Metabolomics irrelevantes de fontes biológicas Usando UltraPerformance cromatografia líquida de alta resolução Espectrometria de Massa (UPLC-HRMS)
Summary
Irrelevantes metabolômica fornece uma hipótese gerando instantâneo de um perfil metabólico. Este protocolo irá demonstrar a extracção e análise de metabolitos a partir de células, soro ou tecido. Uma gama de metabolitos são pesquisadas utilizando extracção de fase líquido-líquido, cromatografia líquida de microfluxo UltraPerformance /-espectrometria de massa de alta resolução (UPLC-HRMS), acoplado ao software de análise diferencial.
Abstract
Apresentamos aqui um fluxo de trabalho para analisar os perfis metabólicos para amostras biológicas de interesse, incluindo: as células, soro ou tecido. A amostra é primeiro separado em fracções polares e não polares por uma extracção de fase líquido-líquido, e parcialmente purificada para facilitar a análise a jusante. Ambos aquosas (metabolitos polares) e orgânicos fases (metabólitos não-polares) da extracção inicial são processados para pesquisar uma ampla variedade de metabolitos. Os metabolitos são separados por diferentes métodos de cromatografia líquida com base em suas propriedades de partição. Neste método, apresentamos microfluxo ultra eficiência (UP), os métodos de LC, mas o protocolo é adaptar a fluxos mais elevados e pressões mais baixas. Introdução no espectrômetro de massa pode ser, quer através de condições de origem optimizado gerais ou composto. A detecção de uma ampla gama de iões é efectuada em modo de varrimento completo no modo positivo e negativo numa larga gama m / z usando alta resolução num recentemente cinstrumento alibrated. Etiqueta livre de análise diferencial é realizada em plataformas de bioinformática. Aplicações dessa abordagem incluem triagem metabólica caminho, descoberta de biomarcadores e desenvolvimento de medicamentos.
Introduction
Devido aos recentes avanços tecnológicos no campo da HRMS, irrelevantes, hipótese de geração de metabolômica abordagens tornaram-se uma abordagem viável para análise de amostras complexas. Uma espectrômetros de massa, capazes de facilitar a resolução de 100.000 rotina baixa parte por milhão (ppm) de precisão em massa tornaram-se amplamente disponível a partir de vários fornecedores. 2,3 Esta precisão massa permite uma maior especificidade e confiança em um trabalho preliminar de identidade analito, reconhecimento de padrões de isótopos, e identificação aduto. 4 Quando acoplado com um procedimento de extracção apropriado e de alto desempenho LC ou UPLC, misturas complexas podem ser analisados com especificidade adicional derivado a partir de dados de tempo de retenção. UPLC 5 possui uma maior eficiência cromatográfica e permite uma maior sensibilidade, resolução e análise do tempo fazendo uma maior cobertura do metaboloma possível. 6 As grandes conjuntos de dados resultantes pode ser integrado em qualquerde software de análise diferencial múltiplo e minado para os padrões úteis ou analitos de interesse individuais. 7,8,9,10,11 sucessos putativos podem ser identificados inicialmente usando uma combinação de algoritmos de detecção de pico, a previsão fórmula exata massa base química, a previsão de fragmentação e pesquisa de banco de dados de produtos químicos. Esta abordagem permite a priorização de metas para demorado identificação estrutural completa ou para o desenvolvimento de mais sensível e mais específico de diluição isotópica estável reação UPLC / selecionada ou múltipla monitoramento / MS estudos que são os métodos padrão ouro atual para a quantificação de 12.
A natureza variável das amostras biológicas tem levado a optimização de protocolos para extracção de urina 13, as células 14, 15 de soro, ou de tecido 16. Este protocolo características extracções de células, soro e tecido. Sempre que necessário, comentários e referências adicionais foram incluídas para modificaçãoções do processo para tratar a inclusão de isótopos estáveis, ou pela inclusão de metabolitos especialmente instáveis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Irrelevantes metabolômica oferece uma ferramenta poderosa para investigar biotransformações endógenos ou xenobióticos, ou a captura de um perfil metabólico de uma amostra de interesse. A saída das escalas técnica com a resolução e sensibilidade da tecnologia utilizada para separar e analisar a amostra, a capacidade de lidar com grandes conjuntos de dados gerados, bem como a capacidade para extrair o conjunto de dados para obter informações úteis (por exemplo, a pesquisa de banco de dados de massa e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconhecemos o apoio do NIH concede P30ES013508 e 5T32GM008076. Agradecemos também a Thermo Scientific para o acesso a PENEIRA 2.0 e drs. Eugene Ciccimaro e Mark Sanders da Thermo Scientific para discussões úteis.
Materials
| Reagent | |||
| Phosphate Buffered Saline | Mediatech | 21-031-CM | |
| Water (H2O) | Fisher Scientific | W7-4 | (optima) |
| Acetonitrile (CH3CN) | Fisher Scientific | A996-4 | (optima) |
| Methanol (CH3OH) | Fisher Scientific | A454-4 | (optima) |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A464-4 | (optima) |
| Chloroform (CH3Cl) | Sigma-Aldrich | 366927 | Hazard |
| Dichloromethane (CH2Cl2) | Acros Organics | 61030-1000 | To replace chloroform |
| Diethyl Ether | Sigma-Aldrich | 346136 | To replace chloroform |
| Formic Acid (FA) | Fisher Scientific | (optima) | |
| NH4OH | Fisher Scientific | A470-250 | (optima) |
| Ammonium formate (HCOONH4) | Sigma-Aldrich | 78314 | |
| MicroSpin C18 Columns | Nest Group Inc | SS18V | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| 10 ml Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 73785-10 | |
| 10 ml Plastic Centrifuge Tubes | CellTreat | CLS-4301-015 | |
| LC Vials (glass) | Waters | 60000751CV | |
| LC Inserts (glass) | Waters | WAT094171 | |
| LC Vials (plastic) | Waters | 186002640 | |
| 0.22 μm Filters | Corning | 8169 | nylon |
| 2 ml Eppendorf Tubes | BioExpress | C-3229-1 | Low Retention |
| Equipment | |||
| High Resolution Mass Spectrometer | Thermo Scientific | LTQ XL-Orbitrap | |
| HPLC/UPLC | Waters | nanoACQUITY UPLC | |
| Source | Michrom | Thermo Advance Source | |
| Differential Analysis Software | Thermo Scientific | SIEVE 2.0 | |
| nanoACQUITY C18 BEH130 | Waters | 186003546 | 1.7 μm particle size, 150 mm x 100 μm |
| Acentis Express C8 | Sigma-Aldrich | 54262 | 2.7 μm particle size, 15 cm x 200 μm |
References
- Pluskal, T., Nakamura, T., Villar-Briones, A., Yanagida, M. Metabolic profiling of the fission yeast S. pombe: quantification of compounds under different temperatures and genetic perturbation. Mol. Biosyst. 6 (1), 182-198 (2010).
- Makarov, A., Denisov, E., et al. Performance Evaluation of a Hybrid Linear Ion Trap/Orbitrap Mass Spectrometer. Analytical Chemistry. 78 (7), 2113-2120 (2006).
- Timischl, B., Dettmer, K., Kaspar, H., Thieme, M., Oefner, P. J. Development of a quantitative, validated capillary electrophoresis-time of flight-mass spectrometry method with integrated high-confidence analyte identification for metabolomics. Electrophoresis. 29 (10), 2203-2214 (2008).
- Katajamaa, M., Oresic, M. Data processing for mass spectrometry-based metabolomics. J. Chromatogr. A. 1158 (1-2), 318-328 (2007).
- Katajamaa, M., Oresic, M. Processing methods for differential analysis of LC/MS profile data. BMC Bioinformatics. 6, 179 (2005).
- Wilson, I. D., Nicholson, J. K., et al. High resolution ultra performance liquid chromatography coupled to q-TOF mass spectrometry as a tool for differential metabolic pathway profiling in functional genomic studies. Journal of Proteome Research. 4 (2), 591-598 (2005).
- Benton, H. P., Wong, D. M., Trauger, S. A., Siuzdak, G. XCMS2: processing tandem mass spectrometry data for metabolite identification and structural characterization. Anal. Chem. 80 (16), 6382-6389 (2008).
- Katajamaa, M., Miettinen, J., Oresic, M. MZmine: toolbox for processing and visualization of mass spectrometry based molecular profile data. Bioinformatics. 22 (5), 634-636 (2006).
- Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Oresic, M. MZmine 2: Modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11 (1), 395 (2010).
- Smith, C. A., Want, E. J., O’Maille, G., Abagyan, R., Siuzdak, G. XCMS: Processing Mass Spectrometry Data for Metabolite Profiling Using Nonlinear Peak Alignment, Matching, and Identification. Analytical Chemistry. 78 (3), 779-787 (2006).
- Tautenhahn, R., Patti, G. J., Rinehart, D., Siuzdak, G. XCMS Online: A Web-Based Platform to Process Untargeted Metabolomic Data. Analytical Chemistry. 84 (11), 5035-5039 (2012).
- Gelhaus, S. L., Mesaros, A. C., Blair, I. A. Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (57), e3399 (2011).
- Want, E. J., Wilson, I. D., et al. Global metabolic profiling procedures for urine using UPLCGÇôMS. Nature Protocols. 5 (6), 1005-1018 (2010).
- Sellick, C. A., Hansen, R., Stephens, G. M., Goodacre, R., Dickson, A. J. Metabolite extraction from suspension-cultured mammalian cells for global metabolite profiling. Nature Protocols. 6 (8), 1241-1249 (2011).
- Dunn, W. B., Broadhurst, D., et al. Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nature protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).
- Masson, P., Alves, A. C., Ebbels, T. M. D., Nicholson, J. K., Want, E. J. Optimization and evaluation of metabolite extraction protocols for untargeted metabolic profiling of liver samples by UPLC-MS. Analytical Chemistry. 82 (18), 7779-7786 (2010).
- Shaham, O., Slate, N. G., et al. A plasma signature of human mitochondrial disease revealed through metabolic profiling of spent media from cultured muscle cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (4), 1571-1575 (2010).
- Cequier-Saünchez, E., Rodriüguez, C., Ravelo, A. G., Zaürate, R. Dichloromethane as a Solvent for Lipid Extraction and Assessment of Lipid Classes and Fatty Acids from Samples of Different Natures. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (12), 4297-4303 (2008).
- Keller, A., Eng, J., Zhang, N., Li, X. J., Aebersold, R. A uniform proteomics MS/MS analysis platform utilizing open XML file formats. Mol. Syst. Biol. 1, (2005).
- Cleveland, W. S., Devlin, S. J. Locally weighted regression – an approach to regression-analysis by local fitting. J. Am. Stat. Assoc. 83 (403), 596-610 (1988).
- Lange, E., Tautenhahn, R., Neumann, S., Gropl, C. Critical assessment of alignment procedures for LC-MS proteomics and metabolomics measurements. BMC Bioinformatics. 9 (1), 375 (2008).
- Tautenhahn, R., Bottcher, C., Neumann, S. Highly sensitive feature detection for high resolution LC/MS. BMC Bioinformatics. 9 (1), 504 (2008).
- Kuhl, C., Tautenhahn, R., Bottcher, C., Larson, T. R., Neumann, S. CAMERA: An Integrated Strategy for Compound Spectra Extraction and Annotation of Liquid Chromatography/Mass Spectrometry Data Sets. Analytical Chemistry. 84 (1), 283-289 (2012).
- Kanehisa, M., Goto, S. KEGG: kyoto encyclopedia of genes and genomes. Nucleic Acids Res. 28 (1), 27-30 (2000).
- Smith, C. A., O’Maille, G., et al. METLIN: a metabolite mass spectral database. Ther. Drug Monit. 27 (6), 747-751 (2005).
- Wang, Y., Xiao, J., Suzek, T. O., Zhang, J., Wang, J., Bryant, S. H. PubChem: a public information system for analyzing bioactivities of small molecules. Nucleic Acids Res. 37 Web Server, W623-W633 (2009).
- Wishart, D. S., Knox, C., et al. HMDB: a knowledgebase for the human metabolome. Nucleic Acids Res. 37 Database, D603-D610 (2009).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
- Folch, J. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. J. Biol. Chem. 226, 497-509 (1957).
- Avery, M. J. Quantitative characterization of differential ion suppression on liquid chromatography/atmospheric pressure ionization mass spectrometric bioanalytical methods. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 17 (3), 197-201 (2003).
