A base di acido Polymalic Nano biopolimeri per il targeting di più marcatori tumorali: un'opportunità per la medicina personalizzata?

Inibizione del cancro al seno HER2-positivo umano mettendo a tacere l'espressione del recettore HER2 e bloccando HER2-segnalazione 12 Strategia Tra le diverse forme di cancro al seno umano, i tumori HER2-positivi hanno il peggior risultato clinico. Presentiamo il successo nel trattamento del carcinoma mammario HER2 overexpressing umano nel modello di topo nudo. La strategia comporta il farmaco nano attivo sia il silenziamento immediata della via di segnalazione HER2 impiegando Herceptin e HER2-specifico AON per bloccare la sintesi dipendente HER2-mRNA del recettore (Figura 1). Il coniugato nano piombo, che contiene Herceptin e anti-HER2 AON è mostrato in Figura 3, unitamente a due controlli privi di uno o AON Herceptin. Il composto di piombo contenuta anti-MsTfRmAb per raggiungere stravaso attivo transcitosi through legame TfR endoteliali dei vasi tumorali. Molto meno assorbimento nel tumore è stata osservata in assenza dell'anticorpo e stato attribuito a tumore effetto dipendente EPR 13. Versioni fluorescenti dei coniugati nano contenenti Alexa Fluor 680 sono stati sintetizzati per studi di imaging. . Figura 1 Meccanismo di consegna AON nelle cellule di carcinoma mammario HER2-positivo e inibizione della crescita tumorale in alto a sinistra:. Nano coniugato adattato dalla Figura 3. In basso a sinistra: vasi tumorali che esprimono TfR mouse sulla superficie. Il farmaco nano lega al recettore e entra nel tumore da transcitosi. Inoltre, un certo grado di accesso al tumore è possibile attraverso gli strati endoteliali disordinati che partecipano tumore dipende migliore assorbimento e retention (EPR) 13. Successivamente, il nanodrug lega a HER2 espresso sulle cellule tumorali umane e interiorizza in endosomi precoci. Legatura blocchi anche HER2 via di segnalazione. Dopo maturazione di endosomi e loro acidificazione, viene attivato il meccanismo endosome fuga del farmaco nano. Nanodrug entrare nel citoplasma viene rilasciata dalla piattaforma nano per scissione del disolfuro distanziatore e si lega a HER2-mRNA blocco HER2-sintesi. Blocco della sintesi estende blocco dei HER2-segnalamento e induce inibizione della crescita tumorale. Produzione microbica della piattaforma acido polymalic La piattaforma coniugato nano, acido polymalic (PMLA), è stato prodotto da microplasmodia colta Physarum polycephalum e purificata dal brodo come descritto nel protocollo e raffigurato in Figura 2. Produzione e purificazione erano lisce e riproducibile. Era importante cont tempo rol, pH e temperatura per evitare scissione spontanea del polimero. Un accurato lavaggio ed eluizione del DEAE-colonna è raccomandato al fine di eliminare DNA, carboidrati, tossine e materiale colorato. Estrema purezza è stato ottenuto dopo dissoluzione in acetone anidro e rimuovere il materiale insolubile. Importo totale dei prodotti PMLA era di 5 ± 1 g per la campagna. Quantità di 1,5 ± 0,5 g altamente purificati PMPLA di M w 80.000-100.000 sono stati raggiunti riproducibile quando si utilizza il 10 L bioreattore. Profili di eluizione Sec-HPLC sono simmetrici. Analisi light scattering dinamico in base alla distribuzione numero indicato un singolo picco corrispondente ad un diametro idrodinamico di 8 ± 1 nm e indice di polidispersità di PDI = 0.10 ± 0.02, calcolata dal software dello strumento per particelle sferiche assunte. Zeta-potenziale era -22 ± 2 mV (pH 7.5). / 50668/50668fig2highres.jpg "width =" 500 "/> Figura 2. Produzione e purificazione di acido polymalic da coltura micro plasmodia di Physarum polycephalum (adattato da Lee et al. 9). Acido Polymalic (PMLA) è ottenuto da plasmodia di Physarum polycephalum in un bioreattore e raccolti dal supernatante di coltura legandosi su scambiatore anionico (DEAE). L'eluente è etanolo-precipitato come sale di calcio. Soluzioni di sale di calcio sono Mw-frazionata over Sephadex-G25. PMLA contenenti decimali vengono convertiti dal Ca-sale in acido over Amberlite IR-120H +. La libera PMLA è finalmente liofilizzato per produrre polvere bianco secco. La sintesi chimica del nano coniugato piombo P / MPEG 5000 (5%) / Loet (40%) / AON (2,5%) / Herceptin (0,2%) / a nti-MsTfRmAb (0,2%) Le strutture schematiche del farmaco nano piombo e di due coniugati precursore nano sono mostrati in Fig. ure 3. Il cavo contiene tutti i componenti, mentre i precursori sono stati progettati mancare sia AON HER2 o l'anticorpo Herceptin. Oltre AON e mAbs, composti contenuti polietilenglicole, MPEG 5000, per minimizzare legarsi alle proteine ​​plasmatiche, passaggio attraverso il sistema reticolo-endoteliale (RES), e la degradazione mediante clivaggio enzimatico. La sequenza antisenso 5'-CAT-GGT-GCT-CAC-TGC-GGC-TCC-GGC-3 'è complementare al mRNA Her2 ed è stato accuratamente testato in vitro su varie linee cellulari che esprimono HER2 avere elevata specificità verso bloccando HER2 sintesi e non mostrare gli effetti off-target. 8/50668fig3highres.jpg "width =" 500 "/> Figura 3. Nano coniuga per curare il cancro al seno HER2-positivo umana. Leading farmaco nano (struttura in alto) contiene due farmaci (Herceptin, AON HER2). Le versioni 2 e 3 contengono solo uno dei farmaci. Assorbimento di 1 e 2 nelle cellule tumorali HER2-overexpressing umani è gestito dal legame di Herceptin. Nano coniugato 3, che non contiene Herceptin, ricevuta anti-HuTfRmAb per endosomi assorbimento da parte delle cellule umane. La coniugazione con Alexa Fluor 680 era facoltativo per scopi di imaging. La barra rossa rappresenta la piattaforma di nano coniugato PMLA / Loet (40%). % Indica la frazione di residui di acido malico consumati nel legame del ligando indicato (quantità totale di residui di acido malico nel nanodrug = 100%). Figura 4. Sintesi chimica di nanoconiugati P / Loet / AON HER2 / anti-MsTfR/Herceptin Dall'alto in basso:. Sintesi di PMLA-N-idrossi estere succinimidyl (PMLA-NHS) di carbossilati pendente (attivazione chimica). Sostituzione di NHS dalla formazione di ammide con 2-mercapto-1-aminoethan (2-MEA), metil-PEG 5000-ammina (mPEG 5000-NH 2), trileucine (LLL) o leucina etilico (Loet). Questa "preconjugate" attribuisce mAb-Mal-PEG-Mal da tioetereo formazione e di AON dalla formazione di ponti disolfuro scindibili. Leftover 2-MEA è limitato formando amidoethyl-dithio-propionico. Viene mostrato solo allacciamento di un singolo mAb. Più allegati sono gestiti utilizzando miscele di anticorpi monoclonali. Percentuale% indica frazioni di carbossilati legati a vari ligandi (100% gratis PMLA). I coniugati nano sono stati sintetizzati come indicato in Fig. ure 4. Il peso molecolare calcolato di piomboconiugato era 719.000. La resa globale della sintesi era del 45 ± 5% per quanto riguarda il contenuto di acido malico. In media, le 862 unità malyl (= 100%) della piattaforma di 100 kDa PMLA, il 40% realizzato Loet, 5% mPEG, 2% AON 2%, 0,2% e 0,2% Herceptin anti-MsTfR mAb. L'importo per ogni anticorpo corrisponde a una media di 1,7 molecole per molecola di piattaforma PMLA. Il% progettato e la% verificato mediante analisi gruppo erano gli stessi di ± 5%. Un esempio è il caso riportato nella tabella 1 per il calcolo del contenuto sperimentale di acido malico, AON, mAb e MPEG 5000 e nella tabella 2 mostra il confronto con il contenuto di progettazione. L'elevata purezza secondo i criteri di cui alla sezione 3 è stato raggiunto sulla base di rese elevate di reazione e separazione efficiente dall'esclusione formato (per esempio senza mAb e mAb-nanoconjugate sono separati da 1 min a sec-HPLC), e la solubilità nei solventi selettivi. L'attività degli anticorpi monoclonali era dimostrato di essere mantenuti anche nano sintesi dei farmaci, ed è stato confermato che i due tipi di anticorpi sono stati montati sulla stessa piattaforma polimero. Il risultato dell'esperimento atipica ELISA è mostrato in fig ure 5. In generale, i saggi per l'analisi quantitativa gruppo per l'acido malico, AON, proteine, PEG e per ELISA erano robusti, ottenendo risultati riproducibili quando condotto da diversi personale e strumentazione non solo nel caso della sintesi riportata, ma anche quando utilizzati per l'analisi di altre nanoconjugates sintetizzati. Tabella 1. Calcolo della composizione nanodrug con riferimento al contenuto di acido malico. 668table2.jpg "width =" 600 "/> Tabella 2. Confronto sperimentale nano composizione farmaco con composizione creazione. Figura 5. ELISA per la misurazione di affinità anticorpale dopo la sintesi chimica, e per la dimostrazione di aerei legame degli anticorpi differenti. Il farmaco nano contiene anticorpo mAb (A) e l'anticorpo monoclonale (B) contro antigeni A e B, rispettivamente. Piastre ELISA sono rivestiti con antigene (A). Libero mAb (A), libero mAb (B), e farmaci nano vengono applicati alle piastre ELISA. Dopo il lavaggio, gli anticorpi sono testati con perossidasi secondario anticorpi accoppiati specifici sia per mAb (A) o mAb (B), mentre solo mAb (A) è legato all'antigene (A). Si è visto che il farmaco libero e nano coniugato con mAb (A), e indirettamente coniugato mAb (B) dello stesso nano molecola del farmaco, ma non libero mAb (B), Vengono mantenute sul piatto. La dipendenza dalla concentrazione mostra affinità di legame comparabili per mAb libera e coniugata (A), che indica che la coniugazione chimica non ha influenzato l'attività di legame dell'anticorpo. Inoltre, la co-legatura di mAb (B) con mAb (A) sulla stessa entità fisica (piattaforma nano) comporta anticorpo mAb (B) rilevamento. I risultati sperimentali riportati sono riferiti al TfRmAb anti-umano (A) e anti-topo TfRmAb (B). Risultati simili sono stati indicati per le altre coppie di anticorpi testati, come anti-MsTfR mAb e anti-HER2 monoclonale (Herceptin). L'indagine fisico-chimiche indicato diametro idrodinamico 22,1 ± 2,3 nm per P / MPEG (5%) / Loet (40%) / AON (2%) / Herceptin (0,2%) / anti-MsTfRmAb (0,2%) (piombo, i due- versione droga), 20.1 ± 2.4 nm per la P / MPEG (5%) / Loet (40%) / AON (2%) / anti-MsTfRmAb (0,2%) / anti-HuTfRmAb (0,2%) (la versione droga AON) , e 15,1 ± 1,2 nm per P / MPEG (5%) / Loet (40%) / Herceptin (0,2%) (versione farmaco Herceptin). Zeta-potenziali a pH 7.5 Erano in questo ordine -5.2 ± 0,4 mV, -5,7 ± 0,6 mV, e -4,1 ± 0,4 mV. Va ricordato che il diametro idrodinamico misurata di coniugati nano non ha seguito additività dei diametri misurati per componenti liberi. La consegna della droga nano attraverso la membrana cellulare tumorale e rilasciare nel citoplasma dopo 0 hr e 3h r La consegna di farmaco nano attraverso la membrana cellulare da endosomi assorbimento è mostrato in Fig. 6 ure dopo 0 ore e 3 ore. Etichette fluorescenza sono attaccate alla piattaforma nano farmaco (Alexa Fluor 680, verde) e di AON (Lissamine, rosso). La loro sovrapposizione è mostrato in pannelli D & L e insieme alla fluorescenza di endosomi etichettati (blu) in pannelli G & O. Coefficienti di correlazione di Pearson (R (r) sono stati calcolati dalle immagini materia di co-localizzazione di piattaforme / endosomi, AON / endosomi, piattaforma / AON per 0 ore e 3 ore. Tegli 3 image hr indicata rilascio dalla endosomi nel citoplasma e dissociazione di AON dal farmaco nano glutatione-dipendente disolfuro scissione nel citoplasma. Figura 6. Microscopia confocale per nano coniugato assorbimento da parte delle cellule bersaglio (adattato da Ding et al. 11). Le cellule sono state incubate per 30 min a 37 ° C con farmaco nano che era stato letto marcato con Alexa Fluor 680 (verde) alla piattaforma polimero e con Lissamine (rosso) attaccato al AON. Inoltre, endosomi sono state colorate con FM1-43 (blu). La localizzazione è indicata dopo 0 ore (A) e 3 ore (B) incubazione. Pannelli A, ab, e B, ij spettacolo colorazione dai soli fluorofori nano coniugati, ela loro co-localizzazione in A, cd & B, kl. Inoltre, la colorazione di endosomi è mostrato in pannelli A, E & B, M e la colocalizzazione di nano coniugato e pannelli endosomesin A, fg & B, n. Pannelli A, h & B, contrasto p spettacolo di fase per rispettivi pannelli. (C) di correlazione di Pearson coefficienti R (r) per la colocalizzazione di piattaforma-endosomi, AON-endosomi, piattaforma AON calcolato per 0 ore e 3 ore. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura. Inibizione di cancro al seno umano in vitro e in vivo In inibizione della crescita in vitro di iperespressione di HER2 linea cellulare BT-474 in comconfronto con bassa linea cellulare esprimente MDA-MB-231 è mostrato in Fig. ure 7. Grado di inibizione è del 50% e del 30%, rispettivamente, dal piombo nano coniugato P / MPEG / Loet / AON HER2 / Herceptin / anti-MsTfRmAb. Inibizione dagli altri composti è inferiore ma superiore per BT-474 che per MDA-MB-231 cellule. Linea cellulare BT-474 è stata scelta per il trattamento del cancro al seno xenogenici topo. Figura 7. In vitro di inibizione della crescita di iperespressione di HER2 BT-474 cellule di cancro al seno e basso esprimere MDA-MB-231 cellule (adattato da Inoue et al. 12). Confronto di inibizione della crescita per iperespressione di HER2 BT-474 linea cellulare di carcinoma mammario ( sinistra) e di HER2 partire esprimendo linea cellulare di carcinoma mammario MDA-MB-231 (a destra). TfR (s) denota anti-MsTfRmAb e TfR (Hu / Ms) denota anti-HuTfRmAb e anti-MsTfRmAb. Il farmaco nano piombo, P / MPEG / Loet / AON HER2 / Herceptin / TfR (Ms), e le droghe nano privi di una Herceptin o AON HER2 sono confrontati con PBS, Herceptin e AON HER2. In assenza di Herceptin, anti-MsTfRmAb stato coniugato per fornire endosomi assorbimento da parte delle cellule tumorali. Le concentrazioni erano 40 mg / ml per quanto riguarda gli anticorpi, 4 micron per quanto riguarda la AON HER2, 4 mM endoporter (applicazione di AON). Importanza indicato con *, P <0,05: **, p <0.02: ***, P <0.003 rispetto con PBS. I risultati del trattamento in vivo in Figura 8 sono presentati per topi portatori BT-474 iperespressione di HER2 cancro al seno umano. La crescita è stata inibita> 95% dal nanodrug piombo contenente Herceptin e HER2-specifica AON rispetto ai controlli trattati solo con PBS (Fig. 8 ure). Inibizioneera del 60% o meno con Herceptin da solo, P / MPEG / Loet / Herceptin o P / MPEG / Loet / AON / anti-MsTfRmAb / anti-HuTfRmAb. Western blot di estratti tumorali ha mostrato l'inibizione della sintesi sia HER2 e fosforilazione di Akt, ma nessun cambiamento di totale Akt e le pulizie enzima GAPDH. PARP è stato segmentato in corrispondenza di un aumento del livello di apoptosi. Foto di tumore dopo il trattamento, e sezioni di tessuto colorate con H & E illustrando regressione del tumore sono mostrati in figura ure 9. Figura 8. Dimensioni del tumore e le proteine ​​durante il trattamento con piombo e precursori di droghe nano (adattato da Inoue et al.) 12. Una dimensione. Tumore per i vari trattamenti (giorno 21 al giorno 42, totalmente 8 iniezioni). Barre indicano normadeviazioni dalla media. Il cavo coniugato con anti-Her2 AON e Herceptin era superiore a uno solo Herceptin o singolo farmaco contenente coniugati nano. B. Effetto dei vari trattamenti sulla espressione di HER2, fosforilata Akt, totale Akt, PARB, PARB spaccati e GAPDH sono rappresentati da western blotting. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 9. Trattamento del BT-474 tumore HER2-positivo materno in topi nudi. Regressione tumorale e necrosi / apoptosi in sezioni di tessuto (adattato da Ionue et al. 12). Superiore: riduzione del tumore (frecce rosse). Indicazione del pellet estrogeni per sostenere la crescita del tumore (freccia blu). Lower: ematossilina & Eosine (H & E) colorazione di sezioni tumorali. Proliferazione tumorale è mostrato dalla densità della cellule tumorali. Il tessuto necrotico è visto dove sono state eliminate le cellule tumorali. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.