Metabolomics לא ממוקדים ממקורות ביולוגיים באמצעות Ultraperformance כרומטוגרפיה נוזלית-רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה (UPLC-HRMS)
Summary
לא ממוקד metabolomics מספק השערת יצירת תמונת מצב של פרופיל מטבולי. פרוטוקול זה יהיה להדגים את המיצוי והניתוח של מטבוליטים מתאי, סרום, או רקמות. מגוון המטבוליטים סקר באמצעות מיצוי שלב נוזלי נוזלי, microflow ultraperformance כרומטוגרפיה נוזלית / רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה (UPLC-HRMS) מצמידים את תוכנת ניתוח ההפרש.
Abstract
כאן אנו מציגים זרימת עבודה כדי לנתח את הפרופילים המטבוליים לדגימות ביולוגיות של עניין, כולל; תאים, סרום, או רקמה. המדגם מופרד ראשון לשברים קוטביים ולא קוטבי על ידי מיצוי שלב נוזלי נוזלי, ומטוהר באופן חלקי כדי להקל על ניתוח במורד הזרם. שניהם מימיים (מטבוליטים קוטב) ואורגניים (מטבוליטים שאינם קוטביים) שלבי ההפקה הראשונית מעובדים ליסקרו מגוון רחב של מטבוליטים. מטבוליטים מופרדים על ידי שיטות כרומטוגרפיה נוזליות שונות המבוססות על מאפייני החלוקה שלהם. בשיטה זו, אנו מציגים Ultra-ביצועי microflow (UP) שיטות LC, אך הוא ניתן להרחבה לפרוטוקול תזרים גבוה ולחצים נמוכים יותר. מבוא לספקטרומטר המסה יכול להיות דרך או תנאים אופטימליים כלליים מקור או תרכובת. זיהוי של מגוון רחב של יונים מתבצע במצב סריקה מלא במצב חיובי ושלילי על פני טווח מ '/ z רחב ברזולוציה גבוהה תוך שימוש בבאחרונה גalibrated מכשיר. תווית ללא ניתוח ההפרש מתבצע על פלטפורמות ביואינפורמטיקה. יישומים של גישה זו כוללים הקרנת טבולי מסלול, גילוי סמן ביולוגי, ופיתוח תרופות.
Introduction
בשל התקדמות טכנולוגית האחרונה בתחום HRMS, לא ממוקדים, בmetabolomics השערה שהניבו גישות הפכו גישה אפשרית לניתוח של דגימות מורכבות. 1 ספקטרומטרים המוני המסוגלים להקל על חלק 100,000 רזולוציה נמוכה שגרה למ' (חל"מ) דיוק המוני הפכו נרחב זמין של ספקים מרובים. 2,3 דיוק זו מאפשר מסה סגוליות ואמון במשימה ראשונית של זהות אנליטי, זיהוי תבניות איזוטופי, והזדהות adduct גדולים יותר. 4 בשילוב עם הליך מיצוי הולם ו, תערובות מורכבות עתירי ביצועים LC או UPLC ניתן לנתח עם ייחוד נוסף נובע מנתונים בזמן שמירה. 5 UPLC בעל יעילות רבה יותר ומאפשר chromatographic רגישות רבה יותר, רזולוציה וניתוח בזמן ביצוע כיסוי גדול יותר של 6 metabolome אפשרי. במערכי הנתונים הגדולים כתוצאה מכך יכולים להיות משולבים בכלשל תוכנת ניתוח ההפרש מרובה ולכרות לדפוסים שימושיים או analytes הבודדים של עניין. 7,8,9,10,11 להיטים משוער יכולים להיות מזוהים בתחילה באמצעות שילוב של אלגוריתמים לזיהוי שיא, ניבוי המבוסס על נוסחה כימי מסה מדויקת, תחזית פיצול, ו חיפוש כימי מסד הנתונים. גישה זו מאפשרת לתעדוף של מטרות לזמן רב הזדהות מבנית מלאה או לפיתוח של דילול איזוטופ יציב יותר רגיש ויותר ספציפי תגובת UPLC / הנבחר או מרובה ניטור / MS מחקרים שהשיטות הסטנדרטיות הנוכחיות הזהב לכימות. 12
הטבע שונה של דגימות ביולוגיות הוביל לאופטימיזציה של פרוטוקולי חילוץ לשתן 13, 14 תאים, סרום 15, 16 או רקמה. זה פרוטוקול תכונות עקירות לתאים, סרום, ורקמות. במקרה צורך, הערות והפניות נוספות כבר כלולות עבור modifications של ההליך כדי לטפל בהכללתו של איזוטופים יציבים, או להכללה של מטבוליטים לא יציבים במיוחד.
Protocol
Representative Results
Discussion
לא ממוקד metabolomics מציע כלי רב עוצמה לחקירת biotransformations אנדוגניים או xenobiotic, או לכידת פרופיל מטבולי ממדגם של ריבית. הפלט של המאזניים הטכניקה עם הרזולוציה והרגישות של הטכנולוגיה המשמשת להפריד ולנתח את הדגימה, את היכולת להתמודד עם מערכי נתונים הגדולים שנוצרו, ואת היכולת שלי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מכירים תמיכה של NIH מענקי P30ES013508 ו5T32GM008076. אנו מודים גם תרמו מדעיים לגישה לנפה 2.0 ובני זוג. יוג'ין Ciccimaro ומארק סנדרס של תרמית מדעית לדיונים מועילים.
Materials
| Reagent | |||
| Phosphate Buffered Saline | Mediatech | 21-031-CM | |
| Water (H2O) | Fisher Scientific | W7-4 | (optima) |
| Acetonitrile (CH3CN) | Fisher Scientific | A996-4 | (optima) |
| Methanol (CH3OH) | Fisher Scientific | A454-4 | (optima) |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A464-4 | (optima) |
| Chloroform (CH3Cl) | Sigma-Aldrich | 366927 | Hazard |
| Dichloromethane (CH2Cl2) | Acros Organics | 61030-1000 | To replace chloroform |
| Diethyl Ether | Sigma-Aldrich | 346136 | To replace chloroform |
| Formic Acid (FA) | Fisher Scientific | (optima) | |
| NH4OH | Fisher Scientific | A470-250 | (optima) |
| Ammonium formate (HCOONH4) | Sigma-Aldrich | 78314 | |
| MicroSpin C18 Columns | Nest Group Inc | SS18V | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| 10 ml Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 73785-10 | |
| 10 ml Plastic Centrifuge Tubes | CellTreat | CLS-4301-015 | |
| LC Vials (glass) | Waters | 60000751CV | |
| LC Inserts (glass) | Waters | WAT094171 | |
| LC Vials (plastic) | Waters | 186002640 | |
| 0.22 μm Filters | Corning | 8169 | nylon |
| 2 ml Eppendorf Tubes | BioExpress | C-3229-1 | Low Retention |
| Equipment | |||
| High Resolution Mass Spectrometer | Thermo Scientific | LTQ XL-Orbitrap | |
| HPLC/UPLC | Waters | nanoACQUITY UPLC | |
| Source | Michrom | Thermo Advance Source | |
| Differential Analysis Software | Thermo Scientific | SIEVE 2.0 | |
| nanoACQUITY C18 BEH130 | Waters | 186003546 | 1.7 μm particle size, 150 mm x 100 μm |
| Acentis Express C8 | Sigma-Aldrich | 54262 | 2.7 μm particle size, 15 cm x 200 μm |
References
- Pluskal, T., Nakamura, T., Villar-Briones, A., Yanagida, M. Metabolic profiling of the fission yeast S. pombe: quantification of compounds under different temperatures and genetic perturbation. Mol. Biosyst. 6 (1), 182-198 (2010).
- Makarov, A., Denisov, E., et al. Performance Evaluation of a Hybrid Linear Ion Trap/Orbitrap Mass Spectrometer. Analytical Chemistry. 78 (7), 2113-2120 (2006).
- Timischl, B., Dettmer, K., Kaspar, H., Thieme, M., Oefner, P. J. Development of a quantitative, validated capillary electrophoresis-time of flight-mass spectrometry method with integrated high-confidence analyte identification for metabolomics. Electrophoresis. 29 (10), 2203-2214 (2008).
- Katajamaa, M., Oresic, M. Data processing for mass spectrometry-based metabolomics. J. Chromatogr. A. 1158 (1-2), 318-328 (2007).
- Katajamaa, M., Oresic, M. Processing methods for differential analysis of LC/MS profile data. BMC Bioinformatics. 6, 179 (2005).
- Wilson, I. D., Nicholson, J. K., et al. High resolution ultra performance liquid chromatography coupled to q-TOF mass spectrometry as a tool for differential metabolic pathway profiling in functional genomic studies. Journal of Proteome Research. 4 (2), 591-598 (2005).
- Benton, H. P., Wong, D. M., Trauger, S. A., Siuzdak, G. XCMS2: processing tandem mass spectrometry data for metabolite identification and structural characterization. Anal. Chem. 80 (16), 6382-6389 (2008).
- Katajamaa, M., Miettinen, J., Oresic, M. MZmine: toolbox for processing and visualization of mass spectrometry based molecular profile data. Bioinformatics. 22 (5), 634-636 (2006).
- Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Oresic, M. MZmine 2: Modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11 (1), 395 (2010).
- Smith, C. A., Want, E. J., O’Maille, G., Abagyan, R., Siuzdak, G. XCMS: Processing Mass Spectrometry Data for Metabolite Profiling Using Nonlinear Peak Alignment, Matching, and Identification. Analytical Chemistry. 78 (3), 779-787 (2006).
- Tautenhahn, R., Patti, G. J., Rinehart, D., Siuzdak, G. XCMS Online: A Web-Based Platform to Process Untargeted Metabolomic Data. Analytical Chemistry. 84 (11), 5035-5039 (2012).
- Gelhaus, S. L., Mesaros, A. C., Blair, I. A. Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (57), e3399 (2011).
- Want, E. J., Wilson, I. D., et al. Global metabolic profiling procedures for urine using UPLCGÇôMS. Nature Protocols. 5 (6), 1005-1018 (2010).
- Sellick, C. A., Hansen, R., Stephens, G. M., Goodacre, R., Dickson, A. J. Metabolite extraction from suspension-cultured mammalian cells for global metabolite profiling. Nature Protocols. 6 (8), 1241-1249 (2011).
- Dunn, W. B., Broadhurst, D., et al. Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nature protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).
- Masson, P., Alves, A. C., Ebbels, T. M. D., Nicholson, J. K., Want, E. J. Optimization and evaluation of metabolite extraction protocols for untargeted metabolic profiling of liver samples by UPLC-MS. Analytical Chemistry. 82 (18), 7779-7786 (2010).
- Shaham, O., Slate, N. G., et al. A plasma signature of human mitochondrial disease revealed through metabolic profiling of spent media from cultured muscle cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (4), 1571-1575 (2010).
- Cequier-Saünchez, E., Rodriüguez, C., Ravelo, A. G., Zaürate, R. Dichloromethane as a Solvent for Lipid Extraction and Assessment of Lipid Classes and Fatty Acids from Samples of Different Natures. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (12), 4297-4303 (2008).
- Keller, A., Eng, J., Zhang, N., Li, X. J., Aebersold, R. A uniform proteomics MS/MS analysis platform utilizing open XML file formats. Mol. Syst. Biol. 1, (2005).
- Cleveland, W. S., Devlin, S. J. Locally weighted regression – an approach to regression-analysis by local fitting. J. Am. Stat. Assoc. 83 (403), 596-610 (1988).
- Lange, E., Tautenhahn, R., Neumann, S., Gropl, C. Critical assessment of alignment procedures for LC-MS proteomics and metabolomics measurements. BMC Bioinformatics. 9 (1), 375 (2008).
- Tautenhahn, R., Bottcher, C., Neumann, S. Highly sensitive feature detection for high resolution LC/MS. BMC Bioinformatics. 9 (1), 504 (2008).
- Kuhl, C., Tautenhahn, R., Bottcher, C., Larson, T. R., Neumann, S. CAMERA: An Integrated Strategy for Compound Spectra Extraction and Annotation of Liquid Chromatography/Mass Spectrometry Data Sets. Analytical Chemistry. 84 (1), 283-289 (2012).
- Kanehisa, M., Goto, S. KEGG: kyoto encyclopedia of genes and genomes. Nucleic Acids Res. 28 (1), 27-30 (2000).
- Smith, C. A., O’Maille, G., et al. METLIN: a metabolite mass spectral database. Ther. Drug Monit. 27 (6), 747-751 (2005).
- Wang, Y., Xiao, J., Suzek, T. O., Zhang, J., Wang, J., Bryant, S. H. PubChem: a public information system for analyzing bioactivities of small molecules. Nucleic Acids Res. 37 Web Server, W623-W633 (2009).
- Wishart, D. S., Knox, C., et al. HMDB: a knowledgebase for the human metabolome. Nucleic Acids Res. 37 Database, D603-D610 (2009).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
- Folch, J. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. J. Biol. Chem. 226, 497-509 (1957).
- Avery, M. J. Quantitative characterization of differential ion suppression on liquid chromatography/atmospheric pressure ionization mass spectrometric bioanalytical methods. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 17 (3), 197-201 (2003).
