Untargeted Metabolomics aus biologischen Quellen Mit UltraPerformance Flüssigkeits-Chromatographie-hochauflösender Massenspektrometrie (UPLC-HRMS)
Summary
Untargeted metabolomics stellt eine Hypothese generieren Momentaufnahme eines metabolischen Profils. Dieses Protokoll wird zeigen, die Extraktion und Analyse von Metaboliten von Zellen, Serum oder Gewebe. Eine Reihe von Metaboliten werden mit flüssigem befragten-Flüssigphasenextraktion, Mikroströmungsfühler UltraPerformance Flüssigkeits-Chromatographie / hochauflösende Massenspektrometrie (UPLC-HRMS), gekoppelt mit Differential-Analyse-Software.
Abstract
Hier präsentieren wir einen Workflow, um die metabolische Profile für biologische Proben des Interesses einschließlich analysieren; Zellen, Serum oder Gewebe. Die Probe wird zunächst in polaren und nicht-polaren Fraktionen durch eine Flüssig-Flüssig-Flüssig-Extraktion abgetrennt und teilweise gereinigt, um stromabwärts Analyse zu erleichtern. Sowohl wässrige (polare Metaboliten) und organischen (nicht-polaren Metaboliten) Phasen der ersten Extraktion verarbeitet werden, um eine breite Palette von Metaboliten zu überblicken. Stoffwechselprodukte werden von verschiedenen Flüssigkeits-Chromatographie-Methoden auf ihre Eigenschaften Partition Basis getrennt. Bei diesem Verfahren stellen wir Mikroströmungsfühler ultra-Leistung (UP) LC-Methoden, aber das Protokoll ist skalierbar, um höhere Ströme und niedrigere Drücke. Einführung in das Massenspektrometer kann entweder durch allgemeine oder Verbindung optimierte Quelle Bedingungen. Erkennung von einem breiten Spektrum von Ionen erfolgt im Full-Scan-Modus in positive und negative Modus durchgeführt über einen breiten m / z-Bereich mit hoher Auflösung auf einem kürzlich calibrated Instrument. Markierungsfreie Differentialanalyse wird auf Bioinformatik-Plattformen durchgeführt. Anwendungen dieses Ansatzes umfassen Stoffwechselweg Screening zur Entdeckung von Biomarkern und Entwicklung von Arzneimitteln.
Introduction
Aufgrund der jüngsten technologischen Fortschritte auf dem Gebiet der HRMS haben ungezielte, Hypothesen-Generierung metabolomics Ansätze werden eine praktikable Ansatz zur Analyse von komplexen Proben. 1-Massenspektrometer zur Auflösung 100.000 erleichtert Routine niedrigen Teil pro Million (ppm) Massegenauigkeit haben sich weitgehend von verschiedenen Herstellern. 2,3 Diese Masse Genauigkeit ermöglicht eine größere Spezifität und Vertrauen in eine vorläufige Zuordnung der Analyten Identität Isotopen Mustererkennung und Addukt Identifikation. 4 Wenn mit einem geeigneten Extraktionsverfahren und High-Performance-LC oder UPLC, komplexe Mischungen gekoppelt kann mit zusätzlichen Spezifität von Verweilzeit Daten abgeleitet analysiert werden. 5 UPLC besitzt größere chromatographische Effizienz und ermöglicht eine höhere Empfindlichkeit, Auflösung und Analyse Zeit macht eine größere Abdeckung des Metaboloms möglich. 6 Die entstehenden großen Datenmengen können in einem integriert werdenmehrerer Differential-Analyse-Software und abgebaut für brauchbare Muster oder einzelne Analyten von Interesse. 7,8,9,10,11 Putative Treffern zunächst identifiziert werden mit einer Kombination aus Spitze Algorithmen, genaue Masse basierte chemische Formel Vorhersage, Fragmentierung Vorhersage und chemische Datenbank suchen. Dieser Ansatz ermöglicht die Priorisierung von Zielen für zeitaufwändige vollständige strukturelle Identifizierung oder für die Entwicklung von empfindlicher und präziser Isotopenverdünnungsanalyse UPLC / ausgewählte oder multiple reaction monitoring / MS-Studien, dass die derzeitige Goldstandard Methoden zur Quantifizierung sind. 12
Die unterschiedliche Art von biologischen Proben ist die Optimierung der Extraktion Protokolle für Urin 13 Zellen 14, 15 Serum oder Gewebe 16 geführt. Dieses Protokoll bietet Extraktionen für Zellen, Serum und Gewebe. Gegebenenfalls haben Kommentare und weitere Referenzen für Modifikationen einbezogengen des Verfahrens zur Bewältigung Einbeziehung von stabilen Isotopen, oder für die Aufnahme von besonders instabilen Metaboliten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Untargeted metabolomics bietet ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung von endogenen oder xenobiotischen Biotransformationen, oder die Erfassung eines metabolischen Profils aus einer Probe von Interesse. Der Ausgang der Technik skaliert mit der Auflösung und Empfindlichkeit der verwendeten Technologie zu trennen und analysieren die Probe, die Fähigkeit, mit der große Datenmengen erzeugt umzugehen, und die Fähigkeit, um die Datenmenge für nützliche Informationen (zB genaue Masse Datenbanksuche…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken für die Unterstützung der NIH Zuschüsse P30ES013508 und 5T32GM008076. Wir danken auch Thermo Scientific für den Zugang zu SIEVE 2.0 und Drs. Eugene Ciccimaro und Mark Sanders von Thermo Scientific für hilfreiche Diskussionen.
Materials
| Reagent | |||
| Phosphate Buffered Saline | Mediatech | 21-031-CM | |
| Water (H2O) | Fisher Scientific | W7-4 | (optima) |
| Acetonitrile (CH3CN) | Fisher Scientific | A996-4 | (optima) |
| Methanol (CH3OH) | Fisher Scientific | A454-4 | (optima) |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A464-4 | (optima) |
| Chloroform (CH3Cl) | Sigma-Aldrich | 366927 | Hazard |
| Dichloromethane (CH2Cl2) | Acros Organics | 61030-1000 | To replace chloroform |
| Diethyl Ether | Sigma-Aldrich | 346136 | To replace chloroform |
| Formic Acid (FA) | Fisher Scientific | (optima) | |
| NH4OH | Fisher Scientific | A470-250 | (optima) |
| Ammonium formate (HCOONH4) | Sigma-Aldrich | 78314 | |
| MicroSpin C18 Columns | Nest Group Inc | SS18V | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| 10 ml Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 73785-10 | |
| 10 ml Plastic Centrifuge Tubes | CellTreat | CLS-4301-015 | |
| LC Vials (glass) | Waters | 60000751CV | |
| LC Inserts (glass) | Waters | WAT094171 | |
| LC Vials (plastic) | Waters | 186002640 | |
| 0.22 μm Filters | Corning | 8169 | nylon |
| 2 ml Eppendorf Tubes | BioExpress | C-3229-1 | Low Retention |
| Equipment | |||
| High Resolution Mass Spectrometer | Thermo Scientific | LTQ XL-Orbitrap | |
| HPLC/UPLC | Waters | nanoACQUITY UPLC | |
| Source | Michrom | Thermo Advance Source | |
| Differential Analysis Software | Thermo Scientific | SIEVE 2.0 | |
| nanoACQUITY C18 BEH130 | Waters | 186003546 | 1.7 μm particle size, 150 mm x 100 μm |
| Acentis Express C8 | Sigma-Aldrich | 54262 | 2.7 μm particle size, 15 cm x 200 μm |
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