الايض غير مستهدفة من مصادر بيولوجية عن طريق Ultraperformance اللوني السائل عالية الدقة الطيف الكتلي (UPLC-HRMS)
Summary
يوفر تشتته الايض فرضية توليد قطة من الملف الشخصي الأيضية. سوف يشكل هذا البروتوكول شرح استخراج وتحليل نواتج الأيض من الخلايا، المصل، أو الأنسجة. يتم شملهم الاستطلاع مجموعة من نواتج الأيض باستخدام الاستخلاص في الطور السائل السائل، تتدفق ultraperformance السائل اللوني / عالية الدقة قياس الطيف الكتلي (UPLC-HRMS) إلى جانب لبرامج التحليل التفاضلي.
Abstract
هنا نقدم سير العمل لتحليل ملامح التمثيل الغذائي للعينات البيولوجية من الفائدة بما في ذلك؛ الخلايا، المصل، أو الأنسجة. يتم فصل العينة الأولى إلى الكسور القطبية وغير القطبية من قبل الاستخلاص في الطور السائل السائل، وتنقيته جزئيا لتسهيل تحليل المصب. تتم معالجة كل مائي (الأيض القطبية) والعضوية مراحل (مستقلبات غير القطبية) من استخراج الأولية لمسح مجموعة واسعة من المركبات. يتم فصل نواتج الأيض من قبل مختلف أساليب اللوني السائل على أساس خصائص التقسيم الخاصة بهم. في هذه الطريقة، فإننا نقدم تتدفق فائقة الأداء (UP) طرق LC، إلا أن البروتوكول هو تحجيم لارتفاع التدفقات والضغوط أقل. مقدمة في مطياف الكتلة يمكن أن تكون إما من خلال الظروف المصدر الأمثل عامة أو مركب. ويتم الكشف عن مجموعة واسعة من الأيونات في وضع المسح الضوئي الكامل في وضع حد سواء الإيجابية والسلبية على م / ض مجموعة واسعة باستخدام وارتفاع القرار مؤخرا على جalibrated الصك. ويتم تسمية خالية من التحليل التفاضلي من على منصات المعلوماتية الحيوية. وتشمل تطبيقات هذا النهج التمثيل الغذائي فحص المسار، واكتشاف العلامات البيولوجية، وتطوير العقاقير.
Introduction
بسبب التطورات التكنولوجية الحديثة في مجال إدارة الموارد البشرية، وأصبحت غير مستهدفة، وتوليد فرضية نهج الايض نهجا عمليا لتحليل العينات المعقدة. 1 الطيف الشامل قادرة على 100،000 قرار تسهيل جزءا روتينيا منخفضة لكل مليون (جزء في المليون) دقة الشامل أصبحت على نطاق واسع المتاحة من بائعين متعددين. 2،3 هذه الدقة الشامل يسمح توخي المزيد من الدقة والثقة في مهمة أولية للهوية الحليلة، والتعرف على نمط النظائر، وتحديد معقد إضافي. 4 عندما يقترن إجراء استخراج مناسبة وعالية الأداء LC أو UPLC، مخاليط معقدة يمكن تحليلها مع خصوصية إضافية مستمدة من بيانات الوقت الاحتفاظ. 5 UPLC تمتلك أكبر كفاءة الكروماتوغرافي ويسمح حساسية أكبر، والقرار وتحليل الوقت مما يجعل تغطية أشمل للmetabolome ممكن. 6 هل يمكن دمج مجموعات البيانات الكبيرة الناتجة إلى أيمن عدة برامج التحليل التفاضلي والملغومة لأنماط مفيدة أو التحاليل فرد من الفائدة. 7،8،9،10،11 الفعالية المزعومين يمكن تحديدها في البداية باستخدام مزيج من خوارزميات الكشف عن ذروة ودقيقة على التنبؤ الصيغة الكيميائية الشامل، والتنبؤ تجزئة، و البحث في قاعدة البيانات الكيميائية. يسمح هذا النهج تحديد أولويات الأهداف لتستغرق وقتا طويلا تحديد هيكلية كاملة أو لتطوير أكثر حساسية وأكثر تحديدا مستقرة تخفيف النظائر UPLC / المحددة أو متعددة رد فعل الرصد / دراسات MS التي هي الأساليب الذهب القياسية الحالية لتقدير 12
وقد أدى طبيعة متفاوتة من العينات البيولوجية لتعظيم الاستفادة من البروتوكولات استخراج البول ل13، 14 الخلايا، المصل 15، 16 أو الأنسجة. هذه الميزات بروتوكول الكميات المستخرجة للخلايا، ومصل، والأنسجة. حيثما كان ذلك مناسبا، وقد أدرجت التعليقات ومراجع إضافية لmodificaستعقد الإجراء لمعالجة إدراج النظائر المستقرة، أو لإدراج نواتج الأيض خصوصا غير مستقر.
Protocol
Representative Results
Discussion
تشتته الايض يوفر أداة قوية لتحقيق التحولات الحيوية الذاتية أو أجنبي بيولوجيا، أو التقاط لمحة الأيضية من عينة من الفائدة. الناتج من المقاييس التقنية مع القرار وحساسية التكنولوجيا المستخدمة لفصل وتحليل العينة، والقدرة على التعامل مع مجموعات كبيرة من البيانات المتول…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نعترف الدعم من المعاهد الوطنية للصحة منح P30ES013508 و5T32GM008076. كما نشكر الحرارية العلمية من أجل الوصول إلى SIEVE 2.0 والدكاترة. يوجين Ciccimaro ومارك ساندرز الحرارية العلمية لإجراء مناقشات مفيدة.
Materials
| Reagent | |||
| Phosphate Buffered Saline | Mediatech | 21-031-CM | |
| Water (H2O) | Fisher Scientific | W7-4 | (optima) |
| Acetonitrile (CH3CN) | Fisher Scientific | A996-4 | (optima) |
| Methanol (CH3OH) | Fisher Scientific | A454-4 | (optima) |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A464-4 | (optima) |
| Chloroform (CH3Cl) | Sigma-Aldrich | 366927 | Hazard |
| Dichloromethane (CH2Cl2) | Acros Organics | 61030-1000 | To replace chloroform |
| Diethyl Ether | Sigma-Aldrich | 346136 | To replace chloroform |
| Formic Acid (FA) | Fisher Scientific | (optima) | |
| NH4OH | Fisher Scientific | A470-250 | (optima) |
| Ammonium formate (HCOONH4) | Sigma-Aldrich | 78314 | |
| MicroSpin C18 Columns | Nest Group Inc | SS18V | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| 10 ml Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 73785-10 | |
| 10 ml Plastic Centrifuge Tubes | CellTreat | CLS-4301-015 | |
| LC Vials (glass) | Waters | 60000751CV | |
| LC Inserts (glass) | Waters | WAT094171 | |
| LC Vials (plastic) | Waters | 186002640 | |
| 0.22 μm Filters | Corning | 8169 | nylon |
| 2 ml Eppendorf Tubes | BioExpress | C-3229-1 | Low Retention |
| Equipment | |||
| High Resolution Mass Spectrometer | Thermo Scientific | LTQ XL-Orbitrap | |
| HPLC/UPLC | Waters | nanoACQUITY UPLC | |
| Source | Michrom | Thermo Advance Source | |
| Differential Analysis Software | Thermo Scientific | SIEVE 2.0 | |
| nanoACQUITY C18 BEH130 | Waters | 186003546 | 1.7 μm particle size, 150 mm x 100 μm |
| Acentis Express C8 | Sigma-Aldrich | 54262 | 2.7 μm particle size, 15 cm x 200 μm |
References
- Pluskal, T., Nakamura, T., Villar-Briones, A., Yanagida, M. Metabolic profiling of the fission yeast S. pombe: quantification of compounds under different temperatures and genetic perturbation. Mol. Biosyst. 6 (1), 182-198 (2010).
- Makarov, A., Denisov, E., et al. Performance Evaluation of a Hybrid Linear Ion Trap/Orbitrap Mass Spectrometer. Analytical Chemistry. 78 (7), 2113-2120 (2006).
- Timischl, B., Dettmer, K., Kaspar, H., Thieme, M., Oefner, P. J. Development of a quantitative, validated capillary electrophoresis-time of flight-mass spectrometry method with integrated high-confidence analyte identification for metabolomics. Electrophoresis. 29 (10), 2203-2214 (2008).
- Katajamaa, M., Oresic, M. Data processing for mass spectrometry-based metabolomics. J. Chromatogr. A. 1158 (1-2), 318-328 (2007).
- Katajamaa, M., Oresic, M. Processing methods for differential analysis of LC/MS profile data. BMC Bioinformatics. 6, 179 (2005).
- Wilson, I. D., Nicholson, J. K., et al. High resolution ultra performance liquid chromatography coupled to q-TOF mass spectrometry as a tool for differential metabolic pathway profiling in functional genomic studies. Journal of Proteome Research. 4 (2), 591-598 (2005).
- Benton, H. P., Wong, D. M., Trauger, S. A., Siuzdak, G. XCMS2: processing tandem mass spectrometry data for metabolite identification and structural characterization. Anal. Chem. 80 (16), 6382-6389 (2008).
- Katajamaa, M., Miettinen, J., Oresic, M. MZmine: toolbox for processing and visualization of mass spectrometry based molecular profile data. Bioinformatics. 22 (5), 634-636 (2006).
- Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Oresic, M. MZmine 2: Modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11 (1), 395 (2010).
- Smith, C. A., Want, E. J., O’Maille, G., Abagyan, R., Siuzdak, G. XCMS: Processing Mass Spectrometry Data for Metabolite Profiling Using Nonlinear Peak Alignment, Matching, and Identification. Analytical Chemistry. 78 (3), 779-787 (2006).
- Tautenhahn, R., Patti, G. J., Rinehart, D., Siuzdak, G. XCMS Online: A Web-Based Platform to Process Untargeted Metabolomic Data. Analytical Chemistry. 84 (11), 5035-5039 (2012).
- Gelhaus, S. L., Mesaros, A. C., Blair, I. A. Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (57), e3399 (2011).
- Want, E. J., Wilson, I. D., et al. Global metabolic profiling procedures for urine using UPLCGÇôMS. Nature Protocols. 5 (6), 1005-1018 (2010).
- Sellick, C. A., Hansen, R., Stephens, G. M., Goodacre, R., Dickson, A. J. Metabolite extraction from suspension-cultured mammalian cells for global metabolite profiling. Nature Protocols. 6 (8), 1241-1249 (2011).
- Dunn, W. B., Broadhurst, D., et al. Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nature protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).
- Masson, P., Alves, A. C., Ebbels, T. M. D., Nicholson, J. K., Want, E. J. Optimization and evaluation of metabolite extraction protocols for untargeted metabolic profiling of liver samples by UPLC-MS. Analytical Chemistry. 82 (18), 7779-7786 (2010).
- Shaham, O., Slate, N. G., et al. A plasma signature of human mitochondrial disease revealed through metabolic profiling of spent media from cultured muscle cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (4), 1571-1575 (2010).
- Cequier-Saünchez, E., Rodriüguez, C., Ravelo, A. G., Zaürate, R. Dichloromethane as a Solvent for Lipid Extraction and Assessment of Lipid Classes and Fatty Acids from Samples of Different Natures. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (12), 4297-4303 (2008).
- Keller, A., Eng, J., Zhang, N., Li, X. J., Aebersold, R. A uniform proteomics MS/MS analysis platform utilizing open XML file formats. Mol. Syst. Biol. 1, (2005).
- Cleveland, W. S., Devlin, S. J. Locally weighted regression – an approach to regression-analysis by local fitting. J. Am. Stat. Assoc. 83 (403), 596-610 (1988).
- Lange, E., Tautenhahn, R., Neumann, S., Gropl, C. Critical assessment of alignment procedures for LC-MS proteomics and metabolomics measurements. BMC Bioinformatics. 9 (1), 375 (2008).
- Tautenhahn, R., Bottcher, C., Neumann, S. Highly sensitive feature detection for high resolution LC/MS. BMC Bioinformatics. 9 (1), 504 (2008).
- Kuhl, C., Tautenhahn, R., Bottcher, C., Larson, T. R., Neumann, S. CAMERA: An Integrated Strategy for Compound Spectra Extraction and Annotation of Liquid Chromatography/Mass Spectrometry Data Sets. Analytical Chemistry. 84 (1), 283-289 (2012).
- Kanehisa, M., Goto, S. KEGG: kyoto encyclopedia of genes and genomes. Nucleic Acids Res. 28 (1), 27-30 (2000).
- Smith, C. A., O’Maille, G., et al. METLIN: a metabolite mass spectral database. Ther. Drug Monit. 27 (6), 747-751 (2005).
- Wang, Y., Xiao, J., Suzek, T. O., Zhang, J., Wang, J., Bryant, S. H. PubChem: a public information system for analyzing bioactivities of small molecules. Nucleic Acids Res. 37 Web Server, W623-W633 (2009).
- Wishart, D. S., Knox, C., et al. HMDB: a knowledgebase for the human metabolome. Nucleic Acids Res. 37 Database, D603-D610 (2009).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
- Folch, J. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. J. Biol. Chem. 226, 497-509 (1957).
- Avery, M. J. Quantitative characterization of differential ion suppression on liquid chromatography/atmospheric pressure ionization mass spectrometric bioanalytical methods. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 17 (3), 197-201 (2003).
