quand ils sont arrivés dans la cellule tumorale ciblée, régénérant ainsi l'activité pharmaceutique complet.

Nous décrivons le procédé de production microbienne de la plate-forme de nano polymère, sa purification, et de la synthèse chimique d'un médicament qui contient des nano trastuzumab (Herceptin) pour le cancerLe ciblage et un oligonucléotide anti-sens pour l'inhibition de la surproduction HER2. En appliquant le médicament nano cancer xénogénique humaine sein HER2-positif sur la souris nude, nous démontrons une grande efficacité du traitement du cancer. Les principes de ciblage de la tumeur et l'inactivation de gène introduit ici pour polymalique médicaments nano d'acide peuvent être utilisés dans le traitement d'autres cas de cancer.

Protocol

Toutes les expériences sont conformes aux réglementations officielles d'animaux y compris les procédures chirurgicales et non chirurgicales réalisées in vivo et sont en pleine conformité avec les protocoles IACUC. 1. Bioproduction de l'acide malique Cultiver une culture de semences de sphérules sur gélose et transférer plasmodies à 100 ml de milieu de culture en utilisant un 25 ° C Thermo déclaré incubateur et un milieu de culture de base 8,9. Produire une quantité de gravité emballé 500 micro plasmodia ml sous l'abri de la lumière afin d'éviter la sporulation. Préparez 80 g CaCO3 en suspension dans 8 L milieu de base dans 10 L récipient bioréacteur. Transférer les 500 ml emballés micro Plasmodium dans le récipient de réaction et monté pour permettre le bioprocédé 75 h à 25 ° C, 10 L / min de débit d'air filtré et 150 tours par minute sous agitation par un agitateur de segment. Fin lorsque le bouillon de culture a un pH de 4,8, indiquant la fin de la production de PMLA et mesurer la teneur PMLA par til hydroxamate / Fe (III) dosage. Refroidir le bouillon à 17 ° C et permettent aux cellules de se déposent par gravité. Laisser refroidir à 4 ° C et ajuster le pH à 7,5, utiliser NaOH 2. Pomper le liquide surnageant à travers une colonne remplie avec 1,5 l de DEAE-cellulose dans le fond de la direction vers le haut (de DEAE à grains grossiers, équilibrée avec 20 mM Tris-HCl pH 7,5 à 5 ° C). Laver avec 3 colonnes de tampon contenant 0,3 M de NaCl, après modification de la direction de haut en bas et éluer PMLA en présence de 0,7 M de NaCl. Régler à 0,1 M CaCl 2 et précipiter PMLA-Calcium avec 80% éthanol glacé. Fractionner sur Sephadex G25 dans PMLA-calcium de 80 à 300 kDa, 50-80 kDa, et de 10 – 50 kDa, en utilisant de l'eau en l'absence de tampon et de sel. Passer chaque fraction sur une 120H Amberlite IR + colonne, et geler immédiatement l'acide malique accréditives dans l'azote liquide pour la lyophilisation. Dissoudre dans de l'acétone sec. Après filtration, éliminer le solvantdans le flux d'air sec, lyophiliser et conserver à -20 ° C. 2. Synthèse de nano médicaments à base d'acide malique Activer les groupes carboxyles de PMLA (P) par mélange de 116 mg (1 mmol unités malyl) de PMLA-H dans 1 ml d'acétone anhydre et 1 mmole de N-hydroxysuccinimide et de 1 mmol de dicyclohexyl carbodiimide dans 2 ml de diméthylformamide (DMF). Agiter à 20 ° C pendant 3 heures. Ajouter 0,05 mmole de mPEG 5000-NH 2 (0,05% molaire d'unités malyl) dans 1 ml de DMF, suivi par 0,05 mmol de triéthylamine (TEA). Ajouter goutte à goutte en solution dans le DMF de 0,4 mmol d'ester de leucine d'éthyle (Loet) (40% molaire d'unités malyl), 0,1 mmol de 2-thiol-1-éthylamine (2-méthoxyéthyle) (10% en moles de motifs malyl) et 0,5 mmoles de TEA, tous dissous dans du DMF. Après chaque addition, laisser 1 heure et vérifier la fin de la réaction négative par la ninhydrine réponse (couche de chromatographie, CCM). Ne retirer les restes de NHS-ester par hydrolyse spontanée avec une solution saline tamponnée au phosphate (30 min, pH 6,8). Dessaler sur PD-10 Colonne, obtenir "preconjugate" comme une poudre blanche par lyophilisation. Entreposer au sec moins 20 ° C. Dissoudre 30 mg d'anticorps (anticorps monoclonal, IgG2a-κ) dans 4,5 ml de phosphate de sodium 100 mM, NaCl 150 mM, pH 5,5. Réduire les liaisons disulfure avec 5 mM de Tris (2-carboxy-éthyl) chlorhydrate de phosphine pendant 30 min à 20 ° C et on purifie sur colonne PD-10. Dissoudre Mal-PEG 3400-Mal dans 2 ml du même tampon et ajouter le mAb réduite à un volume final de 10 ml et on agite pendant une nuit à 4 ° C. Concentrer à 2,5 ml sur Vivaspin 20, exclusion 30 kD, et purifier sur Sephadex G75. Vérifiez produit sur sec-HPLC et évaluer la valeur photométrique à 280 nm de longueur d'onde. Fixez Mal-PEG-Mal-mAb à "preconjugate" thiols obtention P / PEG 5000 (5%) / Loet (40%) / mab (0,2%) / 2-MEA (10%). Pour ce faire, en mélangeant 5 ml de 200 nmol mAb-PEG 3400-Mal à 50 mg (P / MPEG 5000 / LOEt/2-MEA) dans le tampon pH supérieur à 5,5, ajuster la concentration de sulfhyDryl à 2 mM et incuber à 20 ° C pendant 3 heures (rendement 98%). Solubiliser 3'-H 2 N-AON dans du DMF / PBS (pH 7,2) et de réagir avec le N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio) propionate (SPDP) à (01:01 v / v) DMF / méthanol (test à la ninhydrine ) et purifier AON-PDP sur Sephadex LH20-en méthanol, puis dans l'eau et lyophiliser. Incuber 800 nmol AONs activés dans la mémoire tampon de pH 5,5 à la Mal-PEG 3400-Mal-mAb-preconjugate préparé ci-dessus pendant la nuit jusqu'à ce que la réaction d'échange de disulfure est terminée. Incorporer fluorescent Alexa Fluor 680-maléimide formant thioéther avec un polymère-2-MEA-SH. Bloquer sulfhydryls excès de 3-pyridyldithio-propionate (PDP) et purifier sur Sephadex G75. Conserver à 4 ° C ou congelé instantanément à -80 ° C jusqu'à utilisation ultérieure. 3. Tests et Propriétés Effectuer des tests de pureté et de stabilité dans le sérum et PBS à 4 ° C et 37 ° C par analyse HPLC-sec. Utilisez polystyrène sulfonate comme molecnormes de poids ment ses. Mesurer la distribution de la taille des nano et zeta-potentiels. Utilisez les systèmes commerciaux. Ajouter 320 ul d'échantillon de 160 ul de 10% (p / v) de chlorure d'hydroxylammonium et 160 ul de 10% (p / v) de NaOH. Après 10-15 minutes, mélanger avec 160 pi de 5% (p / v) Fe (III) Cl 3 à 12% (v / v) de HCl et de lire Un 540 de hydroxamate / Fe (III). Calculez PMLA supposant 1 mg / ml PMLA correspond à 2,5 A 540. Hydrolyser la molécule nano pendant une nuit dans du HCl 2 M à 110 ° C et le dosage de l'acide malique sur la chromatographie en phase inverse en faisant référence à des échantillons standards dopé avec de l'acide malique. Cliver le médicament nano avec dithiothréitol 100 mM et mesurer Morpholino-AON par quantitative HPLC en phase inversée par rapport aux normes Morpholino AON. Prendre nano médicament sans clivage et de mesurer l'anticorps en utilisant un kit de dosage de protéine. Quantifier mPEG en permettant sa réaction avec l'ammonium ferrothiocyanate, puis extraire avec du chloroforme et l'absorbance à 510 nm de longueur d'onde 10 </sup>. Effectuer ELISA avec 5 pi de drogue nano (1-10 pg de mAb) par puits tester l'activité des anticorps et emboîtement. Utiliser 0,5 pg / puits récepteur de la transferrine et de HER2, respectivement, comme des antigènes de la plaque revêtue et des anticorps secondaires couplés à la peroxydase. Calculer atteint% pour AON, MPEG et mAb à l'égard de l'acide malique (100%) et comparer avec le% prévu par la conception (voir les exemples les tableaux 1 et 2). 4. Tests in vitro Incuber le médicament avec des nano cellules cancéreuses en culture et les cellules survivantes mesure au cours du temps par leur activité pour réduire réactif jaune [3 – (4,5-diméthylthiazol-2-yl) -5 – (3-carboxymethoxyphenyl) -2 – (4-sulfophényl )-2H-tétrazolium, sel interne] (MTS) à un colorant bleu et lire l'absorbance relative avec un photomètre. Suivez les instructions du fabricant de kit. Préparer des extraits de cellules in vitro ou ex vivo pour le transfert de Western. Utilisez glacée extraction buffer qui contient SDS et inhibiteur de la protéase cocktail. Séparer les protéines par électrophorèse sur gel réducteur de SDS-polyacrylamide. Avez-western blot des protéines d'intérêt dans les extraits d'échantillons. Utiliser des anticorps secondaires conjugués à la phosphatase alcaline. Utiliser la microscopie confocale pour démontrer l'absorption cellulaire et la co-localisation de la plate-forme de nano de médicament polymère, AON endosomes et en utilisant un marquage par fluorescence. Attacher Alexa Fluor 680 de la plate-forme de conjugué de nano et Lissamine à AONs que des marqueurs de fluorescence. Utiliser un microscope 5X scanner spectrale et les cellules cancéreuses vivantes de visualiser la distribution des molécules marquées Membranes endosomes tache avec Styryl rouge colorant fluorescent et démontrent colocalisation endosome ou de libération. 5. Essais in vivo Préparer le modèle de souris de cancer du sein humain HER2-positif (Tac nu de la souris: Cr: (MCR)-Foxnnm). Insérez un 0,72 mg 17β-estradiol libérer culot (90 jours de presse) subcutaneously dans le cou de chaque souris. Puis injecter des cellules tumorales BT-474 1 x 10 7 sous-cutanée dans le flanc droit et laisser la tumeur se développer. Commencer le traitement lorsque les tumeurs sont de 120 mm 3 de la taille de l'injection dans la veine caudale de 150 ul de conjugué nano contenant 2,5 mg / kg AON et / ou 4,5 mg / kg de chaque anticorps. Pour le traitement injecter deux fois par semaine, total six fois. Mesurer la taille de la tumeur avec étriers deux fois la faiblesse et calculer les volumes en utilisant la formule (longueur x profondeur x largeur) x (π / 6). Euthanasier les animaux deux semaines après la dernière injection et après une sédation avec une solution de kétamine et de dexmédétomidine suivie par dislocation cervicale. Isoler les tumeurs et les sections de tache avec H & E pour l'évaluation morphologique. Pour l'évaluation de la distribution du médicament à l'échelle animale, en utilisant un système d'imagerie par fluorescence. Injecter le médicament Alexa Fluor 680 nano marqué et l'image à 24 et 48 h. Euthanasier l'animal et de détecter le fluorescence dans les tumeurs et des organes isolés et perfusés.

Representative Results

Inhibition du cancer du sein HER2-positif humain en faisant taire l'expression du récepteur HER2 et blocage HER2-signalisation 12 Stratégie Parmi les différentes formes de cancer du sein humain, les tumeurs HER2-positif ont le plus mauvais résultat clinique. Nous présentons la réussite du traitement du cancer du sein HER2-surexprimant humain dans le modèle de souris nude. La stratégie implique le médicament nano actif tant dans le silençage immédiate de la voie de signalisation de HER2 Herceptin et employant AON HER2-spécifique pour le blocage de la synthèse de l'ARNm de HER2-dépendante du récepteur (figure 1). Le conjugué de nano plomb, qui contient Herceptin et anti-HER2 AON est représenté sur la figure 3, ainsi que deux commandes qui sont dépourvues de l'une ou Herceptin AON. Le composé principal contenait anti-MsTfRmAb pour atteindre extravasation actif par transcytose through liaison endothéliales TfR de vaisseaux tumoraux. Beaucoup moins de l'absorption dans la tumeur a été noté en l'absence de l'anticorps et a été attribuée à l'effet EPR tumeur dépendante 13. Versions fluorescentes des conjugués de nanoparticules contenant Alexa Fluor 680 ont été synthétisés pour des études d'imagerie. . Figure 1 Mécanisme de livraison AON dans des cellules de cancer du sein HER2-positif et l'inhibition de la croissance tumorale coin supérieur gauche:. Nano conjugué adapté de la figure 3. Coin inférieur gauche: les vaisseaux tumoraux de souris exprimant TfR à la surface. Le médicament de nano se lie au récepteur et pénètre dans la tumeur par transcytose. De plus, un certain degré d'accès à la tumeur est possible à travers les couches endothéliales désordonnés qui participent à l'absorption et la tumeur dépendante retenti renforcéesur (EPR) 13. Ensuite, le nanodrug se lie à HER2 exprimé sur les cellules cancéreuses humaines et internalise dans les endosomes précoces. Reliure blocs aussi HER2 voie de signalisation. Après maturation des endosomes et leur acidification, le mécanisme d'échappement endosome du médicament nano est activé. Nanodrug entrer dans le cytoplasme est libéré à partir de la plate-forme de nano par clivage réducteur du disulfure entretoise et se lie à l'ARNm de HER2-blocage HER2-synthèse. Le blocage de la synthèse de blocage s'étend HER2-signalisation et induit une inhibition de la croissance tumorale. La production microbienne de la plate-forme de l'acide malique La plate-forme de nano conjugué, l'acide malique (PMLA), a été produit par culture microplasmodia de Physarum polycephalum et purifié à partir du bouillon tel que décrit dans le protocole et représenté sur la figure 2. La production et la purification étaient lisses et reproductible. Il était important de cont rol temps, le pH et la température afin d'éviter le clivage spontané du polymère. Lavage soigneux et élution de la colonne DEAE-est recommandé pour éliminer l'ADN, des glucides, des toxines et des tissus colorés. Extrême pureté a été obtenue après dissolution dans l'acétone anhydre et enlèvement de matière insoluble. Montant total des produits PMLA était de 5 ± 1 g par campagne. Des quantités de 1,5 ± 0,5 g hautement purifiés PMPLA de M w 80.000-100.000 ont été reproductible atteint lors de l'utilisation de la 10 L bioréacteur. Profils d'élution Sec-HPLC étaient symétriques. L'analyse dynamique de dispersion de lumière selon la distribution en nombre a indiqué un pic unique correspondant à un diamètre hydrodynamique de 8 ± 1 nm et un indice de polydispersité PDI = 0,10 ± 0,02, calculé par le logiciel de l'instrument pour des particules sphériques pris en charge. Potentiel zêta est de -22 ± 2 mV (pH 7,5). / 50668/50668fig2highres.jpg "width =" 500 "/> Figure 2. Production et purification de l'acide malique à partir de cultures de micro plasmodies de Physarum polycephalum (adapté de Lee et al. 9). L'acide malique (PMLA) est produit à partir de plasmodies Physarum polycephalum dans un bioréacteur et recueilli à partir du surnageant de culture par liaison sur l'échangeur d'anions (DEAE). L'éluant est précipité à l'éthanol en tant que sel de calcium. Des solutions de sel de calcium sont Mw-fractionnés sur Sephadex-G25. Les fractions contenant PMLA sont convertis de la Ca-sel dans l'acide sur Amberlite IR-120H +. La libre PMLA est finalement lyophilisé pour donner une poudre blanche sèche. La synthèse chimique du conjugué de plomb nano P / mPEG 5000 (5%) / Loet (40%) / AON (2,5%) / Herceptin (0,2%) / a nti-MsTfRmAb (0,2%) Les structures schématiques de la drogue de nano plomb et de deux conjugués précurseur de nanoparticules sont montrés dans la Fig ure 3. Le plomb contient tous les constituants, alors que les précurseurs ont été conçues pour manquer soit AON HER2 ou l'anticorps Herceptin. Outre AON et Acm, les composés contiennent le polyéthylène glycol, le mPEG 5000, afin de minimiser la liaison aux protéines plasmatiques, la clairance par le système réticulo-endothélial (RES), et à la dégradation par coupure enzymatique. La séquence antisens 5'-CAT-GGT-GCT-CAC-TGC-GGC-TCC-GGC-3 'est complémentaire de Her2 ARNm et a été soigneusement testé in vitro sur plusieurs lignées de cellules HER2 exprimant pour obtenir une haute spécificité envers blocage HER2 synthèse et ne pas montrer les effets hors-cible. 8/50668fig3highres.jpg "width =" 500 "/> Figure 3. Nano conjugue pour traiter le cancer du sein HER2-positif humain. Principal médicament nano (structure supérieure) contient deux médicaments (Herceptin, AON HER2). Les versions 2 et 3 contiennent un seul des médicaments. L'absorption de 1 et 2 dans les cellules tumorales surexprimant HER2 humain est géré par la liaison de l'Herceptin. Nano conjugué 3, qui ne contient pas Herceptin, reçue anti-HuTfRmAb endosome pour l'absorption par les cellules humaines. La conjugaison avec Alexa Fluor 680 est facultative pour les besoins d'imagerie. La barre rouge représente la plate-forme nano conjugué PMLA / Loet (40%). % Indique la fraction de résidus d'acide malique consommés dans la liaison du ligand indiquée (quantité totale de résidus d'acide malique dans le nanodrug = 100%). Figure 4. Synthèse chimique des nanoconjugués P / Loet / AON HER2 / anti-MsTfR/Herceptin De haut en bas:. Synthèse de PMLA-N-hydroxy succinimidylester (PMLA-NHS) de carboxylates pendants (activation chimique). Le remplacement de NHS par formation d'amide avec le 2-mercapto-1-aminoethan (2-méthoxyéthyle), le méthyl-PEG-amine 5000 (5000 mPEG-NH 2), trileucine (LLL) ou l'ester éthylique de leucine (Loet). Cette "preconjugate" attache mAb-Mal-PEG-Mal par thioéther formation et AON par la formation de ponts disulfures clivables. Les restes de 2-MEA est plafonné formant amidoéthyle-dithio-propionique. Seulement attachement d'un seul anticorps monoclonal est affiché. Plusieurs pièces jointes sont gérés en utilisant des mélanges de Acm. Pourcentage% dénote fractions de carboxylates liés à divers ligands (100% gratuitement PMLA). Les conjugués de nano ont été synthétisés comme indiqué dans la Fig ure 4. Le poids moléculaire calculé de la têteconjugué était 719000. Le rendement global de la synthèse est de 45 ± 5% par rapport à la teneur en acide malique. En moyenne, sur les 862 unités malyl (= 100%) de la plate-forme 100 kDa PMLA, 40% réalisée Loet, 5% de mPEG, AON 2% 2%, 0,2% et 0,2% Herceptin anti-MsTfR mAb. Le montant pour chaque anticorps correspond à une moyenne de 1,7 molécules par molécule de plate-forme PMLA. La conception et le%% vérifié par analyse de groupe, était la même à l'intérieur de ± 5%. Un exemple est le cas donné dans le tableau 1 pour le calcul de la teneur expérimentale de l'acide malique, l'AON, mAb et mPEG 5000 et dans le tableau 2 montre la comparaison avec le contenu de par leur conception. La grande pureté selon les critères de l'article 3 a été réalisée sur la base des rendements de réaction élevées et une séparation efficace par exclusion de taille (par exemple sans mAb et Acm nanoconjugate sont séparés par 1 min sur sec-HPLC) et la solubilité sélective dans des solvants. L'activité des anticorps monoclonaux était montrée à conserver tout au long de la synthèse de médicaments nano, et il a été confirmé que les deux types d'anticorps ont été assemblés sur la même plate-forme de polymère. Le résultat de l'essai ELISA atypique est représenté sur la fig ure 5. En général, les dosages pour l'analyse de groupe quantitative pour l'acide malique, l'AON, de protéines, de PEG et d'ELISA étaient robustes, ce qui donne des résultats reproductibles, lorsqu'elle est effectuée par des personnes différentes et l'instrumentation, non seulement dans le cas de la synthèse rapporté, mais également lorsqu'il est utilisé pour l'analyse d'autres nanoconjugates synthétisés. Tableau 1. Calcul de la composition de nanodrug en référence à la teneur en acide malique. 668table2.jpg "width =" 600 "/> Tableau 2. Comparaison de la composition de médicament de nano expérimental conçu avec la composition. Figure 5. ELISA pour la mesure de l'affinité des anticorps après la synthèse chimique, ainsi que pour la démonstration de la liaison de plusieurs anticorps différents. Nano Le médicament contient l'anticorps mAb (A) et l'anticorps AcM (B) contre les antigènes A et B, respectivement. Des plaques ELISA sont revêtues d'antigène (A). MAb libre (A), sans mAb (B), et nano médicaments sont appliqués sur des plaques ELISA. Après lavage, les anticorps sont testés avec des anticorps couplés à la peroxydase secondaire spécifiques pour chaque mAb (A) ou mAb (B), tandis que l'Acm (A) est lié à l'antigène (A). On voit que le médicament libre et nano mAb conjugué à (A), et indirectement conjugué mAb (B) de la même molécule de médicament de nano, mais pas mAb libre (B), Sont retenues sur la plaque. La dépendance de la concentration des affinités de liaison comparables pour libre et conjugué anticorps monoclonal (A), ce qui indique que la conjugaison chimique n'a pas affecté l'activité de liaison d'anticorps. De plus, la co-ligation de l'anticorps monoclonal (B) avec l'AcM (A) sur la même entité physique (plate-forme de nano) entraîne l'anticorps mAb (B) la détection. Les résultats expérimentaux présentés ici se réfèrent à TfRmAb anti-humain (A) et anti-souris TfRmAb (B). Des résultats similaires ont été montrés pour les autres couples d'anticorps testés, tels que les anti-MsTfR mAb et anti-HER2 anticorps monoclonal (Herceptin). L'enquête physico-chimique a indiqué diamètre hydrodynamique 22,1 ± 2,3 nm pour P / MPEG (5%) / Loet (40%) / AON (2%) / Herceptin (0,2%) / anti-MsTfRmAb (0,2%) (plomb, les deux- Version de drogue), 20,1 ± 2,4 nm pour P / MPEG (5%) / Loet (40%) / AON (2%) / anti-MsTfRmAb (0,2%) / anti-HuTfRmAb (0,2%) (la version AON de drogues) , et de 15,1 ± 1,2 nm pour P / MPEG (5%) / Loet (40%) / Herceptin (0,2%) (la version Herceptin de drogue). Zeta-potentiels à pH 70,5 étaient dans cet ordre -5,2 ± 0,4 mV, -5,7 ± 0,6 mV, et -4,1 ± 0,4 mV. Il convient de mentionner que le diamètre hydrodynamique mesuré de conjugués nano n'a pas suivi l'additivité des diamètres mesurés pour les composants libres. Livraison de nano médicament à travers la membrane cellulaire de la tumeur et la libération dans le cytoplasme après 0 h et 3h r La livraison de nano médicament à travers la membrane cellulaire par endosome absorption est montré dans la Fig ure 6 après 0 h et 3 h. des marqueurs de fluorescence sont fixés à la plate-forme de nano de médicament (Alexa Fluor 680, vert) et à AON (lissamine, rouge). Leur superposition est représenté sur les panneaux D et L, et en même temps que la fluorescence des endosomes marqués (bleues) dans les panneaux de S et O. Corrélation des coefficients de Pearson (R (r) ont été calculés à partir des images concernant la co-localisation de la plate-forme / endosomes, AON / endosomes, plate-forme / AON pour 0 h et 3 h. Til image 3 hr indiqué libération des endosomes dans le cytoplasme et de dissociation de l'AON médicament nano-dépendante par le glutathion disulfure de clivage dans le cytoplasme. Figure 6. Microscopie confocale pour nano conjugué absorption par les cellules cibles (adapté de Ding et al. 11). Les cellules ont été incubées pendant 30 min à 37 ° C avec du nano médicament qui avait été doublement marquée avec Alexa Fluor 680 (vert) à la plate-forme de polymère et de la lissamine (rouge) fixée à AON. En outre, les endosomes ont été colorées avec FM1-43 (bleu). Localisation est affiché après 0 h (A) et 3 h (B) incubation. Panneaux A, AB, B et, ij spectacle coloration par les seuls fluorophores nano conjugués, etleur co-localisation en A, cd & B, kl. En outre, la coloration des endosomes est représenté dans les panneaux A, E & B, m et la colocalisation des nano conjugué et panneaux de endosomesin A, fg & B, non. Panneaux A, H & B, contraste p spectacle de phase pour panneaux respectifs. (C) la corrélation de Pearson coefficients R (r) pour la colocalisation de la plate-forme endosomes, AON-endosomes, la plate-forme AON calculée pour 0 h et 3 h. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. L'inhibition de cancer du sein humain in vitro et in vivo L'inhibition de la croissance in vitro de HER2 lignée cellulaire surexprimant BT-474 en comparaison avec le bas lignée cellulaire exprimant des cellules MDA-MB-231 est représentée sur la fig ure 7. Degré d'inhibition est de 50% et 30%, respectivement, par le plomb nano conjugué P / MPEG / Loet / AON HER2 / Herceptin / anti-MsTfRmAb. Inhibition par les autres composés, mais est moins élevé pour les BT-474 que pour les cellules MDA-MB-231 cellules. Lignée de cellules BT-474 a été choisie pour le traitement de xénogénique souris de cancer du sein. Figure 7. In vitro d'inhibition de HER2 surexprimant BT-474 cellules de cancer du sein et d'exprimer bas MDA-MB-231 cellules (adapté de Inoue et al. 12). Comparaison de l'inhibition de la croissance pour surexprimant HER2 BT-474 lignée de cellules de cancer du sein (croissance à gauche) et de HER2 bas lignée de cellules de cancer du sein exprimant MDA-MB-231 (à droite). TfR (s) désigne anti-MsTfRmAb et TfR (Hu / Mme) dénote anti-HuTfRmAb et anti-MsTfRmAb. Le médicament nano plomb, P / MPEG / Loet / AON HER2 / Herceptin / TfR (Mme), et les médicaments nano dépourvues de soit Herceptin ou AON HER2 sont comparés avec PBS, Herceptin et AON HER2. En l'absence d'Herceptin, anti-MsTfRmAb a été conjugué à fournir endosome l'absorption par les cellules tumorales. Les concentrations étaient 40 pg / ml en ce qui concerne les anticorps, les 4 uM à l'égard de AON HER2, 4 uM endoporter (application de AON). Signification indiquée par *, P <0,05 ** P <0,02 *** P <0,003 par rapport au PBS. Les résultats du traitement in vivo sur la figure 8 sont présentées pour des souris portant BT-474 surexprimant Her2 cancer du sein humain. La croissance a été inhibée> 95% en l'nanodrug contenant du plomb et de l'Herceptin AON HER2-spécifique par rapport aux témoins traités seulement avec de la PBS (fig ure 8). Inhibitionétait de 60% ou moins avec Herceptin seul, P / MPEG / Loet / Herceptin ou P / MPEG / Loet / AON / anti-MsTfRmAb / anti-HuTfRmAb. Analyse par transfert Western d'extraits de tumeurs a montré une inhibition de la synthèse à la fois HER2 et la phosphorylation de Akt, mais aucun changement du total Akt et le ménage enzyme GAPDH. PARP a été coupé en correspondance avec une augmentation du niveau de l'apoptose. Photos de la tumeur après le traitement, et des coupes de tissus colorées avec H & E illustrant la régression tumorale sont présentés dans la Fig ure 9. Figure 8. Taille et des protéines de tumeur pendant le traitement avec plomb et précurseurs de drogues nano (adapté de Inoue et al. 12). Une taille. Des tumeurs, pour les différents traitements (jours 21 à 42 jours, totalement 8 injections). Les barres indiquent la normeécarts à la moyenne. Le plomb conjugué anti-Her2 AON et Herceptin était supérieure soit Herceptin seul ou simples conjugués nano de médicaments contenant. B. Effet des différents traitements sur l'expression de HER2, protéine Akt phosphorylée, totale Akt, PARB, PARB clivé et GAPDH sont présentés par western blot. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 9. Traitement de BT-474 du cancer du sein HER2-positif humain sur des souris nude. Régression de la tumeur et de la nécrose / apoptose dans des coupes de tissus (adapté de Ionue et al. 12). Tige: retrait de la tumeur (flèches rouges). Indication de la pastille d'oestrogène pour soutenir la croissance de la tumeur (flèche bleue). Lower: hématoxyline et éosine (H & E) la coloration de coupes de tumeurs. Tumeur en prolifération est représenté par la forte densité de remplissage des cellules tumorales. Le tissu nécrosé est considérée où les cellules tumorales ont été éliminés. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

La voie expérimentale pour la préparation de médicaments à partir de nanoparticules d'un polymère naturel biodégradable est présenté qui peut être utilisé dans la synthèse de la médecine personnalisée. La description commence par la production contrôlée et la purification de l'acide malique, qui est une plate-forme flexible pour la synthèse de médicaments nano. En utilisant des techniques reproductibles, le polymère est obtenu avec un poids moléculaire élevé et une pureté extrême convenable pour la synthèse pharmaceutique. La synthèse est décrite pour un médicament nano qui est montré pour traiter efficacement le cancer du sein HER2-positif. La description peut être traduit dans des synthèses de la plupart des autres médicaments nano pour le traitement du cancer. Le ciblage comprend des anticorps tels que Herceptin qui se lient à un antigène spécifique de tumeur comme la protéine HER2 ou de tout autre marqueur de tumeur qui est internalisé efficacement. Le médicament de nano délivre une sélection d'oligonucléotides antisens et des agents chimiothérapeutiques qui inhibent efficacement la croissance du cancer sous Treatment. Dans l'exemple, la liaison à HER2 Herceptin et recuit spécifique d'oligonucléotide antisens avec HER2-codante de l'ARNm traduit par le blocage durable de HER2-signalisation et la réduction sévère du cancer du sein HER2-positif. Basé sur le principe sous-jacent de ciblage de la tumeur et l'inhibition de l'expression des gènes par des oligonucléotides antisens nous avons à jour synthétisé plusieurs autres médicaments nano et succès inhibé glioblastome humain préclinique et le cancer du sein triple négatif 11,14-18.

Le travail de synthèse commence par la préparation hautement purifiée de la plate-forme de nano médicament, qui est l'acide malique à partir du surnageant de culture de Physarum polycephalum (une espèce de la famille "boue de moule»). La préparation met l'accent sur des poids moléculaires élevés du polymère, en principe, permettre la fixation de plusieurs anticorps, de peptides, d'oligonucléotides et d'autres molécules qui fonctionnent en administration de médicament actif et l'inhibition de la croissance tumorale. Following la mise en culture et la purification contrôlée, qualité reproductible de polymère avec des rendements prévisibles a été produite. Le polymère est stocké dans des conditions avantageuses pour tout le temps.

La synthèse des conjugués de nanoparticules PMLA commençant par l'activation chimique des carboxylates pendants polymère est réalisée en quelques étapes de synthèse. Entre les deux étapes, la synthèse peut être éventuellement mis en attente permettant la préparation des quantités arbitraires de produits intermédiaires, et donc peut être utilisé en haut mise à l'échelle. Le progrès de la synthèse est suivie par CCM et HPLC-sec, et à la fois la composition et l'activité de la molécule nano est commandé par des dosages spécifiques à un groupe chimique quantitative, ELISA, et une série de mesures physiques. Notre expérience est que ces synthèses ont été progressé en douceur et de façon reproductible avec d'excellents rendements et pureté. En choisissant la spécificité des anticorps et des oligonucléotides antisens toute variante de nano médicament est favorable synthétisé comme nécessaire dans personalized médecine.

Les modalités de la réussite du traitement du cancer du sein HER2-positif humain sont des représentants valides pour la préparation de modèles de cancer de la souris, l'application de médicaments nano, l'imagerie et l'analyse de la croissance tumorale. Les résultats des tests in vitro de viabilité sont utiles dans la sélection de la lignée cellulaire et le médicament conduisant à être utilisé dans l'expérimentation animale. Xenogen imagerie in vivo confirme que le médicament est en effet de nano délivrée dans la tumeur. Résultats de western blot révèle que le niveau de certaines protéines a répondu de la manière prévue au cours du traitement du cancer. Mesure de la taille de la tumeur informe de la réussite du traitement, soit environ inhibition, récession ou de la régression. L'exemple décrit reflète notre expérience avec d'autres médicaments à base d'acide nano-polymalique indiquant un degré élevé de prévisibilité, reproductibilité et l'absence de toxicité notable. Les résultats récents sur la toxicité et l'efficacité des multiples targeted conjugués d'acide malique pour le traitement triple négatif cancer du sein sont en forte appui de cette notion 18. Une caractéristique essentielle est que notre médicament nano est capable de pénétrer dans les bio-barrières: la barrière endothéliale par extravasation dans la interstitiel de la tumeur, la membrane de la cellule tumorale par endosome absorption, et rupture de la membrane de l'endosome par action des groupes d'ester éthylique de leucine ou la trileucine. Extravasation et endosome absorption sont fiable accompli par les anticorps spécifiques liées à la drogue nano. Anticorps anti-récepteur de la transferrine anti-souris médie afflux efficace dans la tumeur par transcytose, probablement parce que le récepteur est surexprimé dans la plupart vasculaire tumoral. Un autre anticorps fixé sur les mêmes fonctions nano molécule conjuguée à diriger précisément le médicament nano dans la cellule tumorale de destinataire. La présence de deux anticorps, l'un pour la transcytose et l'autre pour l'absorption endosome, est essentiel pour un fonctionnement optimal. L'analyse quantitative des macide Alic et anticorps est fortement recommandé afin de contrôler la composition optimale du médicament nano. Enfin, il convient de noter que le nano covalente médicament tout-en-un livre médicament sous forme chimiquement liée, en route à travers le système vasculaire de l'hôte dans la cellule tumorale de destinataire. fixation chimique rend inactive la plupart des médicaments (prodrogues) jusqu'à ce qu'ils soient reconstitués en médicaments gratuits par clivage de la plate-forme nano conjugué au site ciblé. Ceci est important car la modalité de réactivation fournit un degré élevé de sécurité lors de l'accouchement et une chance minime d'évoquer des effets secondaires néfastes. Polyvalence, l'efficacité et la sécurité sont des attributs indispensables de la bonne médecine personnalisée.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We greatly acknowledge financial support by NIH R01 CA123495, U01 CA151815, R01 CA136841, grants from the Department of Neurosurgery at Cedars-Cedars Medical Center and Arrogene Technology Inc.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
2-Mercapto-1-ethylamine (Cysteamine (2MEA) Sigma-Aldrich 30078-25G
4’,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) Vector Laboratories, Burlingame, CA
90-Day release 17β-estradiol pellet  Innovative Research of America
Alexa Fluor 680 C2 maleimide Invitrogen A20344
Amberlite IR 120H Sigma-Aldrich 6428
Antifoam Y-30 Emulsion Sigam-Aldrich A5758
Anti-laminin-411 chain mAbs Santa Cruz SC-59980
Anti-pAkt mAb Cell Signalling 9271S
Anti-PARB mAb BD Biosciences 556494
Anti-von Willebrand Factor antibody  Abcam AB6994
Bacto Yeast Extract Bacto, Dickinson/Sparks, MD 212720
Beta-actin Cell Signalling 3700
BT-474  ATCC HTB-20
Calcium Carbonate Alfa Aesar 36337
Cell Proliferation Assay kit Promega, Madison, WI, USA PR-G3580
Centriplus 100  Millipore 4414
Dicyclohexylcarbodimide Fluka 36650
DMEM Sigma-Aldrich D5796
Eosin Cardinal Health S7439-4
Galardin (MMP-inhibitors)  Santa Cruz SC-994
GAPDH Cell Signalling  2118
Hematoxilin Cardinal Health S7439-3
Hemin from porcine Sigma-Aldrich 51280
Herceptin Genentech 15534
Herceptin (Western blotting) Cell Signalling 2165S
IgG2a-kappa murine malignoma Sigma M77695X5m
Immun-Star AP Substrate Pack Biorad 170-5012
Immun-StarTM AP Substrate Pack  Biorad 170-5012
LAL Reagent water  Lonza, MD W50-1000
Laminin-411 mAbs Abcam
Leucine ethyl ester (LOEt) Sigma-Aldrich 61850-10G-F
Limulus Amebocyte Lysate (LAL) PYROGENT-5000 tests Cambrex BioScience N384
Lissamin-Morpholino AON Gene Tools Custom made
L-malic acid  Sigma-Aldrich M6413
Malate dehydrogenase  Sigma-Aldrich M2634
Mal-PEG-Mal Laysan mal-PEG-mal-3400
Matrigel BD Biosciences 354248
Milk, nonfat powdered  Proteomics M203-10G
Morpholino oligonucleotides  GeneTools custom made
mPEG5000 Lysan mPEG-NH2-5000
N-hydroxysuccinimde (NHS)  ACROS Organics 15727100
Ninhydrin Merck 1.06762.0100
Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich Invitrogen LC2001
Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich, 0.45 µm  Invitrogen LC2001
Novex ® Tris-Glycine Transfer Buffer (25X)  Invitrogen LC3675
Nude Mice [Tac:Cr:(MCr)-Foxnnm]  Taconic
PBS pH 7.2 10x Gibco 10010-49
PBS pH 7.2 1x Gibco 70013
PD-10 desalting columns GE Healthcare 17-0851
Physarum polycephalum M3CVII ATCC 204388
Pierce BCA protein assay  Thermo Scientific 23225
Protease inhibitor cocktail Roche 1.18362E+11
Protein Detector ELISA Kit KPL 54-62-18
Sephadex G-25 superfine GE Healthcare 17-0031
Sephadex G-75  GE Healthcare 17-0050
Sephadex-LH20  GE Healthcare 17-0090
SKBR-3  ATCC HTB-30
SPDP Proteochem  C1116
Streamline-DEAE GE Healthcare 17-0994
Styryl Red FM 1-43  Life Technologies  T-3163
TBS 10x Bio-Rad 170-6435
TCEP Sigma-Aldrich C4706-2G
TLC, silica coated aluminia sheets Merck, Darmstadt, DE 60F254
Trileucine (LLL) Bachem H-3915
Triton X-114  Sigma-Aldrich X114
Tween®20  Sigma-Aldrich P1379
Vivaspin 20  VWR 14005-302
DAPI Vector Laboratories, Burlingame, CA
Dexmedetomidine Pfizer
Atipamezole Pfizer
Carprofen Pfizer
Betadine Foster and Smith, Wisconsin
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References

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Ljubimova, J. Y., Ding, H., Portilla-Arias, J., Patil, R., Gangalum, P. R., Chesnokova, A., Inoue, S., Rekechenetskiy, A., Nassoura, T., Black, K. L., Holler, E. Polymalic Acid-based Nano Biopolymers for Targeting of Multiple Tumor Markers: An Opportunity for Personalized Medicine?. J. Vis. Exp. (88), e50668, doi:10.3791/50668 (2014).
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