Tratáveis ​​mamíferos Infecções celulares com Protozoário-condicionadas Bactérias

Numerosos agentes patogénicos bacterianos adaptaram estratégias generalizadas de explorar as células hospedeiras para a sua sobrevivência e replicação num compartimento intracelular. Em muitos casos, os mecanismos patogénicos são semelhantes entre protozoários e metazoários células. No entanto, estes dois microambientes são muito diferentes e podem resultar em expressão diferencial de factores de virulência ^1-4. A doença dos legionários bactéria Legionella pneumophila é onipresente associada com ambientes de água doce em todo o mundo ^5. Importante, L. pneumophila cultivado em células de protozoários antes da infecção dos monócitos humanos ganhar uma vantagem patogénicas, o que sugere que os perfis de expressão gênica global da bactéria que sai de uma célula de protozoários são diferentes do que a do organismo cultivado in vitro em ^6-8. Na natureza, a água doce amebas fornecer nutrientes limita ricos para amplificação rápida de uma bactéria invasora. Aquisição humana de L. pneumophila é o mais frequentemente atribuída a inalação de gotículas de água contaminada que contém a bactéria. É provável que essas gotículas porto protozoários associados a células de bactérias, células de protozoários, onde são mais resistentes a práticas convencionais de tratamento de água ^9,10. Infecção de macrófagos alveolares do pulmão procede de uma maneira praticamente idêntica à do ciclo de vida da bactéria intracelular em células hospedeiras de protozoários ^11-13.

A fim de sobreviver e de se replicar em células eucariotas, L. pneumophila utiliza um tipo especializado sistema de secreção IVb denominado Dot / Icm para entregar cerca de 300 '"proteínas efectoras para o citosol da célula hospedeira ^14-16. Estas proteínas efectoras funcionar colectivamente subverter processos celulares, a fim de gerar um compartimento de replicação para a bactéria permissiva ^17,18. Deleções em qualquer um dos 26 genes que compreendem o resultado transportador Dot / Icm de estirpes defeituosas de mult intracelulariplication ^19-23. Historicamente, a deleção de genes individuais que codificam efetores raramente resultou em estirpes atenuadas para o crescimento intracelular. Esse fenômeno tem sido atribuída a várias hipóteses, incluindo função redundante e cópias parálogas de efetores.

Alguns factores de virulência são apenas expressas no contexto do hospedeiro associada a células de crescimento intracelular ^24. Nós racionalizado que se um efector específico foi expresso apenas no contexto da infecção por protozoários, em seguida, a contribuição do efector não pode ser comparada com uma estirpe de tipo selvagem, quando ambos foram cultivadas in vitro. L. pneumophila transições de um replicativa a uma fase transmissivo enquanto entra na fase estacionária da cultura ^25. O fenótipo de comutação fase representa o esgotamento de nutrientes encontrados durante crescimento intracelular e é exemplificada através de montagem de flagelos para a motilidade ^26. Porque L. pneumophila é mais invasive e virulenta quando colhido a partir de células de protozoários, buscou-se desenvolver um ensaio que mais fielmente representado o estado patogênico da bactéria quando encontrou macrófagos de acolhimento.

Para este fim, foi desenvolvido um ensaio de escorvamento versátil protozoário que pode acomodar qualquer hospedeiro adequado para ambos os primeiros (cell priming) e segunda (infecções de células alvo) de palco. O processo de infecção é tratável através da utilização de bactérias que expressam de forma estável a proteína fluorescente verde (GFP). O modelo de infecção pelo protozoário Acanthamoeba castellanii segue uma metodologia amplamente utilizado no campo ^27. Para o passo de activação, L. estirpes pneumophila são cultivados in vitro até à fase estacionária em meios líquidos para produzir rotulados 'transmissivos "bactérias (Figura 1A). As bactérias são depois utilizadas para infectar monocamadas de A. castellanii durante 18 horas para atingir uma fase tardia do ciclo de vida intracelular. Grandes vacúolos contêmbactérias ção pode ser visualizada nesta altura utilizando a microscopia de fluorescência (Figura 1A). As células são então lisadas por protozoários e bactérias recuperadas a partir do lisado são medidos para a emissão a 512 nm utilizando um leitor de placas de fluorescência. A fluorescência é proporcional à densidade óptica para calcular multiplicidade de infecção (MOI) durante a infecção das células alvo (figura 1, * Curva de correlação). Após invasão (T ₀₎ e 18 horas pós-invasão (T _18), as células alvo são quantificadas por fluorescência, que representa as bactérias intracelulares. A fluorescência pode ser monitorizada por microscopia e citometria de fluxo, e a contagem de viáveis ​​pode ser medido através de plaqueamento de colónias. O ensaio de priming é sempre acompanhada por infecções de tipo selvagem L. pneumophila e de uma estirpe deficiente em Dot / Icm sistema de secreção de tipo IV (Δ DOTA) (Figura 1A). Este importante fornece controles internos para comparações diretas entre um tipo selvagemnd quaisquer estirpes isogénicas mutantes utilizados no processo de infecção. A inclusão da estirpe avirulenta DOTA Δ durante a fase de escorvamento estabelece um limiar para a observação de fenótipos de crescimento atenuado associados isogénicas estirpes mutantes que são cultivadas in vitro.