Послушный млекопитающих инфекции сотовый с Протозойные грунтовка бактерии

Многие патогенные бактерии приспособились обобщенных стратегий для использования клеток-хозяев для выживания и репликации внутриклеточных отсеке. Во многих случаях, патогенетические механизмы аналогичны между простейшими и многоклеточными клеток. Однако, эти два микросреды очень разные и могут привести к дифференциальной экспрессии факторов вирулентности ^1-4. Болезнь легионеров бактерия Legionella легионелл является повсеместно, связанных с пресноводной среде по всему миру ^5. Важно отметить, что L. легионелл выращивают в простейших клеток до заражения человеческих моноцитов получить патогенных преимущество, предполагая, что глобальные профили экспрессии генов бактерии выхода клетки простейших отличаются, чем в пробирке выращивают ^6-8 организма. В природе, пресноводных амеб обеспечивают богатые питательными веществами пределы для быстрого усиления вторжения бактерий. Человека приобретении L. pneumophила наиболее часто связывают с вдыханием загрязненного капель воды, которые содержат бактерии. Вполне вероятно, что эти капли гавани простейших клеточно-ассоциированных бактерий, простейших, где клетки более устойчивы к обычной воды практик ^9,10. Инфекция легких альвеолярные макрофаги доходы таким образом, практически идентична внутриклеточной жизненный цикл бактерий в простейших клеток-хозяев ^11-13.

Для того чтобы выжить и размножаться в клетках эукариот, L. легионелл использует специализированный тип секреции IVb система называется Dot / ICM, чтобы доставить почти 300 «эффекторные» белков в цитоплазме клетки-хозяина ^14-16. Эти эффекторные белки коллективно работать, чтобы разрушить клеточные процессы в целях получения разрешительной репликации отсек для бактерий ^17,18. Удаления в любом из 26 генов, которые составляют Dot / ICM транспортера приводит к дефектных штаммов для внутриклеточных мультiplication ^19-23. Исторически сложилось, что удаление отдельных эффекторных генов, кодирующих редко в результате ослабленного штамма для внутриклеточного роста. Это явление было приписано несколько гипотез, в том числе избыточных функций и паралогичных копии эффекторов.

Некоторые факторы вирулентности, только выраженная в контексте клетки-хозяина связанного внутриклеточного роста ^24. Мы рационализировать, что если тот или иной эффекторных только выражается в контексте инфекции простейших, то вклад эффекторных не может быть по сравнению с штамма дикого типа, когда оба культивировали в пробирке. L. легионелл переходы от репликативной к пропускающий фазе, поскольку это входит стационарная фаза в культуре ^25. Фенотип фазы переключения представляет истощение питательных веществ, возникших в ходе внутриклеточного роста и является примером по сборке жгутиков для подвижности ^26. Поскольку L. легионелл более инваSIVE и опасной, когда собирают из простейших клеток, мы стремились разработать тест, который более точно представляют патогенные состояния бактерию, когда он встречается множество макрофагов.

С этой целью мы разработали универсальный тест грунтовки простейших, которые могут вместить любой подходящей принимающей как для первого (заливка ячейки) и второй (клетки-мишени) инфекции этапе. Инфекционный процесс является послушным за счет использования бактерий, стабильно экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок (GFP). Инфекции модели для простейших Acanthamoeba castellanii следует методология широко используется в области ^27. Для грунтования шаг, Л. легионелл штаммы выращиваются в пробирке в стационарной фазы в жидкую среду, чтобы произвести как 'пропускающего »бактерии (рис. 1А). Бактерии следующий использовали для инфицирования монослоев A. castellanii в течение 18 часов для достижения поздней стадии внутриклеточного жизненного цикла. Большие вакуоли содержатния бактерий могут быть визуализированы в этот момент времени с помощью флуоресцентной микроскопии (рис. 1А). Протозойные Затем клетки лизируются и бактерии извлекают из лизатов измеряется выбросов при 512 нм с использованием флуоресценции ридере. Флуоресценции коррелирует с оптической плотности для расчета кратности-оф-инфекции (MOI) для заражения клетки-мишени (рис. 1, * Корреляция кривой). После вторжения (T ₀₎ и 18 ч после вторжения (T _18), клетки-мишени количественно для флуоресценции, представляющих внутриклеточных бактерий. Флуоресценции можно контролировать с помощью микроскопии и проточной цитометрии и жизнеспособных микроорганизмов может быть измерена через колонию покрытия. Грунтовка анализ всегда сопровождается инфекции дикого типа L. легионелл и деформации дефекты Dot / ICM Тип IV секреторной системы (Δ DotA) (рис. 1А). Это важно обеспечивает внутренний контроль за прямое сравнение между дикого типаой любом изогенных мутантные штаммы, используемые в процессе заражения. Включение авирулентным Δ DotA напряжение во время заливки этапа устанавливает порог для наблюдения ослабленный рост фенотипы, связанные с изогенных мутантные штаммы, которые культивируются в лабораторных условиях.