Metabolomica non mirati da fonti biologiche Uso UltraPerformance cromatografia liquida-spettrometria di massa ad alta risoluzione (UPLC-HRMS)
Summary
Non mirati metabolomica fornisce una ipotesi la generazione di un'istantanea di un profilo di metabolico. Questo protocollo dimostrerà la estrazione e l'analisi delle metaboliti provenienti da cellule, siero, o tessuto. Una gamma di metaboliti vengono intervistati usando l'estrazione in fase liquido-liquido, microflusso UltraPerformance liquida cromatografia in fase / ad alta-risoluzione di massa spettrometria di (UPLC-HRMS) accoppiato ad software di analisi differenziale di.
Abstract
Qui vi presentiamo un flusso di lavoro per analizzare i profili metabolici per i campioni biologici di interesse, tra cui: le cellule, siero o tessuto. Il campione viene prima separato in frazioni polari e non polari da una fase di estrazione liquido-liquido, e parzialmente purificato per facilitare l'analisi a valle. Entrambi acquose (metaboliti polari) e biologici (metaboliti non polari) fasi di estrazione iniziale vengono elaborati per rilevare una vasta gamma di metaboliti. Metaboliti sono separati da diversi metodi di cromatografia liquida in base alla loro proprietà di partizione. In questo metodo, vi presentiamo microflow ultra-prestazioni (UP) i metodi LC, ma il protocollo è scalabile per i flussi più elevati e pressioni più basse. Introduzione nello spettrometro di massa può essere attraverso sia le condizioni generali o di composti di origine ottimizzati. Rilevamento di una vasta gamma di ioni viene eseguito in modalità di scansione completa in modalità sia positivi che negativi su un'ampia m / z gamma utilizzando ad alta risoluzione su un recente calibrated strumento. Analisi differenziale senza etichetta viene eseguita su piattaforme bioinformatiche. Le applicazioni di questo approccio includono lo screening metabolico percorso, scoperta di biomarcatori, e lo sviluppo di farmaci.
Introduction
A causa di recenti progressi tecnologici nel campo della HRMS, non mirati, ipotesi generatrici metabolomica approcci sono diventati un approccio possibile per l'analisi di campioni complessi. 1 spettrometri di massa in grado di facilitare la risoluzione 100.000 di routine parte bassa per milione (ppm) di accuratezza di massa sono diventati ampiamente disponibile da fornitori diversi. 2,3 Questa accuratezza di massa consente una maggiore specificità e la fiducia in una assegnazione preliminare di identità dell'analita, pattern recognition isotopica, e l'identificazione addotto. 4 Quando accoppiato con una procedura di estrazione appropriato e LC o UPLC, miscele complesse ad alte prestazioni possono essere analizzati con specificità ulteriore derivato da dati di tempo di ritenzione. 5 UPLC possiede una maggiore efficienza cromatografica e permette una maggiore sensibilità, risoluzione e analisi in tempo facendo una maggiore copertura del metabolome possibile. 6 Le grandi serie di dati risultanti possono essere integrati in qualsiasidi molteplici software di analisi differenziale e estratti di modelli utili o di singoli analiti di interesse. 7,8,9,10,11 colpi putativi possono essere inizialmente identificati utilizzando una combinazione di algoritmi di rilevamento di picco, massa accurata predizione basata formula chimica, la previsione di frammentazione, e chimico ricerca del database. Questo approccio consente di priorità di obiettivi per il tempo completa identificazione strutturale o per lo sviluppo di diluizione degli isotopi stabili più sensibile e più specifico monitoraggio UPLC / selezionato o multiplo reazione / studi di MS che sono gli attuali metodi standard d'oro per la quantificazione. 12
Diversa natura dei campioni biologici ha portato ad ottimizzare protocolli di estrazione per l'urina 13, 14 cellule, siero 15, o il tessuto 16. Questo protocollo caratteristiche estrazioni per le cellule, siero e tessuto. Se del caso, i commenti ei riferimenti aggiuntivi sono stati inclusi per la modificazione della procedura per tener conto dell'inclusione di isotopi stabili, o per l'inserimento di metaboliti particolarmente instabili.
Protocol
Representative Results
Discussion
Non mirati metabolomica offre un potente strumento per indagare biotrasformazioni endogeni o xenobiotic, o di catturando un profilo di metabolico da un campione di interesse. L'output di i scale di di tecnica con la risoluzione e la sensibilità del la tecnologia utilizzata per separare e analizzare il campione di, la capacità di affrontare con le grandi serie di dati generate, e la capacità a mine il set di dati per informazioni utili (ad es accurata ricerca in basi dati di massa). Recentemente, questo ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Noi riconosciamo sostegno di NIH borse di studio P30ES013508 e di 5T32GM008076. Ringraziamo anche Thermo Scientific per l'l'accesso a SIEVE 2.0 e di Drs. Eugene Ciccimaro e Mark Sanders di Thermo Scientific per le discussioni utili.
Materials
| Reagent | |||
| Phosphate Buffered Saline | Mediatech | 21-031-CM | |
| Water (H2O) | Fisher Scientific | W7-4 | (optima) |
| Acetonitrile (CH3CN) | Fisher Scientific | A996-4 | (optima) |
| Methanol (CH3OH) | Fisher Scientific | A454-4 | (optima) |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A464-4 | (optima) |
| Chloroform (CH3Cl) | Sigma-Aldrich | 366927 | Hazard |
| Dichloromethane (CH2Cl2) | Acros Organics | 61030-1000 | To replace chloroform |
| Diethyl Ether | Sigma-Aldrich | 346136 | To replace chloroform |
| Formic Acid (FA) | Fisher Scientific | (optima) | |
| NH4OH | Fisher Scientific | A470-250 | (optima) |
| Ammonium formate (HCOONH4) | Sigma-Aldrich | 78314 | |
| MicroSpin C18 Columns | Nest Group Inc | SS18V | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| 10 ml Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 73785-10 | |
| 10 ml Plastic Centrifuge Tubes | CellTreat | CLS-4301-015 | |
| LC Vials (glass) | Waters | 60000751CV | |
| LC Inserts (glass) | Waters | WAT094171 | |
| LC Vials (plastic) | Waters | 186002640 | |
| 0.22 μm Filters | Corning | 8169 | nylon |
| 2 ml Eppendorf Tubes | BioExpress | C-3229-1 | Low Retention |
| Equipment | |||
| High Resolution Mass Spectrometer | Thermo Scientific | LTQ XL-Orbitrap | |
| HPLC/UPLC | Waters | nanoACQUITY UPLC | |
| Source | Michrom | Thermo Advance Source | |
| Differential Analysis Software | Thermo Scientific | SIEVE 2.0 | |
| nanoACQUITY C18 BEH130 | Waters | 186003546 | 1.7 μm particle size, 150 mm x 100 μm |
| Acentis Express C8 | Sigma-Aldrich | 54262 | 2.7 μm particle size, 15 cm x 200 μm |
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