Metabolómica no focalizados de fuentes biológicas Uso UltraPerformance cromatografía líquida-espectrometría de masas de alta resolución (UPLC-HRMS)
Summary
Untargeted metabolómica ofrece una hipótesis de generación instantánea de un perfil metabólico. Este protocolo se demostrará la extracción y el análisis de los metabolitos de las células, suero, o tejidos. Una gama de metabolitos se examinó utilizando extracción en fase líquido-líquido, microflujo UltraPerformance cromatografía líquida / de alta resolución de la espectrometría de masas (UPLC-HRMS) acoplado al software de análisis diferencial.
Abstract
Aquí se presenta un flujo de trabajo para analizar los perfiles metabólicos en muestras biológicas de interés, incluyendo: células, suero o tejido. La muestra se separa primero en fracciones polares y no polares por una extracción en fase líquido-líquido, y se purificó parcialmente para facilitar el análisis aguas abajo. Ambas fases acuosas (metabolitos polares) y metabolitos orgánicos (no polares) de la extracción inicial se procesan para medir un amplio rango de metabolitos. Los metabolitos se separaron mediante diferentes métodos de cromatografía de líquidos en base a sus propiedades de la partición. En este método, presentamos microflow ultra-desempeño (UP) los métodos de LC, pero el protocolo es escalable a los flujos más elevados y presiones más bajas. La introducción en el espectrómetro de masas puede ser a través de cualquiera de las condiciones generales de origen optimizadas o compuesto. La detección de una amplia gama de iones se lleva a cabo en el modo de barrido completo tanto en modo positivo y negativo en un amplio rango de m / z usando alta resolución en una recientemente calibrated instrumento. Etiqueta libre de análisis diferencial se lleva a cabo en las plataformas bioinformáticas. Las aplicaciones de este enfoque incluyen la detección vía metabólica, el descubrimiento de biomarcadores y el desarrollo de fármacos.
Introduction
Debido a los recientes avances tecnológicos en el campo de HRMS, no focalizados, generador de hipótesis metabolómica enfoques se han convertido en un enfoque viable para el análisis de muestras complejas. 1 espectrómetros de masas capaces de facilitar la resolución 100000 de rutina bajo parte por millón (ppm) de masa de precisión han sido ampliamente disponible de varios proveedores. 2,3 Esta masa de precisión permite una mayor especificidad y la confianza en una asignación preliminar de la identidad del analito, reconocimiento de patrones isotópicos, y la identificación aducto. 4 Cuando se combina con un procedimiento de extracción adecuado y de alto rendimiento LC o UPLC, mezclas complejas puede ser analizado con especificidad adicional derivada de los datos de tiempo de retención. 5 UPLC posee una mayor eficiencia cromatográfica y permite tiempo mayor sensibilidad, resolución y análisis que expresa una mayor cobertura de la metaboloma posible. 6 Los grandes conjuntos de datos resultantes se pueden integrar en cualquierde software de análisis diferencial múltiple y extraídos de los patrones de útiles individuales o analitos de interés. 7,8,9,10,11 impacta putativos se pueden identificar inicialmente utilizando una combinación de algoritmos de detección de picos, basada en la predicción exacta fórmula química masa, la predicción de la fragmentación, y químico búsqueda de base de datos. Este enfoque permite la priorización de los objetivos de tiempo de identificación estructural completo o para el desarrollo de la dilución del isótopo estable más sensible y más específica UPLC / seleccionado o múltiples reacción monitoreo / estudios de MS, que son los actuales métodos estándar de oro para la cuantificación. 12
La naturaleza variable de las muestras biológicas ha conducido a la optimización de protocolos de extracción de orina 13, 14 células, suero de 15, 16 o tejido. Este protocolo de extracción de características para las células, el suero, y el tejido. En su caso, las observaciones y referencias adicionales se han incluido modificacionesción del procedimiento para abordar la inclusión de los isótopos estables, o la inclusión de metabolitos especialmente inestables.
Protocol
Representative Results
Discussion
Untargeted metabolómica ofrece una poderosa herramienta para la investigación de biotransformaciones endógenas o xenobióticos, o la captura de un perfil metabólico de una muestra de interés. La salida de las escalas técnica con la resolución y la sensibilidad de la tecnología utilizada para separar y analizar la muestra, la capacidad para hacer frente a los grandes conjuntos de datos generados, y la capacidad de extraer el conjunto de datos para obtener información útil (por ejemplo, precisa la búsq…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconocemos el apoyo de subvenciones del NIH P30ES013508 y 5T32GM008076. También damos las gracias Thermo Scientific para acceder a SIEVE 2.0 y los Dres. Eugene Ciccimaro y Mark Sanders de Thermo Scientific útil para los debates.
Materials
| Reagent | |||
| Phosphate Buffered Saline | Mediatech | 21-031-CM | |
| Water (H2O) | Fisher Scientific | W7-4 | (optima) |
| Acetonitrile (CH3CN) | Fisher Scientific | A996-4 | (optima) |
| Methanol (CH3OH) | Fisher Scientific | A454-4 | (optima) |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A464-4 | (optima) |
| Chloroform (CH3Cl) | Sigma-Aldrich | 366927 | Hazard |
| Dichloromethane (CH2Cl2) | Acros Organics | 61030-1000 | To replace chloroform |
| Diethyl Ether | Sigma-Aldrich | 346136 | To replace chloroform |
| Formic Acid (FA) | Fisher Scientific | (optima) | |
| NH4OH | Fisher Scientific | A470-250 | (optima) |
| Ammonium formate (HCOONH4) | Sigma-Aldrich | 78314 | |
| MicroSpin C18 Columns | Nest Group Inc | SS18V | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| 10 ml Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 73785-10 | |
| 10 ml Plastic Centrifuge Tubes | CellTreat | CLS-4301-015 | |
| LC Vials (glass) | Waters | 60000751CV | |
| LC Inserts (glass) | Waters | WAT094171 | |
| LC Vials (plastic) | Waters | 186002640 | |
| 0.22 μm Filters | Corning | 8169 | nylon |
| 2 ml Eppendorf Tubes | BioExpress | C-3229-1 | Low Retention |
| Equipment | |||
| High Resolution Mass Spectrometer | Thermo Scientific | LTQ XL-Orbitrap | |
| HPLC/UPLC | Waters | nanoACQUITY UPLC | |
| Source | Michrom | Thermo Advance Source | |
| Differential Analysis Software | Thermo Scientific | SIEVE 2.0 | |
| nanoACQUITY C18 BEH130 | Waters | 186003546 | 1.7 μm particle size, 150 mm x 100 μm |
| Acentis Express C8 | Sigma-Aldrich | 54262 | 2.7 μm particle size, 15 cm x 200 μm |
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